Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

שיטת הקרנה של תא בודד לבחירת ושחזור של נוגדנים עם הצורך הרצוי מתוך זיכרון אנושי מועשר B אוכלוסיות תאים

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59809
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1World Without Disease Accelerator, Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson and Johnson, 2Janssen Prevention Center, Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson and Johnson

Summary

שיטת BSelex כדי לזהות ולשחזר נוגדנים ספציפיים אנטיגן ספציפי של הדם היקפיים היקפי תאים מונמונומנט משלבת הזרימה cy, לנסות עם תא בודד PCR ו שיבוט.

Abstract

הרפרטואר האנושי של הנוגדן מייצג מקור מנוצל ברובו של נוגדנים טיפוליים פוטנציאליים וסמנים שימושיים. בעוד שיטות חישוביות נוכחיות, כגון רצף הדור הבא (NGS), להניב קבוצות עצומות של נתונים על רפרטואר נוגדנים ברמת הרצף, נתונים פונקציונליים נדרש כדי לזהות אילו רצפים רלוונטיים אנטיגן מסוים או קבוצה של אנטיגנים. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לזהות ולשחזר נוגדנים ספציפיים אנטיגן ספציפי של דם היקפי תאי מונמונומנט (PBMCs) מתורם דם אנושי. שיטה זו מנצלת העשרה הראשונית של תאים B בוגרת ומחייב שילוב של סמנים תא פנותוניים ו חלבון מתויג בצורה פלואורוסקופים כדי לבודד את זיכרון IgG B תאים באמצעות הזרמת cy, לנסות. אזורי המשתנה הכבד והקל משוכפל ומוקרן מחדש. למרות שהוא מוגבל לזיכרון B תא התא, שיטה זו מנצל את היתרון של cy, מנסה לחקור מיליוני תאים B ומחזיר רצפי שרשרת כבדה וקלה מתא אחד בפורמט מוכן לביטוי ואישור של ספציפיות. נוגדנים ששוחזרו עם שיטה זו יכול להיחשב לפוטנציאל טיפולי, אבל יכול גם לקשר ספציפיות ופונקציה עם גישות ביוטיות כדי להעריך את רפרטואר התא B בתוך יחידים.

Introduction

נוגדנים הם מעמד הולך וגדל של מולקולות טיפוליות, ואת הרפרטואר הקיים של התא B בכל אדם הוא מקור פוטנציאלי של נוגדנים כאלה. כאשר התאושש מתורם אנושי, הם אינם דורשים הסתגלות או "הומניזציה", צעדים הנדרשים עבור נוגדנים שנוצרו במערכות בעלי חיים אחרים. קיימות מספר שיטות לזיהוי ובידוד של נוגדנים אנושיים, כולל B הפעלת תא והפצת1, הפצה דרך המרת ebv2,3, והדור של קווי יפידים cell4 ,5. עם זאת, כל השיטות הללו דורשות תרבות תא נרחבת למסך ולשחזר נוגדנים ספציפיים אנטיגן. מידע על הרפרטואר לנוגדן האנושי הורחב מאוד עם התפתחות של רצף הדור הבא (NGS) טכנולוגיה, המאפשר זיהוי של כמויות עצומות של רצפים בודדים נוכח דגימות התורם. עם זאת, מכיוון NGS מניב תצוגה אגנוסטי של כל הרצפים נוכח, זה לא מאפשר זיהוי ובידוד של נוגדנים ספציפיים אנטיגן, במיוחד במקרה של נוגדנים בתדר נדיר או נמוך.

מטרתו של "BSelex" השיטה היא לזהות נוגדנים ספציפיים אנטיגן מתוך במחזור דם היקפי תאים מונמונומנט בתורמים אנושיים, ולבודד ולשחזר את רצפי נוגדנים אלה לניתוח נוסף. שיטה זו מנצלת את הזרימה cy, מיון התא כדי לנצל את קולטן התא B (BCR) ביטא על פני השטח של תאי זיכרון B. מיליוני תאים B יכול להיות מוקרן עבור אנטיגן-ספציפיות דרך הזרימה cy, try לפני התפוקה נמוכה יותר ביולוגיה מולקולרית שיטות הם יזמו. לזווג זיהוי שרשרת כבדה ואור אינו אפשרי ברוב שיטות NGS, אשר לנתח רצפי תאים בכמויות גדולות. בשיטה שאנו מתארים כאן, התאים מבודדים בנפרד, ולזווג שחזור הן כבדות ושרשרת האור אפשרי, אשר מאפשר שיבוט ישירה וביטוי של IgG המלא.

Protocol

השימוש בדגימות של מתנדבים אנושיים בעקבות פרוטוקולים שאושרו על ידי מכון המחקר של סקריפס מחקר הלוח סקירה מוסדית. הסכמה מושכלת הושגה מהתורמים לפני תרומת הדם.

1. הכנה מגיב

  1. תאי דם היקפיים (PBMCs)
    1. שחזר את התאים ההיקפיים של דם. מתורמים אנושיים רגילים בבידוד Cryopreserve ב 50,000,000 תאים/mL ב 90% בסרום של שור עוברי (FBS) ו-10% diמתיל סולפוקסיד (DMSO). הקפא את התאים ב-80 ° צ' והעבר לחנקן נוזלי לאחסון ארוך טווח.
  2. תיוג היעד אנטיגן פפטידים למיון
    1. ליצור או להשיג פפטידים ספציפיים חלבון היעד (עד 70 שאריות ארוכים) עם biotin טרמינל.
    2. תווית 4 נמול של כל פפטיד biotinylated בודדים עם streptavidin covalently רוב מחובר PE (R-phycoמרין) או APC (allophycocyanin) בצינורות נפרדים. להכין באמצעות יחס טוחנת של 9:1 פפטיד streptavidin (SA), עם ריכוז סופי של בערך 3.2 μM עבור SA-PE ו 5.7 μM SA-APC. הכינו את ביוטין טטרמרס כשליטה שלילית.
    3. מודטה כל תערובת פפטיד בלילה, בחשיכה, ב 4 ° c עם ערבוב איטי.
    4. הסר fluorophore מאוגד על ידי העברת פפטידים המסומנים באמצעות microcolumns המכילים חרוזים פוליאקרילמיד.
    5. מאגר פפטיד הטמרס עד 2 חודשים ב 4 ° c.

2. מיון תאים

  1. לפחות 1 h עד 16 שעות לפני CD22 + בידוד, הפשרת PBMCs התורם ולאפשר לנוח ב 37 ° c.
    1. הסירו את הבקבוקונים מהמקפיא והעבירו מיד לאמבט מים ב37 ° c. , כשהבקבוקונים כמעט הופלו. העבירו לאזור העבודה
    2. העבר את התוכן של כל בקבוקון לצינורית 50 mL המכילה מדיום טרום-שחומם (שמירה על התורמים בנפרד). הוסף אמצעי בינוני לנפח סופי של 50 mL. ערבב בעדינות את התוכן.
    3. צנטריפוגה ב 370 x g עבור 6 דקות בטמפרטורת החדר. להיפטר supernatant, להשעות מחדש את התאים 15 מ ל של RPMI בינונית להשלים ולבצע ספירת תאים.
    4. כוונן את ריכוז התא כדי 2.0 x 107 תאים/ML עם RPMI בינוני מלא, ותאים להעביר T75 בקבוקון או גדול יותר, מודטה ב 37 ° c עבור לפחות 1 h עד 16 h כדי לאפשר זמן ההחלמה עבור תאים המופשרים.
    5. לאסוף את התאים (לצירוף במידת הצורך) ו צנטריפוגה ב 370 x g עבור 6 דקות ב 4 ° c. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את התאים 5 מ ל קרח קר מאגר מקינטוש (PBS, pH 7.6 המכיל 0.5% BSA ו 2 מ"מ EDTA), להביא 50 mL עם מאגר מקינטוש ולבצע ספירת תאים.
    6. צנטריפוגה את התאים ב 400 x g עבור 7 דקות ב 4 ° c.
    7. בודד את התאים CD22+ B לפי בחירה חיובית באמצעות לכידת CD22 מיקרו חרוזי. השתמש במאגר מקינטוש עבור כל השטף. הרוזן וצנטריפוגה 400 x g עבור 7 דקות ב 4 ° c. ההחלמה הצפויה היא 5-10% מאוכלוסיית ה-PBMC הכוללת.
    8. להשעות את התאים ב 40,000,000 למאגר ה-mL FACS (מאגר טריס, pH 8.0 המכיל 0.5% BSA ו 2 מ"מ EDTA) ולהמשיך עם צביעת תאים של התורמים באופן אינדיבידואלי או כבריכה.
  2. הכתם תאים עבור מיון תא B
    1. הסר משתמש של תאים עבור cytometer להגדיר פיצוי עבור כל התוויות fluorophores בשימוש. כלול תאים שאינם מוכתמים כפקד.
    2. חישוב נפח הצביעת הסופי עבור מספר CD22+ תאים שהתקבלו (צביעת 2,000,000 לכל 100 μl).
    3. הוסף סמנים מסחטות עבור B תאים (CD19-PerCP-Cy 5.5), IgG (IgG-FITC), ואת תא הזיכרון (CD27-PECy7) לפי המלצות של היצרנים ' דילול, ומערבבים בעדינות. Aliquot 107 תאים לתוך צינור 1.5 ml עבור שליטה שלילית להעביר את התאים הנותרים כדי שפופרת 15 ml.
    4. הוסף את הכפולים המסומנים biotin-SA הטמרס לצינור הבקרה השלילי בריכוז הסופי של 36 ננומטר כל אחד עבור PE ו APC כפול על ידי מספר פפטידים בצינור מיון ולהביא את נפח 0.5 mL הסופי עם מאגר FACS (g., 10 פפטידים x 36 nM = 360 ננומטר).
    5. הוסף את הטטרמרים פפטיד לצינור מיון ב 36 ננומטר כל אחד עבור PE ו APC ולהביא את התאים 2x106 לכל 100 μl עם מאגר TBS. דגירה ב 4 ° צ' בחושך עם סיבוב עדין עבור 30-60 דקות.
    6. שטוף 2x ב 4 ° צ', 400 x g, 7 דקות, הסרת סדרת מחלקים לספור לפני השטיפה האחרונה. מסננים תאים באמצעות מסנני כיסוי של 5 מ"ל. הוסף DAPI (4, 6-diamidino-2-פניינילידול) הכתם לריכוז הסופי 0.3 μM רק לפני מיון כסמן של שלמות קרום התא.
  3. תא בודד מיון באמצעות cy, הזורם בזרם
    1. הכינו 48 בארות של 96-טוב PCR צלחות למיון.
      1. להכין לערבב הורים: (2 μL של 10x RT מאגר, 0.5 μL של RNase מעכבי, 7.5 μL של מים מעוקרים-כיתה) לכל מדגם. הורדה 10 μL לכל היותר, כריכה ואחסון ב-4 ° צ' עד מוכן למיון.
    2. הפעל את הפקד השלילי בסדרן התאים ונתח את המדגם כולו.
      1. הגדר את השערים cy, לנסות לבודד את אוכלוסיות התאים המתאימות למיון תא בודד.
        1. מגרש FSC לעומת אזור במרכז העיר וקבע השער R1 כדי לבודד לימפוציטים.
        2. מגרש FSC לעומת רוחב FSC ולהגדיר שער R3 לא לכלול FSC doublets.
        3. התווה את גובה היחידה לעומת מהאס.
        4. התווה גובה מערכת הנתונים לעומת DAPI וקבע את שער R5 לבידוד תאים חיים (DAPI-).
        5. העלילה IgG vs CD19 ולהגדיר שער R6 לבודד IgG+ B תאים (CD19+ igg+).
        6. העלילה IgG vs CD27 ולהגדיר שער R7 כדי לבחור בתאי זיכרון B (CD27גבוהה).
        7. העלילה אנטיגן-PE (Ag-PE) vs אנטיגן-APC (Ag-APC) ולהגדיר שער R8 כמו Ag-PE+/agt-apc+ רביע עם מספר נמוך של אירועים בשער חיובי כפול.
    3. לאסוף מספר שווה של תאים זיכרון מדגם אנטיגן-חיובי (Ag+) לקביעת האות לרעש.
    4. מיון תאים בודדים בעל פניטיפ CD19+ CD27+ ag-PE+ Ag-APC+ (שער R8) לתוך מוכן 96-היטב PCR צלחות.
    5. לכסות את הצלחות עם רפידות נייר אלומיניום, צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 400 x g, ולאחסן ב-80 ° צ' לשכפול עתידי.

3. שכפול תא יחיד

  1. הפוך תגובות תמלול
    1. הסר את לוח המיון היחיד של תא B מ-80 ° c. הפשרת קרח עבור 2 דקות. ספין הצלחת עבור 2 דקות ב 3,300 x g לתוכן המאגר בתחתית הבארות לפני הפתיחה.
    2. הכנת לערבב בסיס dNTP/מאגר עם 10% שאינו יונית לניקוי ו oligo (dT) כמו הפוכה. הוסף תמהיל אנזימים לכל המכיל את התא היחיד וללא mix.
    3. דגירה 5 דקות ב 65 ° c. הוסף שילוב מאסטר האנזים המכיל 100 mM DTT, RNase מעכב, ו הפוכה האנזים ההמרה להביא נפח הכולל ל 20 μL. דגירה 10 דקות ב 50 ° c, לאחר מכן 10 דקות ב 80 ° c.
    4. העבר לקרח לפני תחילת שלבי ה-PCR
  2. תגובות PCR מקוננות מרובות שלבים
    1. שימוש בתגובות PCR מקוננות נפרדות משמשות עבור שרשרת כבדה (HC) והגברה של שרשרת האור (LC).
    2. לסיבוב הראשון של הגברה ה-PCR (שלב I), השתמש בבריכת התחל הקדמי ובצעד הפוך אחד כדי להגביר את אזורי המשתנה HC ו-LC בתגובות PCR נפרדות (איור 2). באמצעות העיצוב, ברכת התחל הקדמי להגביר אחוז גדול של מנהיג germline (L) רצפים ואת פריימר הפוכה היא ספציפית לאזורים הקבועים במורד הזרם של כל שרשרת, כולל הקאפה (κ) ו למדא (λ) עבור רשתות אור16.
      1. השתמש 2.5 μL של מוצר cDNA כתבנית עבור כל ה-PCR (שלב I) התגובה. הוסף התחל את ריכוז התגובה הסופי של 1 μM עבור כל. כפול מאגר 10x פולימראז לריכוז 2x, להביא את אמצעי האחסון הסופי ל 25 μL לכל תגובה. הפעל את התגובות ב-HC PCR באמצעות [94 ° c/4 דקות; 94 ° צ'/15 s, 55 ° צ'/20, 68 ° צ'/60 ס מ; 68 ° c/3 דקות] עבור מחזורים של 50. הפעל תגובות LC PCR באמצעות [98 ° צ'/4 דקות; 98 ° צ'/15 s, 72 ° צ'/20 s, 72 ° צ'/60 s; 72 ° c/3 דקות] עבור מחזורים 50.
    3. השתמש ב-2.5 μL של המוצר שלב I כתבנית לכל תגובת ה-PCR (Step II). הוסיפו את המאגר של מסגרת התחל הראשונה הספציפית ל-HC ו-LC (κ ו-λ) במסגרת 1 באזור ובריכת התחל הפוכה הספציפית לאזור הצומת של כל שרשרת נוגדנים. כפול החוצץ 10x פולימראז כדי ריכוז 2x, ולהפעיל את התגובות PCR 50 מחזורי כל אחד באמצעות אותם פרמטרים כמו שלב I.
    4. הפעל את התגובות PCR השלימה על 1% העלה ג'ל כדי להמחיש להיטים הגברה חיובית. לשחזר הגברה לזווג (שרשרת כבד ואור מאותו תא) ולבודד דרך חילוץ ג'ל. קביעת ריכוז קטע ה-DNA באמצעות OD260 עבור חישובים מדויקים לגבי ערבוב.
    5. שילוב שברי שרשרת כבדים וקלים עם רסיס מקשר ואת שדרה וקטור הביטוי באמצעות תגובת הקשר 4 חלקים באמצעות ערכה מסחרית.
    6. הפוך תגובות החוצה לתוך חיידקים מוכשרים כימית באמצעות ערכה מסחרית. לאחר מצופה על צלחות אנטיביוטיות, להוסיף 4 מ ל של מדיית גדילה (עם אנטיביוטיקה) לתרבות שינוי שארית, ו-דגירה 37 ° c לילה ב 250 rpm. . זו תרבות המיקס
    7. הכינו את ה-DNA miniprep מתוך התרבות ערבוב לילה לערבב באמצעות ערכת מסחרית, ולקבוע את הריכוז המתקבל של DNA באמצע.

4. אליסה המסך עבור אישור אנטיגן-ספציפיות

  1. Transfect 10 μg של ה-DNA miniprep עם השומנים מבוססי ליפיד מבוסס לתוך 10 מ ל של השעיה 293 תאים, ו מודטה עבור 3-4 ימים ב 37 ° צ' (8% CO2) בעת סיבוב ב-125 rpm. לקציר, תרבות צנטריפוגה 10 דקות ב 1,000 x g ולשחזר מדיה הובהר.
    1. למדוד את הריכוז IgG ב סופרנטנים באמצעות אהדה ל חלבון A.
    2. מבחן כל igg (ב supernatant) ב 20 μg/mL על ידי שיטת האנזים מקושרים adsorbent (אליסה) נגד פפטידים בודדים המשמשים למיון, לכוד על צלחת streptavidin או אקטין כפקד שלילי. השתמש peroxidase עז אנטי אדם נוגדן משני נגד IgG האדם Fab לזהות שיבוטים רקומביננטי. לאחר חיסור של רקע, OD > 0.5 מוגדר חיובי מסך.
    3. אישור להיטים חיוביים מסך על ידי ביצוע אליסה נוספת, באמצעות דיעות של IgG supernatant כדי ליצור עקומת ריכוז החל 20 μg לכל mL, ו התוויית נגד OD עבור כל אנטיגן המציג פעילות מחודשת במסך הראשוני אליסה.

Representative Results

שיטה זו מכסה תהליך רב שלבים כדי לבודד נוגדנים ספציפיים אנטיגן מתורמים אנושיים. בנתוני הנציג המוצג כאן, התאים היו מודרתים עם בריכה של פפטידים המסומנים באמצעות פלואורוסקופים המייצגים מספר תחומים שונים של חלבון הטאו, כולל פפטידים זרחוניים כדי לחקות את האתרים זירחון. פפטידים אלה שימשו "פיתיון" כדי לזהות תאים התגובתית עם האפיסקופים של הטאו (ים) של עניין. לקראת מיון, פאנל של סמנים בעלי תוויות מסומנות בצורה פלואורוסקופים שימשו כדי לזהות אוכלוסיות תאים שונות בתוך אוכלוסיית התא B מועשר. סדרה של שערים של הסיילנסה המציאו כדי לבודד את זיכרון היעד B תאים (איור 1). לימפוציטים היו מבודדים בהתבסס על גודל התאים שלהם ואת צפיפות הרשת באמצעות פיזור הקדמי (fsc) ומגרשים בצד (הסוכנות למען המשתמש) בזרימה cy, try6,7. בעקבות החרגה של תאים מרובים ("doublets") ותאים מתים, סמנים פנומטורי אפשרו את ההפרדה של IgG+ זיכרון B תאים דרך igg, CD19 (תא b) ו CD27 (זיכרון). בגישה זו, CD27 marker אינו מפיץ לשתי אוכלוסיות נפרדות, כך 45% העליון של CD27+ ביטוי תאים נכללים עבור השער הסופי. בסופו של דבר, תאים כפול חיובי עבור APC ו-PE fluorophores להפיץ לתוך הרביע הימני העליון של הגרף, המציין את הפעילות מחדש הן הגרסאות המסומנות של פפטידים. התאים שנפלו בתוך השער המצויר היו מבודדים וממוינים לבארות בודדות של צלחת 96-באר. השימוש אנטיגן עם שתי תוויות שונות מגביר את היחס אות לרעש ומפחית את מספר התוצאות החיוביות שווא בתהליך הביולוגיה המולקולרית העוקבת. התאים הממוינים מיוצגים כ-0.1% מתאי הזיכרון B בשער הסופי, ו-0.001% מדגימת התא ההתחלתי.

הבדיקה הראשונה של שיבוט תא יחיד היא אישור של הגברה של שרשראות כבד ומשתנה האור המתאים (איור 2). מאז לזווג שחזור של שני הגברה היא הרצויה, תגובות ה-PCR מוערכים זה לצד זה על ג'ל agarose, וזוגות תואמים הם המגורש ג'ל וקטעי DNA שחולצו. יעילות אופיינית של הגברה היא 30-50% שרשרת כבדה 50-70% אור (קפא) שרשרת. שחזור של הגברה לזווג הוא בדרך כלל בין 25-40% יעילות. יעילות זו משתנה בין בריכות התורמים והנתונים הנציגים (איור 3) היא דוגמה להגברה יעילה מאוד מ -24 תאים בודדים (42% שחזור מזווג). בעקבות שיבוט IgG, וקטור ביטוי IgG הוא הופך לתוך כליה עובריים האדם (HEK-293) תאים ההשעיה, אשר משמשים כדי למקסם את הביטוי. השימוש במדיום ללא סרום מפחית חלבונים מזיהום מהכנות רקומביננטי נוגדן, ומסייע למזער את הרעש של הכריכה העוקבת. הנוגדנים התאושש מוקרן על הפאנל המקורי של הפפטידים טאו הבקיע לפעילות מחודשת על ידי אליסה (איור 4). סף התחלתי של OD = 0.5 מעל הרקע משמש לציון פעילות מחודשת של אנטיגן חיובי, וחלבון β-actin משמש כפקד עבור איגוד לא ספציפי. אם הזרימה cy, try ומיון הצעדים להשתמש בבריכה מעורבת של פפטידים, ההקרנה אליסה היא הצעד הראשון של פירוק פעילויות מסוימות מסוימות של IgGs התאושש. שלושה מתוך 10 הiggs הדגימו הפגינו מחדש נגד הפחת של CBTAU טאו, ואחד היה מגיב ל27.1 בלתי זרחתי של CBTAU (איור 4א). אישור נוסף הושלם באמצעות עקומת ריכוז של אותו דגימות נוגדן רקומביננטי נגד פפטידים המזוהים במסך הראשוני, פפטיד נוסף כמו שליטה שלילית (איור 4ב). עבור כל פגיעה חיובית, שיבוט בודד פלמיד היה מבודד מן הבריכה השתנה ואישר מחדש על ידי אותה שיטה אליסה. רק שיבוט 34 מוצג את הנתונים המוצגים, ובעוד פעילות מחודשת ל CBTAU שאינו זרחנות שאושרה, איגוד הזיקה התחתון נצפתה גם עם הזליס 27.1 פפטיד (איור 4ג).

Figure 1
איור 1 : בידוד של תאי אנטיגן-תגובתי בודדת דרך הזרימה cy, לנסות. (א) המוצג הוא מזימה ייצוגית שבה אוכלוסיית הימפוציטים היתה כלולה בתוך השער המצויר. (ב) שערים מבוסס על פיזור בצד הקדמי (fsc-גובה v fsc-רוחב (R3); בגובה מתחת לפני המבקרים-רוחב (אר אר)) שימשו להוצאת doublets. רק תאים בתוך שערים נמשכים הוערכו במגרשים הבאים. DAPI+ תאים נחשבו מתים ולא נכללו (R5). בניסוי זה, 3.7 x 107 "חיים" תאים נחקרו. רוב התאים החיים היו B תאים (CD19+), ו igg+ תאים (4.66%) היו מבודדים מאוכלוסיה זו (R6). החלק העליון 43.2% של תאי הזיכרון CD27+-המבטא נכללו בשער הבחירה (R7). (ג) רביע 2 (Q2) הכיל תאים מגיבים הן אנטיגנים שכותרתו (פפטיד-APC v פפטיד-PE), תאים אלה היו ממוינים והתאושש בנפרד לצלחת 96-באר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : ה-PCR הגברה משחזרת IgG רצף משתנה כבד ואור עבור שיבוט. (A) אזורי משתנה של שרשרת כבדים (vh) ואור (vh או Vl) משוחזרים באמצעות תגובות PCR מקוננות. צעד אני מגבירים את הרצף של המנהיג המקורי ומאחור מתוך האזור הקבוע. חצים מרובים מייצגים בריכה של בין 7-12 התחל, אשר משמשות כדי להבטיח כיסוי רחב של מסילות אפשרי. התחל שלב II הם מקוננים, ספציפיים לקצוות הקיצוניים של מסגרת הקריאה הפתוחה, והוסף רצף לקצות ההגברה ההומוולוגי לרצף הסמוך בוקטור הביטוי. (ב) המקשר מורכב משרשרת האור הקבועה (Ck או קלרנית), ולאחריה מקדם השרשרת הכבדה ורצף פפטיד שאינו יליד האות. ההגברה, המקשר ועמוד השדרה מחוללים בו באמצעות רצף הומוולוגי המופק במהלך הגברה שלב ב', והיא מבודדת כפלסמיד. הרשתות הכבדות והרקומביננטי בווקטור הביטוי הסופי מונעים על ידי היזמים של CMV עצמאיים (וזהים), ומתורגמים כחלבונים נפרדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : Igg כבד ומשתנה אור הגברה שרשרת משוחזרים מתאים בודדים. תגובות ה-PCR המקונן (Step II) נטענו במישרין אל 1% מעלה ג'ל ודמיינו. שרשרת כבדה (H) ו קאפה האור תגובות שרשרת (L) PCR מאותו תא נטענו בבארות סמוכות כך הגברה מזווג היו בקלות נצפתה. שרשרת מוצלחת ומוצרי רשת אור הם בערך 400 bp ו 350 bp בהתאמה. התאוששות מוצלחת של הגברה לזווג מסומנים על ידי (*). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : הספציפיות אנטיגן אושרה מ רקומביננטי IgGs. פלמידים המכילים את רצפי השרשרת הכבדה והקלים ששוחזרו מתגברים בתאי HEK לביטוי. לאחר ארבעה ימים, רקומביננטי נוגדנים מוערך עבור פעילות מחודשת על ידי אליסה. (א) ריכוז igg בתקשורת הבהירה נמדד מדולל עד 20 μg/mL. הבריכה של פפטידים המשמשים למיון העריכו בנפרד באמצעות 40 pmol לכל טוב streptavidin צלחות. כל האיגים נבדקו. בבארות כפולות (ב) שיבוטים המוצגים OD450 מדידה > 0.5 העריכו מחדש (שיבוטים #32, #34, #35) באמצעות 1:5 שלבי דילול נגד פפטידים המזוהים במסך. (ג) אישר לאחר להיט, שיבוט בודד פלסמיד היה מבודד שיבוט #34 שהפכו לליטים, מזוהמים, ואישר מחדש על ידי אליסה. אותו הדבר נעשה עבור שיבוטים #32 ו#35 (נתונים לא מוצגים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

השיטה המוצגת כאן משלבת cy, הזרמת הזרימה ושיבוט תא בודד, ואת השיטות שאנו מתארים כאן אנו מבוססים על שיטות שפותחו בעבר על ידי ההגה ועמיתים11. עבודתם מתארת את ההחלמה והשכפול של נוגדנים חד-שבטיים כדי ללמוד את רפרטואר התא B אצל בני אדם ברמה של תאים בודדים. התאמתי את הרכיבים העיקריים של התהליך שלהם כדי לאפשר שחזור של נוגדנים חד שבטיים ספציפי אנטיגן מאוכלוסיה של תאי זיכרון B, כולל את האסטרטגיה מרובת שלב הגברה. השינוי העיקרי הוא התוספת של "פיתיון" אנטיגן מתויג. עיבודים נוספים נעשו בפרוטוקול שפורסם, כולל (אבל לא מוגבל) שינוי שידרה וקטור שיבוט לתוך ביטוי אחד פלמיד, כיסוי נוסף של הרפרטואר germline (הן רצף מנהיג מסגרת 1), הHEK293 של תאים ההשעיה עבור ביטוי גבוה יותר, ואת השימוש באיכות גבוהה פולימות במהלך הגברה PCR.

עבור השיטות המתוארות כאן, השלבים הקריטיים ביותר הם בקרבת המעבר בין cy, הזרמת הזרימה ושיבוט תא בודד. ראשית, המיקום הנכון של תאים בודדים ממוינים לתוך הלוח הוא חיוני. הגדרת ההשהיה הנפתחת כהלכה בסדרן היא שלב מפתח. גורמים סביבתיים, כגון לחות נמוכה, חייב גם להילקח בחשבון, כפי שגילינו יעילות ההחלמה שלנו ירידה באופן משמעותי, אלא אם כן אקדח סטטי משמש על צלחות מיון היעד. לאחר מיקום התא, צלחות מcentrifuged כדי להבטיח תאים יצרו קשר עם 10 μL של מאגר בחלק התחתון של הבארות. כל האמצעים הללו הם קריטיים להצלחת החלק המולקולרי של הביולוגיה המולקולרית. אם התנאים הם תת אופטימלית עבור התגובה הפוכה התעתיק של תא בודד, הגברה PCR של β-actin יכול להיות קשה. כוחה של השיטה המוצגת היא היכולת לחקור מיליוני תאים ולמיין רק את אלה התואמים את הקריטריונים לפעילות האנטיגן נגד אנטיגן הבחירה. זה דורש את האות ליחס רעש גבוה ככל האפשר, אשר נעשה על ידי אופטימיזציה ריכוזי פיתיון לפני מיון. פיתיון בעל תווית כפולה משמש כדי להפחית את ההתאוששות של תאים שווא-חיוביים, אשר יכול להתרחש אם אחד fluorophores יש רקע גבוה. באמצעות יותר מפיתיון אנטיגן אחד יכול להפוך את האות: מיטוב רעש קשה יותר, אבל היכולת לחקור פפטידים מרובים בו זמנית הוא יתרון נוסף של שיטה זו.

כאשר יעילות השחזור נמוכה, סט של מβ-actin מקונן התחל משמש כדי לאשר את התבנית cDNA קיים. החיסרון בגישה זו הוא כי קשה לקבוע אם לא היה תא מתנה בבאר או תגובת התעתיק הפוכה נכשלה, מה שהופך את פתרון התקלות לקשה. לעיתים, ההיפך יתרחש והיעילות גבוהה מהצפוי. ההתאוששות אופייני עבור שרשרת כבדה היא בין 30-45% ושרשראות אור גבוה יותר, בין 40-60%. כל תגובה PCR (שלב I & II) משתמשת 50 מחזורים כדי להגביר מתא אחד. המספר הגבוה של מחזורים כולל גם הופך שיטה זו חשופה לזיהום. ניתן להשתמש בניתוח רצף של הגברה כדי לקבוע אם הוכנסו מזהם, או ששיעור החלמה גבוה באופן חריג הושג באופן חוקי.

השירות של שיטה זו כדי לשחזר נוגדנים אנושיים מקומיים נגד אנטיגן של בחירה יש כמה מגבלות משמעותיות. ראשית, רק חלבונים מסיסים יכול להיות מתויג יכול לשמש "פיתיון" עבור cy, הזרמת הזרימה. עבור מינים שהוצגו בתוצאות הנציג, השתמשנו סדרה של פפטידים חופפים מסונתז מתוך החלבון של טאו, מאז השימוש בחלבון כולו הוכיחה קשה. השימוש בפפטידים ליניאריים הוא כנראה לא אופטימלי, שכן הוא עשוי להגביל את הזיהוי של נוגדנים נגד אפיסקופים לא ליניאריים או מבניים. עם זאת, הצלחנו לזהות מספר נוגדנים ייחודיים נגד הטאו ואלה עוברים כעת הערכה נוספת8,9. מגבלה נוספת היא תפוקה נמוכה של שחזור ביולוגיה מולקולרית ושיבוט של IgGs. אסטרטגיית המיון הראשונית מאפשרת הקרנת מיליוני תאים, אך העיבוד המולקולרי העוקב מורכב ממספר שלבים. מאמצי אופטימיזציה שוטפת לשלב טכנולוגיות חדשות יותר, כגון האסיפה גיבסון10 יש מספר שלבים מסוימים, אבל צוואר הבקבוק נשאר שיבוט בודדים כבדים שרשרת בהיר זוגות.

השיטה "bselex" מנצל את bcr המבוטא על פני השטח של תאים B זיכרון כדי לזהות תאים המציגים תגובתיות אנטיגן, ולאחר מכן לשחזר את התאים הבודדים באמצעות זרימה cy, מנסה11,12. בשל הסתמכות זו על BCR, השיטה מוגבלת לזיכרון B תא התא, ולא ללכוד הפרשה נוגדנים תאים (ASCs) כגון מחזיק הפלסטיק. עם זאת, גישה זו עשויה להיות יתרון כדי לשחזר רפרטואר רחב יותר של אימונוגלויוגלויויויולים ספציפיים אנטיגן בהשוואה ל-ASCs. מחקרים חיסונים שפעת להפגין כי בעוד ASCs תגובתי יכול להיות נשלט על ידי מספר קטן של שיבוטים המורחבת תא B, הזיכרון הספציפי אנטיגן B האוכלוסייה הנמוכה לעתים נדירות שבטיים12. קולטן תא T (TCR) על פני השטח של תאי T בעל דמיון לקולטן התא B בסידור גנים ושילוב מחדש כדי למקסם את הגיוון. מגישות תאים בודדות בדומה למה שמתואר בשיטה שהוצגה כאן פותחו להערכת רפרטואר התא T, כולל התאוששות ושכפול תא בודד של רשתות אלפא וביתא13. עם זאת, זיהוי TCR דורש פפטידים להיות מוצגים על ידי מולקולות MHC, הוספת מורכבות משמעותית לגישת פיתיון בתווית כדי לזהות תאי T ספציפיים פפטיד. בשונה מתאים B, תאי T אינם עוברים בגרות אהדה של אזור המשתנה כולו, כך שזיהוי האזור הקצר CDR3 וחלק מהרצף הוא כל מה שנדרש לזיהוי ולחוקה מחדש. לבסוף, שיטה זו מתארת את הזיהוי של מולקולות IgG באמצעות הזרימה cy, אבל זה אפשרי גם להשתמש סמנים פנוטיפים חלופיים כדי לזהות תאים B של איזוסוגים שונים.

כיום, ישנן שיטות שפותחו כדי לחבר את הכמות העצומה של הנתונים שנאספו מרצף הדור הבא עם ניתוח פונקציונלי של ספציפיות אנטיגן, אבל שיטות אלה עדיין להיות מעודן. למרות מגבלותיו, השיטה המתוארת כאן שימש לזיהוי נוגדנים עם ערך תרפויטי פוטנציאלי למחלות זיהומיות ומחלות שאינן זיהומיות8,14,15, ומייצגת מהימנות גישה לשחזר את האיגים הרלוונטיים אנטיגן ספציפיים מבני אדם, ללא מניפולציה נרחבת של תאים B או תרבות תא נרחבת.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות ללוסי צ'אממאס, מרתה קוסטה, ג'ולי קים, ננסי ארדיה, ויורם מקאדו עבור בדיקות נרחבות של שינויי שיטה רבים ועידון של פלטפורמת BSelex הנוכחית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter MoFlo cell sorting
Biotinylated peptides New England Peptide Cell sorting "bait"
Micro Bio-spin P30 gel column BioRad #7326223
Streptavidin (R-PE) Thermo Scientific SA10041
Streptavidin (APC) Thermo Scientific S32362
CD22 MicroBeads, human  Miltenyi #130-046-401
LS columns Miltenyi #130-042-401
Pre separation filters  Miltenyi #130-041-407
PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19 BD Biosciences BD#340951
PE-Cy7 mouse anti-human CD27  BD Biosciences #560609
FITC mouse anti-human IgG BD Biosciences #560952
DAPI Life Technologies #D21490
RNaseOUT Life Technologies #10777-019
Bovine serum albumin, Fraction V Sigma #A4503
RPMI media Hyclone #SH30096.01
HI FBS (Fetal bovine serum) Invitrogen #10082147
Mastercycler Gradient Eppendorf Model #6325 PCR machine
PCR 96-well plates Phenix MPS-500
PCR Plate mats Phenix SMX-PCR96
Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix Clontech #639125
Superscript IV First-strand synthesis system Invitrogen #18091050
Phusion High Fidelity Polymerase Thermo Scientific F-531-L
Platinum polymerase Invitrogen #10966108
Nuclease-free water QIAGEN #129114
Oligonucleotide primers IDT assorted Primers for all PCR steps
Gel Extraction Kit QIAGEN #28706
PCR Purification kit QIAGEN #28106
Miniprep Kit QIAGEN #27106
NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5520S Gibson assembly
Expi293 Expression Media Invitrogen #A14351-01
ExpiFectamine 293 Transfection Kit Invitrogen #A14525
Opti-MEM Media Invitrogen #31985070
CO2 incubator (Multitron)
Octet RED384 System Pall/ Forte Bio
Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates Thermo Scientific #15500
Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area Corning #3690
Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody Jackson Labs #109-036-097
Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody Jackson Labs #115-035-072
SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component)  KPL #52-00-03
TMB Stop Solution KPL #50-85-06

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Su, K. Y., Watanabe, A., Yeh, C. H., Kelsoe, G., Kuraoka, M. Efficient Culture of Human Naive and Memory B Cells for Use as APCs. Journal of Immunology. 197 (10), 4163-4176 (2016).
  2. Corti, D., Lanzavecchia, A. Broadly neutralizing antiviral antibodies. Annual Review of Immunology. 31, 705-742 (2013).
  3. Steinitz, M., Klein, G., Koskimies, S., Makel, O. EB virus-induced B lymphocyte cell lines producing specific antibody. Nature. 269 (5627), 420-422 (1977).
  4. Bloom, A. D., Nakamura, F. T. Establishment of a tetraploid, immunoglobulin-producing cell line from the hybridization of two human lymphocyte lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2689-2692 (1974).
  5. Olsson, L., Kaplan, H. S. Human-human hybridomas producing monoclonal antibodies of predefined antigenic specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (9), 5429-5431 (1980).
  6. Lechner, J., et al. Alterations in Circulating Immune Cells in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. Scientific Reports. 5, 16754 (2015).
  7. Loken, M. R., Brosnan, J. M., Bach, B. A., Ault, K. A. Establishing optimal lymphocyte gates for immunophenotyping by flow cytometry. Cytometry. 11 (4), 453-459 (1990).
  8. Pascual, G., et al. Immunological memory to hyperphosphorylated tau in asymptomatic individuals. Acta Neuropathologica. 133 (5), 767-783 (2017).
  9. van Ameijde, J., et al. Enhancement of therapeutic potential of a naturally occurring human antibody targeting a phosphorylated Ser(422) containing epitope on pathological tau. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 59 (2018).
  10. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  11. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. Journal of Immunological Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  12. Wrammert, J., et al. Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus. Nature. 453 (7195), 667-671 (2008).
  13. Han, A., Glanville, J., Hansmann, L., Davis, M. M. Linking T-cell receptor sequence to functional phenotype at the single-cell level. Nature Biotechnology. 32 (7), 684-692 (2014).
  14. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).
  15. Jones, H. G., et al. Structural basis for recognition of the central conserved region of RSV G by neutralizing human antibodies. PLoS Pathogens. 14 (3), 1006935 (2018).
  16. Janssen Vaccines & Prevention B.B. US patent. , U.S. Patent Application No. 20170210787, Published July 27, 2017 (2017).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 150 הרפרטואר הסלולרי B קולטן תא שיבוט תא בודד מיון תאים גילוי נוגדנים B שיבוט תא זיכרון B תא שרשרת כבדה שרשרת קלה
שיטת הקרנה של תא בודד לבחירת ושחזור של נוגדנים עם הצורך הרצוי מתוך זיכרון אנושי מועשר B אוכלוסיות תאים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perry, S. T., Keogh, E., Morton, M., … More

Perry, S. T., Keogh, E., Morton, M., Koudstaal, W., Pascual, G. Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations. J. Vis. Exp. (150), e59809, doi:10.3791/59809 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter