Summary
El artículo describe un protocolo rápido para etiquetar los vasos sanguíneos en un pez teleósteo por perfusión cardíaca de DII diluido en fijador, usando medaka (Oryzias latipes) como modelo y centrándose en el cerebro y el tejido pituitario.
Abstract
Los vasos sanguíneos inervan todos los tejidos en los vertebrados, lo que permite su supervivencia proporcionando los nutrientes necesarios, oxígeno, y las señales hormonales. Es uno de los primeros órganos que empiezan a funcionar durante el desarrollo. Los mecanismos de formación de los vasos sanguíneos se han convertido en un tema de alto interés científico y clínico. En los adultos sin embargo, es difícil visualizar la vasculatura en la mayoría de los animales vivos debido a su localización profunda dentro de otros tejidos. Sin embargo, la visualización de los vasos sanguíneos sigue siendo importante para varios estudios como Endocrinología y Neurobiología. Mientras que varias líneas transgénicas se han desarrollado en el pez cebra, con los vasos sanguíneos directamente visualizados a través de la expresión de proteínas fluorescentes, no existen tales herramientas para otras especies teleósteo. Usando medaka (Oryzias latipes) como modelo, el protocolo actual presenta una técnica rápida y directa para etiquetar los vasos sanguíneos en el cerebro y la hipófisis mediante el perfundiendo a través del corazón con fijador que contiene DII. Este protocolo permite mejorar nuestro entendimiento sobre cómo las células cerebrales y pituitarias interactúan con la vasculatura sanguínea en tejidos enteros o rebanadas gruesas de tejido.
Introduction
Los vasos sanguíneos desempeñan una parte esencial del cuerpo vertebrado, ya que proporcionan los nutrientes necesarios, el oxígeno y las señales hormonales a todos los órganos. También, desde el descubrimiento de su participación en el desarrollo del cáncer1, han recibido mucha atención en la investigación clínica. Aunque una serie de publicaciones han investigado los mecanismos que permiten el crecimiento de los vasos sanguíneos y la morfogénesis, y un gran número de genes importantes para su formación se han identificado2, queda mucho por entender en cuanto a la interacción entre las células o los tejidos y la sangre circulante.
La visualización de la vasculatura sanguínea en el cerebro y la hipófisis es importante. Las neuronas en el cerebro requieren un alto suministro de oxígeno y glucosa3, y la hipófisis contiene hasta ocho importantes tipos de células productoras de hormonas que utilizan el flujo sanguíneo para recibir la señal del cerebro y enviar sus respectivas hormonales a diferentes órganos periféricos4,5. Mientras que en los mamíferos, el sistema del portal en la base del hipotálamo llamado la eminencia mediana, une el cerebro y la hipófisis6, tal un puente sanguíneo claro no se ha descrito en el pez teleósteo. De hecho, en teleosts, neuronas preoptico-hipotalámica proyectar directamente sus axones en el pars nerviosa de la hipófisis7 y en su mayoría inervate los diferentes tipos de células endocrinas directamente8,9. Sin embargo, algunas de estas neuronas tienen sus terminaciones nerviosas ubicadas en el espacio extravascular, cerca de los capilares sanguíneos10. Por lo tanto, la diferencia entre el pez teleósteo y los mamíferos no es tan clara, y la relación entre la vasculatura sanguínea y el cerebro y las células pituitarias requiere una mayor investigación en los peces teleósteo.
El pez cebra tiene, en muchos aspectos, un sistema vascular anatómico y funcionalmente comparable a otras especies de vertebrados11. Se ha convertido en un poderoso modelo de vertebrados para la investigación cardiovascular principalmente gracias al desarrollo de varias líneas transgénicas donde los componentes del sistema vascular están etiquetados con proteínas reporteras fluorescentes12. Sin embargo, la anatomía exacta del sistema circulatorio puede variar entre especies, o incluso entre dos individuos pertenecientes a la misma especie. Por lo tanto, la visualización de los vasos sanguíneos puede ser de gran interés también en otras especies teleósteo para las cuales no existen herramientas de transgénesis.
Se han descrito varias técnicas para etiquetar los vasos sanguíneos tanto en mamíferos como en teleostos. Estos incluyen la hibridación in situ para genes específicos de la vasculatura, la tinción de fosfatasas alcalinas, la microangiografía y las inyecciones de tinte (para una revisión ver13). Colorante indocarbocianine catiónico fluorescente lipofílico (DII) primero se utilizó para estudiar la movilidad lateral de lípidos de membrana, ya que se retiene en las bicapas de lípidos y puede migrar a través de él14,15,16. De hecho, una molécula de DiI se compone de dos cadenas de hidrocarburos y cromos. Mientras que las cadenas de hidrocarburos se integran en la membrana de la célula bicapa lipídica de las células en contacto con ella, los cromos permanecen en su superficie17. Una vez en la membrana, las moléculas DiI se difunden lateralmente dentro de la bicapa lipídica que ayuda a manchar las estructuras de la membrana que no están en contacto directo con la solución DiI. Inyectar una solución DiI a través de la perfusión cardíaca, por lo tanto etiquetará todas las células endoteliales en contacto con el compuesto permitiendo el etiquetado directo de los vasos sanguíneos. Hoy DiI también se utiliza para otros fines de tinción, como la imagen de una sola molécula, mapeo del destino, y rastreo neuronal. Curiosamente, existen varios fluoróforos (con diferentes longitudes de onda de emisión) permitiendo la combinación con otras etiquetas fluorescentes, y la incorporación, así como la difusión lateral de DiI puede ocurrir en los tejidos vivos y fijos18, 19.
El formaldehído, descubierto por Ferdinand Blum en 1893, se ha utilizado ampliamente hasta el día de hoy como el producto químico preferido para la fijación del tejido20,21. Muestra una amplia especificidad para la mayoría de los objetivos celulares y preserva la estructura celular22,23. También preserva las propiedades fluorescentes de la mayoría de los fluoróforos, y por lo tanto se puede utilizar para fijar animales transgénicos para los cuales las células dirigidas expresan proteínas reporteras fluorescentes.
En este manuscrito, un protocolo anterior desarrollado para etiquetar los vasos sanguíneos en pequeños modelos experimentales de mamíferos24 se ha adaptado al uso en peces. Todo el procedimiento tarda solo un par de horas en realizarse. Se demuestra cómo perfumar una solución fijadora de formaldehído que contiene DiI en el corazón de pescado con el fin de etiquetar directamente todos los vasos sanguíneos en el cerebro y la hipófisis de la medaka modelo de pescado. Medaka es un pequeño pez de agua dulce originario de Asia, que se encuentra principalmente en Japón. Es un organismo modelo de investigación con un conjunto de herramientas moleculares y genéticas disponibles25. Por lo tanto, la identificación de los vasos sanguíneos en esta especie, así como en otros permitirá mejorar nuestra comprensión sobre cómo el cerebro y las células pituitarias interactúan con la vasculatura sanguínea en tejido entero o rebanadas de tejido grueso.
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Protocol
Todo el manejo de los animales se realizó de acuerdo con las recomendaciones para el cuidado y el bienestar de los animales de investigación en la Universidad Noruega de Ciencias de la vida, y bajo la supervisión de los investigadores autorizados.
1. preparación de instrumentos y soluciones
- Preparar la solución de acción DiI disolver 5 mg de cristal DiI en 1,5 mL tubo de plástico con 1 mL de 96% EtOH. Vórtice durante 30 s y manténgase cubierto con papel de aluminio.
Nota: La solución de la acción DiI se puede conservar en la oscuridad a-20 ° c durante varios meses. - Preparar el soporte para peces (figura 1a) cortando un trozo de poliestireno a 5 cm de longitud, 3 cm de ancho, y 2 cm de espesor, y encolado a un plato de plástico de 9 cm de diámetro. Hacer un agujero en forma de bote de 3 cm con una hoja de bisturí en el poliestireno.
- Prepare el sistema de perfundiendo (figura 2) añadiendo una cánula de plástico de 30-50 cm de largo en el extremo de la aguja.
- Preparar 40 mL de solución fresca de paraformaldehído al 4% (PFA) diluyendo 10 mL de 16% de PFA con 30 mL de solución salina tampón de fosfato (PBS) en un tubo de plástico de 50 mL.
- Prepare 10 mL de solución Fixative/DiI diluyendo 1 mL de la solución de acción DiI en 9 mL de PFA recién preparada al 4% en un tubo de plástico de 10 mL. Mantener en la oscuridad hasta su uso.
Nota: Los cristales DiI que no se disuelven se pueden mantener en el tubo de solución de stock, y se puede añadir nuevo etanol para preparar nueva solución de la acción DiI (ver paso 1,1). -
Preparar 50 mL de acción de tricaína (MS-222).
- Disolver 200 mg de Tricaine en polvo en 48 mL de H2O. Añadir 2 ml de la base de Tris de 1 M (pH 9). Ajustar a pH 7 con 1 M HCl y almacenar a-20 ° c.
- Diluir 5 mL de la culata de Tricaine en 50 mL de agua limpia en un vaso pequeño.
- Prepare varias pipetas de vidrio de 5 cm (figura 2) estirando un capilar de vidrio con un extractor de piletas siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. disección y perfusión
Nota: La PFA es un compuesto tóxico volátil, por lo tanto, la disección y la perfusión se deben realizar en una campana o en una habitación ventilada, y el usuario debe llevar una máscara de gas.
- Prepare las herramientas de disección incluyendo tijeras pequeñas, y un fórceps afilado y uno fuerte antes de la disección.
- Llene la jeringa con la solución preparada de PFA/DiI colocándola en el tubo de 50 mL y dibujando. A continuación, coloque la aguja con la cánula en el extremo de la jeringa (figura 2).
- Fije la jeringa al Banco utilizando varios trozos de cinta colocados en diferentes direcciones, ajuste la posición del microscopio y el asiento para obtener una buena posición para la disección y para presionar el pistón de la jeringa (figura 1B).
Nota: En este protocolo, el codo se utiliza para presionar hacia abajo el pistón de la jeringa, pero se pueden utilizar otras opciones de posibilidades, por ejemplo, la asistencia de otra persona. - Eutanasia al pez con una sobredosis de tricaína colocando el pez en la solución preparada en el paso 1,7. Espere 30 s y pruebe los reflejos del pez agarrando su aleta caudal con el fórceps. El pez se puede utilizar cuando ha dejado de responder a los estímulos.
- Coloque el pez en el sostenedor del pez con su abdomen hacia arriba y PIN una aguja en la extremidad de la cabeza y otra encima de la cola para mantener el pescado en su lugar.
- Abra el abdomen anterior con las tijeras cortando horizontalmente la capa superficial de la piel.
- Con fórceps, retire la piel por encima del corazón hasta que se provea un acceso claro al ventrículo y al bulbo arterioso (figura 3).
- Añadir una Piera de vidrio en la extremidad del capilar y romper el extremo de la punta de la Piera de vidrio.
Nota: El orificio de la punta rota debe ser lo suficientemente grande como para dejar salir el líquido, pero todavía lo suficientemente pequeño para entrar fácilmente en el tejido. La Piera de vidrio se puede reutilizar si no está rota o obstruida. - Acerque la Piela de vidrio al ventrículo y agregue presión al pistón de la jeringa con el codo para forzar la salida del líquido.
- Fijar el ventrículo cardíaco con la Piera de vidrio y añadir presión a la jeringa.
- Directamente después, perforar el seno venoso con fórceps para permitir que la sangre deje la circulación.
Nota: El ventrículo cardíaco se vuelve más frágil debido al fijador. También se vuelve menos rojo como la sangre se diluye con la solución Fixative/DiI. - Desde el ventrículo, ajuste el ángulo de la Piera de vidrio para encontrar la entrada del el bulbo arterioso. Traiga la Piera que se abre dentro del bulbo arterioso como se muestra en la figura 2, y agregue más presión a la jeringa.
Nota: El bulbo arterioso es transparente y el tejido es elástico. Al reemplazar la sangre con DiI/fijador, la Piera de vidrio dentro del corazón debe ser más visible y añadiendo presión, el tamaño del bulbo arterioso debe expandirse. Este paso es crucial para asegurarse de que se ha utilizado suficiente presión para reemplazar toda la sangre con la solución Fixative/DiI, y que todos los vasos sanguíneos se han alcanzado. A menudo, cuando se tiene éxito, el PFA provoca contracciones musculares y el pez se va a mover. - Continúe añadiendo presión sobre la jeringa durante 30-60 s aún manteniendo la Piera de vidrio en el interior del el bulbo arterioso.
- Retire la de vidrio y las agujas del pescado.
- Diseccionar el cerebro y la hipófisis, e incubar los tejidos en fresco 4% PFA en PBS para 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente.
Nota: La disección del cerebro y la hipófisis anteriormente se ha descrito en detalle de dos maneras diferentes por Fontaine et al.26 y Ager-Wick et al.27. Debido a la fijación, el tejido se vuelve bastante duro y el eslabón frágil entre el cerebro y la hipófisis puede romperse. Después de la disección, el procesamiento posterior a la fijación también se puede realizar durante la noche a 4 ° c. - Enjuague el tejido dos veces en PBS durante 10 minutos antes de prepararse para la toma de imágenes.
Nota: A continuación, se puede montar el tejido entre el deslizamiento y el resguardo de la cubierta con espaciadores entre el medio y el soporte de montaje para la imagen confocal (ver figura 4), o seccionado con un vibratomo como se describe detalladamente en Fontaine et al.26 antes de montar entre deslizamiento y tapa para la toma de imágenes con un microscopio Estereomicroscopio (ver figura 4).
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Representative Results
Este protocolo demuestra un procedimiento paso a paso para etiquetar los vasos sanguíneos en el cerebro de medaka y la hipófisis, y al mismo tiempo fijar el tejido. Después del etiquetado por inyección cardíaca de una solución fijadora que contiene DiI en el corazón, los vasos sanguíneos se pueden observar en rodajas usando un estereomicroscopio fluorescente (figura 4) o en tejido entero usando un microscopio confocal (figura 5). Ya sea en la rebanada de tejido grueso o en todo el tejido, la arquitectura de la vasculatura sanguínea se puede observar en tres dimensiones. Las rebanadas de tejido pueden etiquetarse para proteínas específicas de objetivo utilizando protocolos de inmunofluorescencia estándar después del final de la fijación, y en líneas transgénicas donde las células de interés expresan proteínas reporteras fluorescentes (figura 6). Esto permite realizar investigaciones sobre las interacciones entre los vasos sanguíneos y otros tipos específicos de células. Aquí, por ejemplo, el uso de una línea transgénica de medaka donde las células productoras de proteínas fluorescentes verdes (GFP) revelaron la ubicación de las células de la LH hipofisarias28. Uno puede observar que estas células envían extensiones hacia los vasos sanguíneos. Es posible que algunos vasos sanguíneos no estén etiquetados correctamente si la perfusión es subóptima. Este puede ser el caso, por ejemplo, si la solución se inyecta en el ventrículo cardíaco en lugar del bulbo arterioso, o si se utiliza presión demasiado baja y/o durante un período demasiado corto en el pistón de la jeringa (figura 7). Finalmente, al obtener imágenes del mismo tejido con los mismos parámetros de imagen, se demostró que la intensidad del etiquetado disminuyó después de cuatro días, con la señal más distribuida (figura 8).
Figura 1 : Imágenes de la placa de sujeción para la perfusión del pescado (A) y la configuración de la inyección (B). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Esquema del corazón de pez medaka y sistema de perfusión que se muestra con la ubicación del Idel de la aguja de vidrio en el corazón para una perfusión exitosa. La cabeza de la flecha muestra dónde perforar el corazón para permitir que la sangre deje la circulación. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Imagen del lado ventral del pez abierto, con el corazón expuesto para perfusión. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Imagen de la vasculatura sanguínea en una rebanada de tejido cerebral y pituitario de medaka. Un medaka adulto fue perfusionado con una solución fijadora que contiene DiI. El cerebro y la hipófisis se diseccionaron y corrigen durante la noche. Los tejidos se montaron en un 3% de agarosa y se seccionaron con un vibratomo antes de la toma de imágenes con un microscopio de fluorescencia. Todos los vasos sanguíneos etiquetados con DiI se observan a través de toda la sección que muestra la vasculatura en el cerebro y la hipófisis. OT = Tectum óptico; Tel = telencósido; Hip = hipotálamo; Pit = hipófisis; CB = cerebelo; Posterior = cerebro trasero. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : renderizado 3D de una pila z confocal de la vasculatura sanguínea en medaka pituitaria. Un medaka adulto fue perfusionado con una solución fijadora que contiene DiI. El cerebro-hipófisis se diseccionó y fijó durante la noche. La hipófisis fue diseccionada del cerebro y montada entre una diapositiva y un cubreobjetos con espaciadores IB entre, antes de la toma de imágenes con un microscopio confocal. Z-Stack fue grabado, y una representación 3D fue hecha usando el software de Fiji y el plugin 3D Viewer29. Toda la vasculatura sanguínea pituitaria podría observarse en 3D. RPD = rostral pars distalis; PPD = pars distalis proximal; PI = pars intermedia. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Proyección z de la pila z confocal a partir de una porción de tejido de medaka transgénica donde el promotor Lhβ controla la expresión de la proteína de la reportera fluorescente verde. Un adulto TG (LHB: hrgfpii) medaka fue perfundida con una solución fijadora que contiene DII. El cerebro-hipófisis se diseccionó y fijó durante la noche. Los tejidos se montaron en un 3% de agarosa y se seccionaron con un vibratome. Algunas células productoras de la hormona, células de LH en este caso, el envío de extensiones (cabezas de flecha) hacia los vasos sanguíneos se puede observar, probablemente para detectar señales de la sangre y/o liberar sus hormonas en la circulación. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Imagen de la vasculatura sanguínea en una rebanada de tejido cerebral y pituitario de medaka pobremente perfundida. Un medaka adulto fue pobremente perfundida con una solución fijadora que contiene DiI inyectando la solución sólo en el ventrículo. El cerebro-hipófisis se diseccionó y fijó durante la noche. Los tejidos se montaron en un 3% de agarosa y se seccionaron con un vibratomo antes de la toma de imágenes con un microscopio confocal. Los vasos sanguíneos estaban mal etiquetados con DiI y algunos de ellos no fueron etiquetados en absoluto. OT = Tectum óptico; Tel =, telencón; Hip = hipotálamo; Pit = hipófisis; CB = cerebelo; Posterior = cerebro trasero. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8 : Imágenes por lapso de tiempo de la vasculatura sanguínea etiquetada en la sección de tejido cerebral-hipofisario medaka. Un medaka adulto fue perfusionado con una solución fijadora que contiene DiI. El cerebro-hipófisis se diseccionó y fijó durante la noche. Los tejidos se montaron en un 3% de agarosa y se seccionaron con un vibratomo antes de la toma de imágenes con un estereomicroscopio directamente después del montaje (a), y 4 días después del montaje (B) con los mismos parámetros de imagen. Tenga en cuenta que el etiquetado ha disminuido y extendido con el tiempo. OT = Tectum óptico; Tel = telencósido; Hip = hipotálamo; Pit = hipófisis; CB = cerebelo; Posterior = cerebro trasero. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La perfusión cardíaca con DII previamente se ha utilizado para etiquetar los vasos sanguíneos en varias especies modelo24, incluyendo el pez teleósteo13.
Como DiI es entregado directamente a la membrana de la célula endotelial por perfusión en la vasculatura, es posible aumentar la relación señal-ruido mediante el aumento de la concentración de DiI en la solución fijadora. Además, el fluoróforo proporciona una coloración intensa cuando se excita con un blanqueo mínimo que permite una emisión relativamente duradera de18,30. Además, el etiquetado puede permanecer durante varios días y ser utilizado en combinación con otras técnicas de etiquetado que requieren tratamientos leves, como en immuofluorescencia (si)31.
Sin embargo, esta técnica tiene algunas limitaciones. Después de la eliminación de la solución fijadora, el etiquetado y la imagen de los tejidos deben realizarse lo más rápido posible porque la intensidad del etiquetado se debilitará y la señal se difundará con el tiempo (figura 8). Este proceso será aún más rápido cuando se utilicen detergentes que aumenten la porosidad de la membrana. Además, debido a que la PFA es un compuesto volátil tóxico, se deben tomar varias precauciones al realizar este experimento. Para minimizar los aspectos peligrosos de este protocolo, se puede perfulizar una solución de DiI y PBS antes de diseccionar el tejido de interés y fijarlo con la solución de PFA justo después de la perfusión. Sin embargo, esto se puede realizar sólo para los tejidos de tamaño pequeño, ya que la penetración de PFA en muestras de tejido más grandes será menos eficiente que durante la perfusión.
La tasa de éxito de este protocolo se mejora mediante la formación, por lo que se espera que los investigadores necesitarán algún tiempo para familiarizarse con los diferentes pasos de la técnica. Por ejemplo, la perfusión de la solución en el bulbo arterioso es un paso particularmente crítico del protocolo y requiere un poco de entrenamiento para lograr un buen resultado. También mantener la aguja en la posición correcta durante el tiempo suficiente durante la perfusión no es trivial, y requerirá entrenamiento por el manipulador.
Por último, este protocolo está optimizado para medaka adulto, pero puede ser utilizado para otras especies con algunas adaptaciones. Diferentes tejidos de interés, o incluso diferentes etapas de la vida del animal dentro del mismo tejido también requerirá optimizaciones para la concentración de DiI y el tiempo de perfusión, así como el material utilizado (tamaños de aguja y jeringa por ejemplo).
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Shinji Kanda la demostración de perfusión cardiaca con solución fijadora en medaka, la Sra. Lourdes Carreon G tan para obtener ayuda con la cría de medaka y el Sr. Anthony Peltier para las ilustraciones. Este trabajo fue financiado por la NMBU y por el Consejo de investigación de Noruega, concesión número 248828 (programa de vida de Noruega digital).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| Borosilicate glass 10 cm OD 1.2 mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7 mm and I.D 1.1 mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| Pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| Tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
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