Vi klonar och analyserar reportergener som genererar cirkulära RNAs. Dessa reporter gener är större än konstruktioner för att analysera linjär splitsning och innehåller Alu element. För att undersöka de cirkulära RNA transfecteds konstruktionerna till celler och resulterande RNA analyseras med RT-PCR efter borttagning av linjärRNA.
Förutom linjära mRNAs genererar många eukaryota gener cirkulära RNA. De flesta cirkulära RNAs genereras genom att gå med i en 5 ‘skarv plats med en uppströms 3 ‘ skarv plats inom en pre-mRNA, en process som kallas back-split. Denna cirkulärisering är sannolikt med hjälp av sekundära strukturer i pre-mRNA som föra skarv platser i närheten. I mänskliga gener, Alu element tros främja dessa sekundära RNA strukturer, som Alu element är rikliga och uppvisar bas komplementarities med varandra när de finns i motsatta riktningar i pre-mRNA. Här beskriver vi generering och analys av stora, Alu-element som innehåller reportergener som bildar cirkulära RNAs. Genom optimering av kloningsprotokoll kan reportergener med upp till 20 kb skärlängd genereras. Deras analys i samtransfection experiment gör det möjligt att identifiera regleringsfaktorer. Således kan denna metod identifiera RNA-sekvenser och cellulära komponenter som deltar i cirkulär RNA-bildning.
Cirkulära RNAs
Cirkulära RNAs (circRNAs) är kovalent slutna enda strandsatta RNAs som uttrycks i de flesta organismer. De genereras genom att gå med i en nedströms 5’s skarv plats till en uppströms 3 ‘skarv plats, en process som kallas back-split(figur 1A)1. Sekvenser i pre-mRNA som uppvisar bas kompletterande så kort som 30-40 nt föra back-skarv platser i korrekt anpassning för circRNA formation2. Hos människor bildar Alu element1, som representerar cirka 11% av genomet3, omfattande dubbla strandsatta RNA strukturer i pre-mRNA på grund av deras självkomplementaritet4,5 och därmed främja bildandet av circRNAs1.
För närvarande har tre viktiga funktioner circRNAs beskrivits. Vissa circRNAs binder microRNAs (miRNAs) och genom kvarstad agera som miRNA svampar6. CircRNAs har varit inblandad i transkriptions- och posttranskriptionsreglering, genom konkurrens med linjär splitsning7 eller modulering av transkriptionsfaktoraktivitet8. Slutligen innehåller circRNAs korta öppna läsramar och bevis på principstudier visar att de kan översättas9,10. Funktionen hos de flesta circRNAs förblir dock gåtfull. Majoriteten av cirkulära RNA har upptäckts med hjälp av nästa generations sekvenseringsmetoder11. Detaljerade analyser av enskilda gener med hjälp av riktade RT-PCR-metoder visar att ett stort antal cirkulära RNAs återstår att upptäcka12.
Användning av reportergener för att analysera pre-mRNA-bearbetning
Analysen av mRNA som härrör från DNA-reporter konstruerar transfected i celler är en väletablerad metod för att studera alternativa pre-mRNA splitsning, som kan tillämpas på cirkulära RNAs. I allmänhet förstärks och klonas den alternativa exonen, dess omgivande introner och konstituerande exons och klonas till en eukaryota uttrycksvektor. Ofta förkortas intronerna. Konstruktionerna är transfected i eukaryota celler och vanligtvis analyseras av RT-PCR13,14. Detta tillvägagångssätt har använts i stor utsträckning för att kartlägga reglerande skarvplatser och transverkande faktorer i samtransfection experiment13,15,16,17,18. Dessutom gjorde genereringen av proteinuttryckande minigener det möjligt att undersöka ämnen som ändrar alternativa skarvningar 19,20.
Metoden har tillämpats på cirkulära RNA. För närvarande har minst 12 minigena ryggrader beskrivits i litteraturen och sammanfattas i tabell 1. Med undantag för det tRNA-baserade uttryckssystemet21,22, är de alla beroende av polymeras II-initiativtagare. Här beskriver vi en metod för att generera mänskliga reporter minigener för att bestämma cis och transverkande faktorer som är involverade i genereringen av cirkulära RNA. En översikt över metoden med hjälp av sekvenser av en publicerad reporter gen23 visas i figur 1.
I allmänhet cirkulära RNAs är låga rikliga1, vilket komplicerar studiet av deras funktion och bildning. I likhet med linjära RNAs13, användningen av reporter minigenes tillåter identifiering av cis och transverkande faktorer som reglerar bildandet av cirkulära RNA. Således genererar detta tillvägagångssätt hypoteser som kan testas ytterligare med hjälp av endogena gener.
Det mest kritiska steget är utformningen av reportergenen. Den…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Försvarsdepartementet DoD bidrag AZ180075. Stefan Stamm tackar Jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin stöddes av DAAD, tyska akademiska utbytesprogram, Justin R. Welden var mottagare av University of Kentucky Max Steckler Award.
(PEI) Hydrochloride | Polysciences | 24765-1 | |
Builder tool | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
Dark Reader Transilluminator. | Clare Chemical Research | ||
Enzymatic DNA assembly kit | NEB | E2621S | |
Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9282 | |
Glyco Blue | Thermo Fisher | AM9516 | |
pcDNA3.1 cloning site | Polycloning site | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf | |
Polymerase 1 | NEB | M0491L | Q5 DNA polymerase |
Polymerase 2 | Biorad | 1725310 | Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad) |
Polymerase 2 | Qiagen | 206402 | Qiagen long range polymerase kit |
Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18080044 | |
RNA isolation kit | Life Technologies | 12183025 | Ambion by Life Technologies |
RNAse R | Lucigen | RNR07250 | Epicenter/Lucigen |
Stable competent cells | NEB | C3040H | NEB stable cells |
Standard cloning bacteria | NEB | C2988J | NEB5-alpha competent |
Web tool to design primers | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
Web-based temperature calculations | NEB | https://tmcalculator.neb.com/#!/main |