Summary
O artigo descreve um protocolo rápido para a rotulagem de vasos sanguíneos em um peixe teleósteo por perfusão cardíaca de DII diluído em fixador, usando Medaka (Oryzias latipes) como um modelo e focando no cérebro e tecido hipofisário.
Abstract
Os vasos sanguíneos inervam todos os tecidos em vertebrados, permitindo a sua sobrevivência, proporcionando os nutrientes necessários, oxigênio, e sinais hormonais. É um dos primeiros órgãos a começar a funcionar durante o desenvolvimento. Mecanismos de formação de vasos sanguíneos tornaram-se um assunto de alto interesse científico e clínico. Em adultos no entanto, é difícil visualizar a vasculatura na maioria dos animais vivos devido à sua localização profunda dentro de outros tecidos. No entanto, a visualização dos vasos sanguíneos permanece importante para vários estudos, como Endocrinologia e neurobiologia. Enquanto várias linhas transgênicas foram desenvolvidas em zebrafish, com vasos sanguíneos visualizados diretamente através da expressão de proteínas fluorescentes, não existem tais ferramentas para outras espécies teleósteo. Usando Medaka (Oryzias latipes) como um modelo, o protocolo atual apresenta uma técnica rápida e direta para rotular vasos sanguíneos no cérebro e hipófise por perfusing através do coração com fixador contendo DII. Este protocolo permite a melhoria de nossa compreensão em como o cérebro e as pilhas pituitárias interagem com o vasculatura do sangue no tecido inteiro ou em fatias grossas do tecido.
Introduction
Os vasos sanguíneos desempenham uma parte essencial do corpo vertebrado como eles fornecem os nutrientes necessários, oxigênio e sinais hormonais para todos os órgãos. Além disso, desde a descoberta de seu envolvimento no desenvolvimento do câncer1, eles receberam muita atenção na pesquisa clínica. Embora um número de publicações investigaram os mecanismos permitindo o crescimento e a morfogênese do vaso sanguíneo, e um grande número genes importantes para sua formação foram identificados2, muito remanesce ser compreendido a respeito da interação entre células ou tecidos e o sangue circulante.
A visualização da vasculatura sanguínea no cérebro e na hipófise é importante. Os neurônios no cérebro exigem uma alta oferta de oxigênio e glicose3, e a hipófise contém até oito tipos importantes de células produtoras de hormônio que usam o fluxo sanguíneo para receber sinal do cérebro e enviar seus respectivos hormônios para diferentes órgãos periféricos4,5. Enquanto em mamíferos, o sistema portal na base do hipotálamo nomeou a Eminência mediana, liga o cérebro e a hipófise6, tal uma ponte de sangue clara não foi descrita em peixes teleósteo. Na verdade, nos teleosts, os neurônios preoptico-hipotálamo projetam diretamente seus axônios na pars nervosa da hipófise7 e inervam principalmente os diferentes tipos de células endócrinas diretamente8,9. No entanto, alguns desses neurônios têm suas terminações nervosas localizadas no espaço extravascular, em estreita proximidade com capilares sanguíneos10. Portanto, a diferença entre peixes e mamíferos teleósteo não é tão clara, e a relação entre a vasculatura sanguínea e o cérebro e as células Hipofisárias requer maior investigação em peixes teleósteo.
O zebrafish tem, em muitos aspectos, um sistema vascular anatomicamente e funcionalmente comparável a outras espécies de vertebrados11. Transformou-se um modelo poderoso do vertebrados para a pesquisa cardiovascular na maior parte agradecimentos ao desenvolvimento de diversas linhas transgênicas onde os componentes do sistema vascular são etiquetados com as proteínas fluorescentes do repórter12. No entanto, a anatomia do sistema circulatório exato pode variar entre as espécies, ou mesmo entre dois indivíduos pertencentes à mesma espécie. Portanto, a visualização dos vasos sanguíneos pode ser de grande interesse também em outras espécies teleósteo para as quais as ferramentas de transgénese não existem.
Várias técnicas foram descritas para rotular vasos sanguíneos em mamíferos e teleosts. Estes incluem a hibridação in situ para genes vasculature-específicos, a mancha alcalina da fosfatase, a microangiografia, e as injeções da tintura (para uma revisão vêem13). A tintura catiônica lipofílica fluorescente do indocarbocyanine (DII) foi usada primeiramente para estudar a mobilidade lateral dos lipídios da membrana porque é mantida nos bicamadas do lipido e pode migrar com ele14,15,16. De fato, uma molécula de DiI é composta por duas cadeias de hidrocarbonetos e cromophores. Quando as correntes do hidrocarboneto se integrarem na membrana de pilha do BICAMADA do lipido das pilhas no contato com ela, os cromóforos permanecem em sua superfície17. Uma vez na membrana, as moléculas DiI se difusas lateralmente dentro da bicamada lipídica que ajuda a manchar estruturas de membrana que não estão em contato direto com a solução DiI. Injetando uma solução DiI através de perfusão cardíaca, portanto, rotular todas as células endoteliais em contato com o composto permitindo a rotulagem direta dos vasos sanguíneos. Hoje DiI também é usado para outros fins de coloração, tais como a imagem única molécula, mapeamento de destino, e Rastreamento neuronal. Curiosamente, existem vários fluoróforos (com diferentes comprimentos de onda de emissão) permitindo a combinação com outros rótulos fluorescentes, e a incorporação, bem como a difusão lateral de DiI pode ocorrer em ambos os tecidos vivos e fixos18, a 19.
O formaldeído, descoberto por Ferdinand Blum em 1893, tem sido amplamente utilizado nos dias atuais como o produto químico preferencial para fixação tecidual20,21. Mostra ampla especificidade para a maioria dos alvos celulares e preserva a estrutura celular22,23. Igualmente preserva as propriedades fluorescentes da maioria de Fluorophores, e assim pode ser usado para fixar os animais transgênicas para que as pilhas alvejadas expressam proteínas fluorescentes do repórter.
Neste manuscrito, um protocolo prévio desenvolvido para rotular vasos sanguíneos em pequenos modelos experimentais de mamíferos24 foi adaptado ao uso em peixes. O procedimento inteiro leva apenas um par de horas para executar. Ele demonstra como perfuse uma solução fixativa de formaldeído contendo DiI no coração de peixe, a fim de etiquetar diretamente todos os vasos sanguíneos no cérebro e da hipófise do modelo de peixe Medaka. Medaka é um pequeno peixe de água doce nativo da Ásia, encontrado principalmente no Japão. É um organismo modelo de pesquisa com um conjunto de ferramentas moleculares e genéticas disponíveis25. Portanto, a identificação dos vasos sanguíneos nesta espécie, bem como em outros permitirá melhorar a nossa compreensão sobre como o cérebro e as células Hipofisárias interagem com a vasculatura sanguínea em tecido inteiro ou fatias de tecido espesso.
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Protocol
Toda a manipulação animal foi executada de acordo com as recomendações para o cuidado e o bem-estar de animais da pesquisa na Universidade Norueguesa de Ciências da vida, e a supervisão de investigadores autorizados.
1. preparação de instrumentos e soluções
- Prepare a solução de ações DiI dissolvendo 5 mg de cristal DiI em tubo plástico de 1,5 mL com 1 mL de 96% de EtOH. Vortex para 30 s e sustento coberto usando a folha de alumínio.
Nota: A solução conservada em estoque de DiI pode ser conservada no escuro em-20 ° c por diversos meses. - Prepare o suporte de peixe (Figura 1a) cortando um pedaço de poliestireno a 5 cm de comprimento, 3 cm de largura e 2 cm de espessura, e colando-o a um prato de plástico de 9 cm de diâmetro. Faça um furo em forma de barco de 3 cm com uma lâmina de bisturi no poliestireno.
- Prepare o sistema de perfusing (Figura 2) adicionando uma cânula plástica longa de 30-50 cm na extremidade da agulha.
- Prepare 40 mL de solução fresca de paraformaldeído a 4% (PFA) diluindo 10 mL de PFA 16% com 30 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um tubo de plástico de 50 mL.
- Prepare 10 mL da solução fixative/DiI diluindo 1 mL da solução de ações DiI em 9 mL de PFA preparada na hora 4% em um tubo de plástico de 10 mL. Mantenha no escuro até o uso.
Nota: Os cristais DiI que não são dissolvidos podem ser mantidos no tubo de solução de ações, e o novo etanol pode ser adicionado para preparar a nova solução de ações DiI (ver etapa 1,1). -
Prepare 50 mL de tricaína (MS-222) estoque.
- Dissolver 200 mg de tricaína em pó em 48 mL de H2O. adicionar 2 ml de 1 M de base tris (pH 9). Ajuste a pH 7 com 1 M HCl e armazene a-20 ° c.
- Diluir 5 mL de stock de tricaína em 50 mL de água limpa num copo pequeno.
- Prepare várias pipetas de vidro de 5 cm (Figura 2) esticando um capilar de vidro com um extrator de pipeta seguindo as instruções do fabricante.
2. dissecção e perfusão
Nota: PFA é um composto tóxico volátil, portanto, a dissecção e perfusão deve ser realizada em uma capa ou em um quarto ventilado, e o usuário deve estar usando uma máscara de gás.
- Prepare as ferramentas de dissecção, incluindo pequenas tesouras, e uma pinça afiada e uma forte antes da dissecção.
- Encha a seringa com a solução preparada de PFA/DiI colocando-a no tubo de 50 mL e elaborando-a. Em seguida, coloque a agulha com a cânula na extremidade da seringa (Figura 2).
- Fixar a seringa no banco utilizando vários pedaços de fita colocada em diferentes direções, ajustar a posição do microscópio e o assento para obter uma boa posição para dissecção e para pressionar o pistão da seringa (Figura 1B).
Nota: Neste protocolo, o cotovelo é usado para pressionar o pistão da seringa, mas outras opções de possibilidades podem ser usadas, por exemplo, assistência de outra pessoa. - Eutanizar o peixe com uma overdose de tricaína, colocando o peixe na solução preparada na etapa 1,7. Aguarde 30 s e teste os reflexos do peixe agarrando a sua barbatana caudal com o fórceps. O peixe pode ser usado quando ele parou de responder aos estímulos.
- Coloque o peixe no suporte de peixe com o seu abdômen virado para cima e fixar uma agulha na extremidade da cabeça e outro acima da cauda para manter o peixe no lugar.
- Abra o abdômen anterior com a tesoura cortando horizontalmente a camada superficial da pele.
- Usando fórceps, retire a pele acima do coração até que um acesso claro ao ventrículo e ao arteriosus do bulbus seja fornecido (Figura 3).
- Adicione uma pipeta de vidro na extremidade do capilar e quebre a extremidade da ponta da pipeta de vidro.
Nota: O furo da ponta quebrada deve ser grande bastante deixar o líquido para fora, mas ainda pequeno bastante para incorporar facilmente o tecido. A pipeta de vidro pode ser reutilizada se não quebrado ou entupido. - Traga a pipeta de vidro perto do ventrículo e adicione a pressão ao pistão da seringa com o cotovelo para forçar para fora o líquido.
- Fixe o ventrículo cardíaco com a pipeta de vidro enquanto adiciona pressão à seringa.
- Diretamente depois, perfurar o seio venoso com fórceps para permitir que o sangue deixe a circulação.
Nota: O ventrículo cardíaco torna-se mais frágil por causa do fixador. Ele também se torna menos vermelho como o sangue é diluído com a solução fixative/DiI. - Do ventrículo, ajuste o ângulo da pipeta de vidro para encontrar a entrada do arteriosus do bulbus. Coloque a pipeta no interior do bulbus arteriosus, como mostrado na Figura 2, e acrescente mais pressão à seringa.
Nota: O arteriosus do bulbus é transparente e o tecido é elástico. Ao substituir o sangue com DiI/fixative, a pipeta de vidro dentro do coração deve tornar-se mais visível e adicionando a pressão, o tamanho do arteriosus do bulbus deve expandir. Esta etapa é crucial certificar-se de que bastante pressão estêve usada para substituir todo o sangue com a solução de fixative/DiI, e que todos os vasos sanguíneos estiveram alcançados. Muitas vezes, quando bem sucedido, o PFA provoca contrações musculares e os peixes estarão se movendo. - Continue a adicionar pressão sobre a seringa para 30-60 s ainda mantendo a pipeta de vidro dentro do arteriosus bulbus.
- Retire a pipeta de vidro e as agulhas do peixe.
- Dissecar o cérebro e a hipófise, e incubar tecidos em fresco 4% PFA em PBS para 2 h no escuro à temperatura ambiente.
Nota: A dissecção do cérebro e da hipófise anteriormente tem sido descrita detalhadamente de duas maneiras diferentes por Fontaine et al.26 e Ager-Wick et al.27. Por causa da fixação, o tecido torna-se bastante duro e a ligação frágil entre o cérebro e a hipófise pode ser quebrada. Após a dissecção, o processamento pós-fixação também pode ser realizado durante a noite a 4 ° c. - Lave o tecido duas vezes em PBS por 10 min antes de se preparar para a imagem.
Nota: O tecido pode então ser montado entre o deslizamento da corrediça e da tampa com os espaçadores entre e o meio de montagem para a imagem latente confocal (veja Figura 4), ou seccionado com um do como descrito em detalhe em Fontaine et al.26 antes de montar entre deslize e cubra o deslizamento para a imagem latente com um estereomicroscópio (veja Figura 4).
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Representative Results
Este protocolo demonstra um procedimento passo a passo para rotular vasos sanguíneos no cérebro Medaka e pituitária, e ao mesmo tempo fixar o tecido. Após a rotulagem por injeção cardíaca de uma solução fixativa contendo DiI no coração, os vasos sanguíneos podem ser observados em fatias usando um estereomicroscópio fluorescente (Figura 4) ou em tecido inteiro usando um microscópio confocal (Figura 5). Na fatia grossa do tecido ou no tecido inteiro, a arquitetura do vasculatura do sangue pode ser observada em três dimensões. As fatias de tecido podem ser rotuladas para proteínas específicas, utilizando protocolos de imunofluorescência padrão após o término da fixação, e em linhas transgênicas onde as células de interesse expressam proteínas de repórter fluorescente (Figura 6). Isso permite investigações sobre interações entre vasos sanguíneos e outros tipos de células específicas. Aqui por exemplo, o uso de uma linha transgênica de Medaka onde as células produtoras de proteína verde fluorescente (GFP) revelaram a localização das células de LH pituitária28. Pode-se observar que essas células enviam extensões para os vasos sanguíneos. Alguns vasos sanguíneos podem não ser rotulados corretamente se a perfusão é sub-optimal. Este pode ser o caso, por exemplo, se a solução for injetada no ventrículo cardíaco em vez do bulbus arteriosus, ou se estiver usando pressão muito baixa e/ou por um período muito curto no pistão da seringa (Figura 7). Finalmente, por imagem do mesmo tecido com os mesmos parâmetros de imagem, a intensidade da rotulagem foi mostrada para diminuir após quatro dias, com o sinal mais espalhado (Figura 8).
Figura 1 : Imagens da placa de retenção para perfusão do peixe (a) e da configuração da injecção (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Esquema do coração dos peixes de Medaka e do sistema da perfusão mostrados com a posição do Idel da agulha de vidro no coração para a perfusão bem sucedida. A cabeça da seta mostra onde perfurar o coração para permitir que o sangue deixe a circulação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Imagem do lado ventral do peixe aberto, com o coração exposto para perfusão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Imagem do vasculatura do sangue em uma fatia de cérebro e de tecido pituitário de Medaka. Um Medaka adulto foi perfundidos com uma solução fixador que contem DII. Cérebro e hipófise foram dissecados e fixos durante a noite. Os tecidos foram montados em agarose a 3% e seccionados com um vibratoma antes da imagem latente com um microscópio de fluorescência. Todos os vasos sanguíneos rotulados com DiI são vistos através de toda a seção mostrando a vasculatura no cérebro e na hipófise. OT = Tectum óptico; Tel = telencon; Hyp = hipotálamo; Pit = hipófise; CB = cerebelo; Hind = hindbrain. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : rendição 3D de uma z-pilha confocal do vasculatura do sangue na hipófise de Medaka. Um Medaka adulto foi perfundidos com uma solução fixador que contem DII. Cérebro-pituitária foram dissecados e fixos durante a noite. A hipófise foi dissecada do cérebro e montada entre uma corrediça e uma lamínula com espaçadores IB entre, antes da imagem latente com um microscópio confocal. Z-Stack foi gravado, e uma renderização 3D foi feita usando o software Fiji e o plugin visualizador 3D29. O vasculatura pituitário inteiro do sangue podia ser observado em 3D. RPD = distalis rostral pars; PPD = distalis proximal das paridades; PI = pars intermedia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Projeção z de pilha-z confocal de uma fatia de tecido de Medaka transgênica onde o promotor Lhβ controla a expressão da proteína verde do repórter fluorescente. Um adulto TG (lhb: hrgfpii) Medaka foi perfundidos com uma solução fixador que contem DII. Cérebro-pituitária foram dissecados e fixos durante a noite. Os tecidos foram montados em agarose a 3% e seccionados com um vibratoma. Algumas células produtoras de hormônio, células de LH neste caso, enviando extensões (cabeças de seta) para os vasos sanguíneos podem ser observadas, provavelmente para sentir sinais do sangue e/ou liberar seus hormônios para a circulação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Imagem do vasculatura do sangue em uma fatia de cérebro e de tecido pituitário do Medaka mal perfundidos. Um Medaka adulto era mal perfundidos com uma solução fixador que contem DII injetando a solução no ventrículo somente. Cérebro-pituitária foram dissecados e fixos durante a noite. Os tecidos foram montados em agarose a 3% e seccionados com um vibratoma antes da imagem latente com um microscópio confocal. Os vasos sanguíneos foram mal rotulados com DiI e alguns deles não foram rotulados em tudo. OT = Tectum óptico; Tel =, telencon; Hyp = hipotálamo; Pit = hipófise; CB = cerebelo; Hind = hindbrain. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 : Imagem latente do lapso de tempo do vasculatura etiquetado do sangue na seção cerebral-pituitária do tecido do Medaka. Um Medaka adulto foi perfundidos com uma solução fixador que contem DII. Cérebro-pituitária foram dissecados e fixos durante a noite. Os tecidos foram montados em agarose a 3% e seccionados com um vibratoma antes da imagem com um estereomicroscópio diretamente após a montagem (a) e 4 dias após a montagem (B) com os mesmos parâmetros de imagem. Note que a rotulagem diminuiu e se espalhou com o tempo. OT = Tectum óptico; Tel = telencon; Hyp = hipotálamo; Pit = hipófise; CB = cerebelo; Hind = hindbrain. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A perfusão cardíaca com DII anteriormente tem sido usada para rotular vasos sanguíneos em várias espécies-modelo24, incluindo peixes teleósteo13.
Como DiI é diretamente entregue à membrana celular endotelial por perfusão na vasculatura, é possível aumentar a relação sinal-ruído, aumentando a concentração de DiI na solução fixativa. Além, o fluoróforo fornece a mancha intensa quando excitado com o clareamento mínimo permitindo a emissão relativamente duradouro18,30. Além disso, a rotulagem pode permanecer por vários dias e ser usado em combinação com outras técnicas de rotulagem que necessitam de tratamentos leves, como na immuofluorescência (IF)31.
No entanto, esta técnica tem algumas limitações. Após a remoção da solução fixativa, a rotulagem e a imagem dos tecidos devem ser realizadas o mais rápido possível, pois a intensidade da rotulagem enfraquecerá, e o sinal será difuso com o tempo (Figura 8). Este processo será ainda mais rápido ao usar detergentes que aumentam a porosidade da membrana. Além disso, como o PFA é um composto volátil tóxico, várias precauções devem ser tomadas ao realizar este experimento. Para minimizar os aspectos perigosos deste protocolo, pode-se perfuse uma solução de DiI e PBS antes de dissecação do tecido de interesse e corrigi-lo com a solução de PFA logo após a perfusão. No entanto, isso pode ser realizado apenas para tecidos de pequeno porte, pois a penetração de PFA em amostras de tecido maiores será menos eficiente do que durante a perfusão.
A taxa de sucesso deste protocolo é melhorada pelo treinamento, por isso é esperado que os pesquisadores vão precisar de algum tempo para se familiarizar com os diferentes passos da técnica. Por exemplo, a perfusão da solução no arteriosus do bulbus é uma etapa particularmente crítica do protocolo e exige algum treinamento para conseguir um bom resultado. Também manter a agulha na posição correta por tempo suficiente durante a perfusão não é trivial, e exigirá treinamento pelo manipulador.
Finalmente, este protocolo é otimizado para Medaka adulto, mas pode ser usado para outras espécies com algumas adaptações. Diferentes tecidos de interesse, ou mesmo diferentes estágios de vida do animal dentro do mesmo tecido também exigirá otimizações para a concentração de DiI e o tempo de perfusão, bem como o material utilizado (agulha e tamanhos de seringa, por exemplo).
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Shinji Kanda pela demonstração de perfusão cardíaca com solução fixativa em Medaka, Sra. Lourdes Carreon G Tan, para obter ajuda com a criação de Medaka, e o Sr. Anthony Peltier para ilustrações. Este trabalho foi financiado pela NMBU e pelo Conselho de pesquisa da Noruega, concedem o número 248828 (programa de vida digital da Noruega).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| Borosilicate glass 10 cm OD 1.2 mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7 mm and I.D 1.1 mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| Pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| Tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
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