Summary
BSelex-metoden för att identifiera och återställa enskilda antigen-specifika antikroppar från mänskliga perifert blod mononukleära celler kombinerar flödescytometri med Single cell PCR och kloning.
Abstract
Den humana antikropprepertoaren representerar en i stort sett outnyttjad källa till potentiella terapeutiska antikroppar och nyttiga biomarkörer. Medan nuvarande beräkningsmetoder, såsom nästa generations sekvensering (NGS), ger enorma mängder data på antikropprepertoaren på sekvensnivå, krävs funktionella data för att identifiera vilka sekvenser som är relevanta för en viss antigen eller uppsättning av Antigener. Här beskriver vi en metod för att identifiera och återvinna enskilda antigen-specifika antikroppar från perifera mononukleära blodceller (PBMCs) från en mänsklig blodgivare. Denna metod utnyttjar en initial berikning av mogna B-celler och kräver en kombination av fenotypiska cell markörer och fluorescently-märkt protein för att isolera IgG minne B celler via flödescytometri. Den tunga och lätta kedjan variabla regioner är sedan klonade och åter skärmad. Även begränsad till minne B cell facket, denna metod utnyttjar flödescytometri att förhöra miljontals B-celler och returnerar Parade tunga och lätta kedjesekvenser från en enda cell i ett format redo för uttryck och bekräftelse av specificitet. Antikroppar som återvinns med denna metod kan övervägas för terapeutisk potential, men kan också koppla specificitet och funktion med bioinformatiska metoder för att bedöma B-cellrepertoaren inom individer.
Introduction
Antikroppar är en växande klass av terapeutiska molekyler, och den befintliga B-cellrepertoaren i någon människa är en potentiell källa till sådana antikroppar. När de återvinns från en mänsklig givare, de kräver ingen anpassning eller "humanisering", åtgärder som krävs för antikroppar som genereras i andra djur system. Det finns flera metoder för identifiering och isolering av humana antikroppar, inklusive B-cellsaktivering och proliferation1, i via EBV-Transformation2,3och generering av Hybridomteknik-cellinjer4 ,5. Emellertid, alla dessa metoder kräver omfattande cellodling för att avskärma och återvinna antigen-specifika antikroppar. Information om människans antikropps repertoar har utökats kraftigt med utvecklingen av Next generation sekvensering (NGS) teknik, vilket möjliggör identifiering av massiva mängder av enskilda sekvenser som finns i givar prov. Men eftersom NGS ger en agnostiker bild av alla sekvenser som finns, det tillåter inte för identifiering och isolering av antigen-specifika antikroppar, särskilt när det gäller sällsynta eller lågfrekventa antikroppar.
Syftet med metoden "BSelex" är att identifiera antigen-specifika antikroppar från cirkulerande perifera mononukleära blodceller i humana donatorer, och isolera och återvinna sekvenser av dessa antikroppar för vidare analys. Denna metod utnyttjar flödescytometri och cell sortering för att utnyttja B-cellreceptorn (BCR) uttryckt på ytan av minnet B-celler. Miljontals B-celler kan screenas för antigen-specificitet via flödescytometri innan de mer låg genomflödet molekylärbiologiska metoder initieras. Ihopparad tung och lätt kedja identifiering är inte möjligt i de flesta NGS metoder, som analyserar cellsekvenser i bulk. I den metod som vi beskriver här isoleras cellerna individuellt, och ihopkopplad återhämtning av både tunga och lätta kedje sekvenser är möjlig, vilket möjliggör direkt kloning och uttryck av hela IgG.
Protocol
Användningen av prover från frivilliga försökspersoner följt protokoll som godkänts av Scripps Research Institute institutionella Review Board. Informerat samtycke erhölls från givarna före blodgivningen.
1. beredning av reagens
-
Perifera mononukleära blodceller (PBMCs)
- Återhämta perifera blod mononukleära celler från normala humana givare av Ficoll-plack plus isolering. Cryopreserve på 50 000 000 celler/mL i 90% foster bovint serum (FBS) och 10% dimetylsulfoxid (DMSO). Frys cellerna vid-80 ° c och överför till flytande kväve för långtidsförvaring.
-
Märkning Target antigen peptider för sortering
- Generera eller erhålla peptider som är specifika för målproteinet (upp till 70 rester långa) med en Terminal biotin.
- Etikett 4 nmol av varje enskild biotinylerad peptid med konjugerat kovalent kopplad till PE (R-phycoerythrin) eller APC (allophycocyanin) i separata rör. Bered med hjälp av ett molar förhållande på 9:1 peptid till konjugerat (sa), med en slutlig koncentration på ungefär 3,2 μm för sa-PE och 5,7 μm sa-APC. Förbered biotin tetramer som en negativ kontroll.
- Inkubera varje peptidblandning över natten, i mörker, vid 4 ° c med långsam blandning.
- Ta bort obunden fluorophore genom att passera märkta peptider genom microcolumns innehållande polyakrylamidpärlor.
- Förvara peptidtetramers upp till 2 månader vid 4 ° c.
2. cell sortering
- Minst 1 h upp till 16 h före CD22 + isolering, Tina donator PBMCs och låt vila vid 37 ° c.
- Ta bort flaskor med frysta PBMCs från frysen och omedelbart överföra till ett 37 ° c vattenbad. När injektionsflaskorna är nästan tinade, överför till arbetsområdet.
- Överför innehållet i varje injektionsflaska till en 50 mL tub som innehåller förvärmda medel (hålla givarna åtskilda). Tillsätt medel till en slutlig volym på 50 mL. Blanda försiktigt innehållet.
- Centrifugera vid 370 x g i 6 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten, Omsuspendera cellerna i 15 mL RPMI Complete medium och utför ett cellantal.
- Justera cellkoncentrationen till 2,0 x 107 celler/ml med RPMI Complete medium, och överför celler till en T75 kolv eller större och inkubera vid 37 ° c i minst 1 h och upp till 16 h för att medge återhämtningstid för tinade celler.
- Samla in cellerna (pooling om så önskas) och centrifugera vid 370 x g i 6 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten och Omsuspendera cellerna i 5 mL Ice Cold MACS buffert (PBS, pH 7,6 som innehåller 0,5% BSA och 2 mM EDTA), ta till 50 mL med MACS buffert och utföra ett cellantal.
- Centrifugera cellerna vid 400 x g i 7 min vid 4 ° c.
- Isolera CD22+ B-celler genom positiva val via Capture på CD22 microbeads. Använd MACS buffert för alla tvättar. Räkna och centrifugera 400 x g i 7 min vid 4 ° c. Den förväntade återhämtningen är 5-10% av den totala PBMC-populationen.
- Omsuspendera cellerna vid 40 000 000 per mL FACS-buffert (Tris buffert, pH 8,0 innehållande 0,5% BSA och 2 mM EDTA) och fortsätt med cell färgning av givarna individuellt eller som en pool.
- Fläck celler för minne B cell sortering
- Ta bort en alikvot av celler för flödescytometerns-uppsättning och kompensation för var och en av de etiketter som används av fluoroforer. Inkludera ofärgade celler som en kontroll.
- Beräkna den slutliga infärgnings volymen för det antal CD22+ celler som erhålls (färgning 2 000 000 per 100 μl).
- Tillsätt extracellulära markörer för B-celler (CD19-PerCP-CY 5.5), IgG (IgG-FITC), och minnesfack (CD27-PECy7) enligt tillverkarens utspädning rekommendationer, och blanda försiktigt. Aliquot 107 celler i en 1,5 ml tub för den negativa kontrollen och överföra de återstående cellerna till en 15 ml tub.
- Lägg till den dubbla märkta biotin-sa tetramer till det negativa styrröret vid en slutlig koncentration av 36 nm vardera för PE och APC multiplicerat med antalet peptider i sorterings röret och föra volymen till 0,5 ml Final med FACS buffert (t. ex. 10 peptider x 36 nm = 360 nm).
- Tillsätt peptiden tetramer till sorterings röret vid 36 nm vardera för PE och APC och föra cellerna till 2x106 per 100 μl med TBS buffert. Inkubera vid 4 ° c i mörker och med mild rotation för 30-60 min.
- Tvätta 2x vid 4 ° c, 400 x g, 7 min, ta bort en alikvot för att räkna före den sista tvätten. Filtrera celler med 5 mL filter hylsor. Lägg till DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) fläcken till 0,3 μM slutkoncentration strax före sortering som en markör för cellmembranet integritet.
- Enkel cell sortering via flödescytometri
- Förbered 48 brunnar med 96-och PCR-plattor för sortering.
- Förbered en Mastermix: (2 μL 10X RT-buffert, 0,5 μL Rnashämmare, 7,5 μL sterilt PCR-gradvatten) per prov. Alikvot 10 μL per brunn, täck över och förvara vid 4 ° c tills den är klar för sortering.
- Kör den negativa kontrollen i cell Sorteraren och analysera hela provet.
- Ställ in flödescytometrigrindar för att isolera lämpliga cellpopulationer för enkel cell sortering.
- Plot FSC område vs SSC område och sätta Gate R1 att isolera lymfocyter.
- Plot FSC höjd vs FSC bredd och set Gate R3 för att utesluta FSC-doublets.
- Plot SSC höjd vs SSC bredd och set Gate R4 att utesluta SSC doublets.
- Plot SSC höjd vs DAPI och Ställ Gate R5 att isolera levande celler (DAPI-).
- Rita IgG vs CD19 och Ställ Gate R6 för att isolera IgG+ B-celler (CD19+ IgG+).
- Plot IgG vs CD27 och Ställ Gate R7 att välja minne B-celler (CD27hög).
- Plot antigen-PE (AG-PE) vs antigen-APC (AG-APC) och Ställ Gate R8 som en AG-PE+/AG-APC+ kvadrant med ett lågt antal händelser i den dubbla positiva porten.
- Ställ in flödescytometrigrindar för att isolera lämpliga cellpopulationer för enkel cell sortering.
- Samla in lika många minnesceller från det antigen-positiva (AG+) provet för bestämning av signal till brus.
- Sortera enstaka celler med fenotyp CD19+ CD27+ AG-PE+ AG-APC+ (Gate R8) i beredda 96-och PCR-plattor.
- Täck plattor med aluminium tejp kuddar, Centrifugera i 1 min vid 400 x g, och lagra vid-80 ° c för framtida kloning.
- Förbered 48 brunnar med 96-och PCR-plattor för sortering.
3. kloning av enstaka celler
-
Omvända transkriptionsreaktioner
- Ta bort den enda B-cell sorterings plattan från 80 ° c. Tina på is för 2 min. snurra plattan i 2 min vid 3 300 x g för att poolinnehållet i botten av brunnarna innan öppningen.
- Förbered en dNTP/buffert Master Mix med 10% icke-joniska rengöringsmedel och oligo (dT) som omvänd primer. Tillsätt enzym blandningen i varje brunn som innehåller den enda cellen och blanda inte.
- Inkubera 5 min vid 65 ° c. Tillsätt enzym Master Mix som innehåller 100 mM DTT, RNase inhibitor, och omvänt transkriptas enzym för att få total volym till 20 μL. Inkubera 10 min vid 50 ° c, sedan 10 min vid 80 ° c.
- Överför till Ice innan du påbörjar PCR-steg
-
Kapslade PCR-reaktioner med flera steg
- Använd separata kapslade PCR-reaktioner används för tung kedja (HC) och ljus kedje förstärkning (LC).
- För den första omgången av PCR-amplifiering (steg I), Använd en pool av framåtprimers och en enda omvänd primer för att förstärka de variabla regionerna HC och LC i separata PCR-reaktioner (figur 2). Genom design, kommer poolen av framåt primers förstärka en stor andel av köns cells ledare (L) sekvenser och omvänd primer är specifik för nedströms konstant regioner i varje kedja, inklusive både kappa (κ) och lambda (λ) för lätta kedjor16.
- Använd 2,5 μL cDNA-produkt som mall för varje PCR-reaktion (steg I). Tillsätt primrar till den slutliga reaktions koncentrationen på 1 μM för varje. Dubbla 10X polymeras buffert till 2x koncentration, ta den slutliga volymen till 25 μl per reaktion. Kör HC PCR-reaktioner med [94 ° c/4 min; 94 ° c/15 s, 55 ° c/20 s, 68 ° c/60 s; 68 ° c/3 min] för 50 cykler. Kör LC PCR-reaktioner med [98 ° c/4 min; 98 ° c/15 s, 72 ° c/20 s, 72 ° c/60 s; 72 ° c/3 min] för 50 cykler.
- Använd 2,5 μL av steg I-produkten som mall för varje (steg II) PCR-reaktion. Lägg till poolen med framåtprimers som är specifika för RAM 1-regionen HC och LC (κ och λ) och en pool med omvänd primers som är specifik för knutpunkten för varje antikropps kedja. Dubbla 10X polymeras buffert till 2x koncentration, och köra PCR-reaktioner 50 cykler vardera med samma parametrar som steg I.
- Kör de avslutade PCR-reaktionerna på 1% agaros gel för att visualisera positiva amplifieringsträffar. Återskapa Parade amplikonerna (både tung och lätt kedja från samma cell) och isolera via gel utvinning. Bestäm DNA-fragment koncentration via OD260 för noggrann ligering mix beräkningar.
- Kombinera återvunna tunga och lätta kedje fragment med en länkare fragment och uttrycket vektor stamnät med hjälp av en 4-fragment ligering reaktion med en kommersiell kit.
- Omvandla ligeringreaktioner till kemiskt kompetenta bakterier med hjälp av en kommersiell sats. En gång pläterad på antibiotika plattor, tillsätt 4 mL av tillväxt medier (med antibiotika) till den kvarvarande omvandlings kulturen, och inkubera 37 ° c över natten vid 250 RPM. Detta är "ligation mix kulturen."
- Förbered miniprep DNA från över natten ligering mix kulturer med hjälp av en kommersiell kit, och bestämma den resulterande plasmid DNA-koncentrationen.
4. ELISA-skärm för bekräftelse av antigen-specificitet
-
Transfect 10 μg miniprep-DNA med katjonbaserat reagens i 10 mL suspension 293-celler och inkubera i 3-4 dagar vid 37 ° c (8% CO2) medan du roterar vid 125 RPM. För skörd, Centrifugera kultur 10 min vid 1 000 x g och återvinna förtydligat media.
- Mät IgG-koncentrationen i supernatanterna via affinitet till protein A.
- Testa varje IgG (i supernatanten) vid 20 μg/ml genom enzymkopplad adsorbent assay (Elisa) mot de enskilda peptider som används för sorteringen, fångade på en konjugerat-platta eller aktin som en negativ kontroll. Använd en get anti-human peroxidas sekundär antikropp mot humant IgG fab för att detektera rekombinanta kloner. Efter subtraktion av bakgrunden definieras OD > 0,5 som skärm positiv.
- Bekräfta skärmen positiva träffar genom att utföra en ytterligare ELISA, med hjälp av utspädningar av IgG supernatanten att generera en koncentrations kurva börjar vid 20 μg per mL, och plottning mot OD för varje antigen som visar reaktivitet i den initiala skärmen ELISA.
Representative Results
Denna metod omfattar en process i flera steg för att isolera antigen-specifika antikroppar från humana givare. I de representativa data som visas här inkuberades celler med en pool av fluorescerande-märkta peptider som representerar flera olika domäner av Tau-proteinet, inklusive fosforylerade peptider för att efterlikna de förmodade fosforylationssajterna. Dessa peptider användes som "bete" för att identifiera celler som är reaktiva med Tau epitopes (s) av intresse. Som förberedelse för sortering användes en panel av fluorescerande-märkta fenotypiska markörer för att identifiera olika cellpopulationer inom den berikade B-cellspopulationen. En serie av flödescytometrianalys grindar utformades för att isolera mål minnet B-celler (figur 1). Lymfocyter isolerades baserat på deras Cellstorlek och granularitet med hjälp av Forward scatter (FSC) och Side scatter (SSC) tomter i Flow flödescytometrianalys6,7. Efter uteslutning av flera celler ("doublets") och döda celler, fenotypiska markörer tillät segregering av IgG+ minne b celler via IgG, CD19 (B-cell) och CD27 (minne). I den här metoden distribuerar CD27 markören inte i två diskreta populationer, så de översta 45% av CD27+ uttrycker celler ingår för den sista porten. Slutligen, celler dubbelt positiva för både APC och PE fluorophores fördela i den övre högra kvadranten av gating grafen, vilket indikerar reaktivitet till båda märkta versioner av peptider. De celler som föll inom den dragna grinden isolerades och sorteras i enskilda brunnar i en 96-brunn plattan. Användningen av antigen med två olika etiketter ökar signal-brus-förhållandet och minskar antalet falska positiva identifieringar i den efterföljande molekylbiologiska processen. De sorterade cellerna representerade cirka 0,1% av minnet B-celler i den slutliga grinden, och 0,001% av startcell provet.
Den första avläsningen av en enda cell kloning är en bekräftelse av amplifiering av de respektive tunga och lätta variabel kedjorna (figur 2). Eftersom ihopkopplad återhämtning av båda amplikonerna önskas, PCR-reaktionerna utvärderas sida vid sida på Agros gel, och matchade par är censurerade från gelen och DNA-fragment extraheras. Typisk effektivitet amplifiering är 30-50% tung kedja och 50-70% Light (kappa) kedja. Återhämtning av Parade amplikonerna är vanligtvis mellan 25-40% effektivitet. Dessa effektivitetsvinster varierar mellan givar bassänger och de representativa uppgifterna (figur 3) är ett exempel på mycket effektiv förstärkning från 24 enskilda celler (42% Parade återhämtning). Efter IgG-kloning är IgG-uttrycksvektorn transfekterade till mänskliga embryonala njure (HEK-293) suspensions celler, som används för att maximera uttrycket. Användningen av serumfritt medium minskar kontaminerande proteiner från den rekombinanta antikroppen prep, och hjälper till att minimera bullret i efterföljande bindande analyser. De återvunna antikropparna screenas mot den ursprungliga panelen av Tau-peptider och görs för reaktivitet av ELISA (figur 4). Ett initialt tröskelvärde för OD = 0,5 ovan bakgrund används för att indikera positiv antigen reaktivitet, och β-Actin protein används som en kontroll för icke-specifik bindning. Om flödescytometri och sorterings steg använder en blandad pool av peptider, är screening ELISA det första steget i att deconvoluting specifika reaktivitet av de återvunna IgGs. Tre av de 10 IgGs som analyseras visade reaktivitet mot fosforylerad CBTAU 22,1-peptid, och en var reaktiv till icke-fosforylerade CBTAU 27,1 (figur 4A). Ytterligare bekräftelse slutfördes med hjälp av en koncentrations kurva av samma rekombinanta antikropps prov mot de peptider som identifierades i den initiala skärmen, och en ytterligare peptid som en negativ kontroll (figur 4B). För varje positiv träff isolerades en individuell plasmid-klon från den omvandlade poolen och bekräftades på nytt med samma ELISA-metod. Endast klon 34 visas de data som presenteras, och medan reaktivitet till icke-fosforylerade CBTAU 27,1 bekräftades, observerades lägre affinitetsbindning också med fosforylerade 27,1 peptid (figur 4C).
Figur 1 : Isolering av antigen-reaktiva singelceller via flödescytometri. (A) visas är en representativ tomt där lymfocytpopulationen fanns i den dragna grinden. (B) grindar baserade på framåt-och sido scatter (FSC-höjd v FSC-width (R3); SSC-höjd v SSC-width (R4)) användes för att utesluta dubbletter. Endast celler inom dragna grindar utvärderades i efterföljande tomter. DAPI+ -celler ansågs döda och exkluderade (R5). I detta experiment förhördes 3,7 x 107 "levande" celler. Majoriteten av de levande cellerna var B-celler (CD19+) och IgG+ -celler (4,66%) isolerats från denna population (R6). Den översta 43,2% av CD27+-uttrycker minne celler ingick i valet Gate (R7). (C) kvadrant 2 (Q2) innehöll celler reaktiva till båda märkta antigener (peptid-APC v peptid-PE), och dessa celler var sorteras och återvinnas individuellt i en 96-brunn tallrik. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : PCR-amplifiering återvinner IgG Heavy och Light variabel sekvens för kloning. (A) både tunga (VH) och lätta (VK eller VL) kedjans variabla regioner återvinns med kapslade PCR-reaktioner. Steg I primers förstärker framåt från den infödda ledaren sekvens och omvänd från inom den konstanta regionen. Flera pilar representerar en pool av mellan 7-12 primers, som används för att säkerställa en bred täckning av möjliga germlines. Steg II-primers är kapslade, specifika för extrema ändar av variabeln öppna läsbild, och lägga till sekvens till ändarna av amplikonerna som är homolog till angränsande sekvens i uttrycket vektorn. (B) länkaren består av den konstanta ljus kedjan (ck eller cl), följt av den tunga kedje promotorn och en icke-ursprunglig signalpeptidsekvens. Amplicons, Linker och plasmid ryggrad är samtidigt och ligaturer via överlappande homolog sekvens som genereras under steg II PCR amplifiering, och isolerade som en intakt plasmid. De rekombinanta tunga och lätta kedjorna i den slutliga uttrycks vektorn drivs av oberoende (och identiska) CMV-projektansvariga och översätts som separata proteiner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : IgG tunga och lätta variabla kedjor amplikonerna återvinns från enskilda celler. De kapslade PCR-reaktionerna (steg II) laddades direkt på 1% agastengel och visualiserades. Tung kedja (H) och kappa ljus kedja (L) PCR-reaktioner från samma cell lastades i angränsande brunnar så Parade amplikonerna var lätt observeras. Framgångsrika tunga och lätta kedje produkter är ungefär 400 BP och 350 BP respektive. Lyckad återhämtning av Parade amplikonerna betecknas med en (*). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Antigen specificitet bekräftas av rekombinanta IgGs. Plasmider som innehåller de återvunna tunga och lätta kedjesekvenser transfekterade till hek-celler för uttryck. Efter fyra dagar bedöms rekombinanta antikroppar för reaktivitet av ELISA. AIgG-koncentrationen i de klargjorda medierna mättes och späddes till 20 μg/ml. Den pool av peptider som används för sortering bedömdes individuellt med hjälp av 40 pmol per brunn i konjugerat plattor. Alla IgGs testades i dubbla brunnar. (B) kloner som visade OD450 mätning > 0,5 bedömdes på nytt (kloner #32, #34, #35) med 1:5 utspädningssteg mot de peptider som identifierats på skärmen. (C) en gång bekräftades som en träff, en enda plasmid klon isolerades från klon #34 omvandlade ligationer, transfected, och BEKRÄFTADES av Elisa. Detsamma gjordes för kloner #32 och #35 (data visas inte). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Den metod som presenteras här kombinerar flödescytometri och Single cell kloning, och de metoder vi beskriver här bygger vi på metoder som tidigare utvecklats av Tiller och kollegor11. Deras arbete beskriver återhämtning och kloning av monoklonala antikroppar för att studera B-cellrepertoaren hos människor på individ cellernas nivå. Vi har anpassat de viktigaste komponenterna i deras process för att möjliggöra återvinning av antigen-specifika monoklonala antikroppar från en population av minne B-celler, inklusive multi-Step amplifiering primer strategi. Den stora modifieringen är tillsatsen av märkt antigen "bete". Ytterligare anpassningar har gjorts i det offentliggjorda protokollet, inklusive (men inte begränsat till) ändring av ryggraden i klonings vektorn till ett enda uttryck plasmid, ytterligare primer täckning av köns cells repertoar (både Leader sekvens och RAM 1), transfektion av suspension HEK293 celler för högre uttryck, och användning av HiFi-polymeraser under PCR amplifiering.
För de metoder som beskrivs här är de mest kritiska stegen nära övergången mellan flödescytometri och enkel cell kloning. Först, rätt placering av sorterade enstaka celler i plattan är viktigt. Att ställa in dropp fördröjningen korrekt på Sorteraren är ett avgörande steg. Miljöfaktorer, såsom låg luftfuktighet, måste också beaktas, eftersom vi har funnit vår återhämtning effektivitet sjunka betydligt om inte en statisk pistol används på mål sorterings plattorna. Efter cell placering centrifugeras plattorna för att säkerställa att cellerna har kontaktat 10 μL buffert i botten av brunnarna. Alla dessa åtgärder är avgörande för att molekylärbiologi portion ska lyckas. Om förutsättningarna är suboptimala för omvänd Transkription av en enda cell kan PCR-amplifiering av även β-Actin vara svårt. Styrkan i den metod som presenteras är förmågan att förhöra miljontals celler och bara sortera de som matchar antigen reaktivitet kriterier mot antigen val. Detta kräver att signal-brus-förhållandet är så högt som möjligt, vilket görs genom att optimera betes koncentrationen före sortering. Dual-märkta bete används för att minska återhämtningen av falskt positiva celler, vilket kan inträffa om en av de fluoroforer har hög bakgrund. Använda mer än en antigen bete kan göra signalen: buller optimering svårare, men förmågan att förhöra flera peptider samtidigt är en annan fördel med denna metod.
När återhämtnings effektiviteten är låg används en uppsättning kapslade β-Actin primers för att bekräfta att cDNA-mallen finns. Nackdelen med detta tillvägagångssätt är att det är svårt att avgöra om det inte fanns någon cell som finns i brunnen eller omvänd Transkription reaktionen misslyckades, vilket gör felsökning svårt. Ibland kommer motsatsen att inträffa och effektivitetsvinsterna är högre än väntat. Den typiska återhämtningen för tung kedja är mellan 30-45% och lätta kedjor är högre, mellan 40-60%. Varje PCR-reaktion (steg I & II) använder 50 cykler för att förstärka från en enda cell. Det stora antalet cykler gör också denna metod mottaglig för kontaminering. Sekvensanalys av amplikonerna kan användas för att avgöra om ett främmande ämne har införts, eller en ovanligt hög återvinningsgrad har legitimt uppnåtts.
Nyttan av denna metod för att återvinna infödda mänskliga antikroppar mot ett antigen val har flera betydande begränsningar. Först kan endast lösliga proteiner som kan märkas användas som "bete" för flödescytometri. För de typer som presenteras i representativa resultat, använde vi en serie syntetiserade överlappande peptider från tau-protein, eftersom användning av hela proteinet visat sig svårt. Användningen av linjära peptider är sannolikt inte optimal, eftersom det kan begränsa identifieringen av antikroppar mot icke-linjära eller strukturella epitoper. Men vi kunde identifiera flera unika antikroppar mot Tau och dessa genomgår för närvarande ytterligare utvärdering8,9. En annan begränsning är den låga genomströmningen av molekylärbiologisk återhämtning och kloning av IgGs. Den ursprungliga sorterings strategin möjliggör screening av miljontals celler, men den efterföljande molekylärbiologiska bearbetningen består av flera stadier. Pågående optimering ansträngningar för att införliva nyare teknik, såsom Gibson Assembly10 har effektiviserat flera steg, men flaskhalsen förblir kloning enskilda tunga och lätta kedje par.
Metoden "bselex" utnyttjar BCR uttryckt på ytan av minnet B-celler för att identifiera celler som visar antigen reaktivitet, och sedan återvinna dessa enskilda celler via flödescytometri11,12. På grund av detta beroende av BCR, metoden är begränsad till minne B cell facket, och inte fånga antikroppar utsöndring celler (ASCs) såsom plasmabjumbor. Detta tillvägagångssätt kan dock vara fördelaktigt att återvinna en bredare repertoar av antigen-specifika immunoglobins jämfört med ASCs. Influensavaccination studier visar att även reaktiva ASCs kan domineras av ett litet antal expanderade B-cellkloner, den antigen-specifika minne B cellpopulation är sällan klon12. T-cellreceptorn (TCR) på ytan av T-celler besitter likheter med B-cellreceptorn i gen arrangemang och rekombination för att maximera mångfalden. Single cell-metoder som liknar vad som beskrivs i den metod som presenteras här har utvecklats för att bedöma T-cellrepertoaren, inklusive återhämtning och Single cell kloning av alfa-och beta kedjor13. Emellertid, TCR erkännande kräver peptider som skall presenteras av MHC molekyler, lägga till betydande komplexitet till den märkta bete strategi för att identifiera peptid-specifika T-celler. Till skillnad från B-celler, T-celler inte genomgår affinitet mogningen av hela variabel regionen, så identifiering av den korta CDR3 regionen och vissa kompletterande sekvens är allt som krävs för identifiering och beredning. Slutligen beskriver denna metod identifieringen av IgG-molekyler med flödescytometri, men det är också möjligt att använda alternativa fenotypiska markörer för att identifiera B-celler av olika isotyper.
För närvarande finns det metoder som utvecklas för att ansluta den enorma mängd data som samlats in från nästa generations sekvensering med funktionell analys av antigen specificitet, men dessa metoder är fortfarande förfinas. Trots sina begränsningar har den metod som beskrivs här använts för att identifiera antikroppar med potentiellt terapeutiskt värde för både smittsamma och icke-smittsamma sjukdomar8,14,15, och utgör en tillförlitlig metod för att återvinna relevanta antigen-specifika IgGs från människor, utan omfattande manipulation av B-celler eller omfattande cellkultur.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja
Acknowledgments
Författarna vill tacka Lucy Chammas, Martha Costa, Julie Kim, Nancy Heredia, och Jeremy Macedo för omfattande tester av många metodändringar och förfining av den nuvarande BSelex plattformen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter | MoFlo | cell sorting | |
| Biotinylated peptides | New England Peptide | Cell sorting "bait" | |
| Micro Bio-spin P30 gel column | BioRad | #7326223 | |
| Streptavidin (R-PE) | Thermo Scientific | SA10041 | |
| Streptavidin (APC) | Thermo Scientific | S32362 | |
| CD22 MicroBeads, human | Miltenyi | #130-046-401 | |
| LS columns | Miltenyi | #130-042-401 | |
| Pre separation filters | Miltenyi | #130-041-407 | |
| PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19 | BD Biosciences | BD#340951 | |
| PE-Cy7 mouse anti-human CD27 | BD Biosciences | #560609 | |
| FITC mouse anti-human IgG | BD Biosciences | #560952 | |
| DAPI | Life Technologies | #D21490 | |
| RNaseOUT | Life Technologies | #10777-019 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | Sigma | #A4503 | |
| RPMI media | Hyclone | #SH30096.01 | |
| HI FBS (Fetal bovine serum) | Invitrogen | #10082147 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | Model #6325 | PCR machine |
| PCR 96-well plates | Phenix | MPS-500 | |
| PCR Plate mats | Phenix | SMX-PCR96 | |
| Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix | Clontech | #639125 | |
| Superscript IV First-strand synthesis system | Invitrogen | #18091050 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Scientific | F-531-L | |
| Platinum polymerase | Invitrogen | #10966108 | |
| Nuclease-free water | QIAGEN | #129114 | |
| Oligonucleotide primers | IDT | assorted | Primers for all PCR steps |
| Gel Extraction Kit | QIAGEN | #28706 | |
| PCR Purification kit | QIAGEN | #28106 | |
| Miniprep Kit | QIAGEN | #27106 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Gibson assembly |
| Expi293 Expression Media | Invitrogen | #A14351-01 | |
| ExpiFectamine 293 Transfection Kit | Invitrogen | #A14525 | |
| Opti-MEM Media | Invitrogen | #31985070 | |
| CO2 incubator (Multitron) | |||
| Octet RED384 System | Pall/ Forte Bio | ||
| Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates | Thermo Scientific | #15500 | |
| Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area | Corning | #3690 | |
| Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody | Jackson Labs | #109-036-097 | |
| Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody | Jackson Labs | #115-035-072 | |
| SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component) | KPL | #52-00-03 | |
| TMB Stop Solution | KPL | #50-85-06 |
References
- Su, K. Y., Watanabe, A., Yeh, C. H., Kelsoe, G., Kuraoka, M. Efficient Culture of Human Naive and Memory B Cells for Use as APCs. Journal of Immunology. 197 (10), 4163-4176 (2016).
- Corti, D., Lanzavecchia, A. Broadly neutralizing antiviral antibodies. Annual Review of Immunology. 31, 705-742 (2013).
- Steinitz, M., Klein, G., Koskimies, S., Makel, O. EB virus-induced B lymphocyte cell lines producing specific antibody. Nature. 269 (5627), 420-422 (1977).
- Bloom, A. D., Nakamura, F. T. Establishment of a tetraploid, immunoglobulin-producing cell line from the hybridization of two human lymphocyte lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2689-2692 (1974).
- Olsson, L., Kaplan, H. S. Human-human hybridomas producing monoclonal antibodies of predefined antigenic specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (9), 5429-5431 (1980).
- Lechner, J., et al. Alterations in Circulating Immune Cells in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. Scientific Reports. 5, 16754 (2015).
- Loken, M. R., Brosnan, J. M., Bach, B. A., Ault, K. A. Establishing optimal lymphocyte gates for immunophenotyping by flow cytometry. Cytometry. 11 (4), 453-459 (1990).
- Pascual, G., et al. Immunological memory to hyperphosphorylated tau in asymptomatic individuals. Acta Neuropathologica. 133 (5), 767-783 (2017).
- van Ameijde, J., et al. Enhancement of therapeutic potential of a naturally occurring human antibody targeting a phosphorylated Ser(422) containing epitope on pathological tau. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 59 (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. Journal of Immunological Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Wrammert, J., et al. Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus. Nature. 453 (7195), 667-671 (2008).
- Han, A., Glanville, J., Hansmann, L., Davis, M. M. Linking T-cell receptor sequence to functional phenotype at the single-cell level. Nature Biotechnology. 32 (7), 684-692 (2014).
- Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).
- Jones, H. G., et al. Structural basis for recognition of the central conserved region of RSV G by neutralizing human antibodies. PLoS Pathogens. 14 (3), 1006935 (2018).
- Janssen Vaccines & Prevention B.B. US patent. , U.S. Patent Application No. 20170210787, Published July 27, 2017 (2017).
