Summary
Den BSelex metoden for å identifisere og gjenopprette individuelle antigen-spesifikke antistoffer fra humant perifere blod mononukleære celler kombinerer flyt flowcytometri med enkelt celle PCR og kloning.
Abstract
Repertoaret av menneskelige antistoffer representerer en stor grad av de ubrukte kildene til terapeutiske antistoffer og nyttige biomarkører. Mens dagens beregningsorientert metoder, for eksempel neste generasjons sekvensering (NGS), gir enorme sett med data på antistoff repertoar på sekvens nivå, funksjonelle data er nødvendig for å identifisere hvilke sekvenser som er relevante for et bestemt antigen eller sett av Antigener. Her beskriver vi en metode for å identifisere og gjenopprette individuelle antigen-spesifikke antistoffer fra perifert blod mononukleære celler (Pbmc) fra en menneskelig blodgiver. Denne metoden utnytter en innledende berikelse av eldre B-celler og krever en kombinasjon av fenotypiske celle markører og fluorescensmerkete-merket protein for å isolere IgG minne B-celler via Flow flowcytometri. De tunge og lette kjede variabel regionene blir deretter klonet og re-skjermet. Selv om begrenset til minnet B celle rom, denne metoden utnytter Flow flowcytometri å avhøre millioner av B-celler og returnerer sammenkoblede tunge og lys kjede sekvenser fra en enkelt celle i et format klar for uttrykk og bekreftelse av spesifisitet. Antistoffer utvinnes med denne metoden kan vurderes for terapeutisk potensial, men kan også koble spesifisitet og funksjon med Bioinformatic tilnærminger for å vurdere B-cellen repertoar i individer.
Introduction
Antistoffer er en voksende klasse av terapeutiske molekyler, og den eksisterende B-cellen repertoar i ethvert menneske er en potensiell kilde til slike antistoffer. Når utvinnes fra en menneskelig donor, de krever ingen tilpasning eller "menneskeliggjøring", trinn som er nødvendig for antistoffer generert i andre dyre systemer. Det finnes flere metoder for identifisering og isolering av menneskelige antistoffer, inkludert B celle aktivering og spredning1, immortalization via EBV transformasjon2,3og generering av hybridoma cellelinjer4 ,5. Imidlertid krever alle disse metodene omfattende cellekultur til skjermen og gjenopprette antigen-spesifikke antistoffer. Informasjon om menneskets antistoff repertoar har blitt kraftig utvidet med utviklingen av neste generasjons sekvensering (NGS) teknologi, slik at identifisering av massive mengder individuelle sekvenser til stede i donor prøver. Men fordi NGS gir en likegyldig visning av alle sekvenser til stede, tillater det ikke for identifisering og isolering av antigen-spesifikke antistoffer, spesielt i tilfelle av sjeldne eller lavfrekvente antistoffer.
Formålet med "BSelex"-metoden er å identifisere antigen-spesifikke antistoffer fra sirkulerende perifere blod mononukleære celler i menneskelige donorer, og isolere og gjenopprette sekvenser av disse antistoffene for videre analyse. Denne metoden utnytter flyt flowcytometri og celle sortering å dra nytte av B-cellen reseptor (BCR) uttrykt på overflaten av minnet B-celler. Millioner av B-celler kan bli vist for antigen-spesifisitet via Flow flowcytometri før mer lav gjennomstrømming molekylærbiologi metoder er initiert. Sammenkoblet tung og lett kjede identifisering er ikke mulig i de fleste NGS-metoder, som analyserer celle sekvenser i bulk. I metoden beskriver vi her, celler er isolert individuelt, og sammenkoblet utvinning av både tunge og lette kjede sekvenser er mulig, som tillater direkte kloning og uttrykk for full IgG.
Protocol
Bruken av prøver fra frivillige fulgte protokoller godkjent av The Scripps Research Institute institusjonelle gjennomgang Board. Informert samtykke ble innhentet fra givere før blod donasjon.
1. forberedelse av reagens
-
Perifert blod mononukleære celler (Pbmc)
- Gjenopprette perifere blod mononukleære celler fra normale menneskelige donorer ved Ficoll-plakk Plus isolasjon. Lagre nedfryste på 50 000 000 celler/mL i 90% fosterets storfe serum (FBS) og 10% dimethyl sulfoxide (DMSO). Frys cellene ved-80 ° c og Overfør til flytende nitrogen for langtidslagring.
-
Merking mål antigen peptider for sortering
- Generer eller Hent peptider som er spesifikke for mål proteinet (opptil 70 rester lang) med en Terminal biotin.
- Label 4 nmol av hver enkelt biotinylated peptid med streptavidin covalently festet til PE (R-fykoerytrin) eller APC (allofykocyanin) i separate rør. Forbered deg med en molar ratio på 9:1 peptid til streptavidin (SA), med en endelig konsentrasjon på cirka 3,2 μM for SA-PE og 5,7 μM SA-APC. Forbered biotin-tetramers som en negativ kontroll.
- Ruge hver peptid Mix over natten, i mørket, ved 4 ° c med langsom miksing.
- Fjern ubundne fluoroforen ved å sende merkede peptider gjennom microcolumns som inneholder polyakrylamid perler.
- Oppbevar peptid-tetramers opptil 2 måneder ved 4 ° c.
2. celle sortering
- Minst 1 t opp til 16 timer før CD22 + isolasjon, tine donor Pbmc og la hvile ved 37 ° c.
- Fjern hetteglassene med frosne Pbmc fra fryseren og Overfør umiddelbart til et vannbad på 37 ° c. Når hetteglassene er nesten tint, Overfør til arbeidsområdet.
- Overfør innholdet i hvert hetteglass til et 50 mL rør som inneholder prewarmed medium (holde giverne atskilt). Legg medium til et endelig volum på 50 mL. Bland innholdet forsiktig.
- Sentrifuger ved 370 x g i 6 min ved romtemperatur. Kast supernatanten, resuspend cellene i 15 mL RPMI komplett medium og utføre en celle telling.
- Juster celle konsentrasjonen til 2,0 x 107 celler/ml med RPMI komplett medium, og Overfør celler til en T75 kolbe eller større og ruge ved 37 ° c i minst 1 t og opp til 16 h for å tillate utvinning tid for tint celler.
- Samle cellene (pooling hvis ønskelig) og sentrifuge ved 370 x g i 6 min ved 4 ° c. Kast supernatanten og resuspend cellene i 5 mL av iskald MACS buffer (PBS, pH 7,6 som inneholder 0,5% BSA og 2 mM EDTA), Bring til 50 mL med MACS buffer og utfører en celle telling.
- Sentrifuger cellene ved 400 x g i 7 min ved 4 ° c.
- Isolere CD22+ B celler ved positiv markering via fangst på CD22 mikroperler. Bruk MACS buffer for alle vasker. Count og sentrifuger 400 x g i 7 min ved 4 ° c. Den forventede utvinningen er 5-10% av den totale PBMC befolkningen.
- Resuspend celler på 40 000 000 per mL FACS buffer (Tris buffer, pH 8,0 inneholder 0,5% BSA og 2 mM EDTA) og fortsette med celle farging av giverne individuelt eller som et basseng.
- Stain celler for minne B celle sortering
- Fjern en alikvot av celler for flowcytometer satt opp og kompensasjon for hver av de merkings fluorophores som brukes. Inkluder unstained celler som en kontroll.
- Beregn det endelige farge volumet for antallet CD22+ celler (farging 2 000 000 per 100 μL).
- Legg til ekstracellulære markører for B-celler (CD19-PerCP-CY 5.5), IgG (IgG-FITC) og minne kammer (CD27-PECy7) som per produsentens fortynning anbefalinger, og bland forsiktig. Alikvot 107 -celler til en 1,5 ml slange for negativ kontroll og Overfør de resterende cellene til en 15 ml tube.
- Legg dobbelt merket biotin-SA-tetramers til det negative kontroll røret ved en endelig konsentrasjon på 36 nM hver for PE og APC multiplisert med antall peptider i slag røret og bringe volumet til 0,5 mL finalen med FACS buffer (f. eks 10 peptider x 36 nM = 360 nM).
- Tilsett peptid tetramers til sort tube på 36 nM hver for PE og APC og bringe cellene til 2x106 per 100 ΜL med TBS buffer. Ruge ved 4 ° c i mørket og med skånsom rotasjon i 30-60 min.
- Vask 2x ved 4 ° c, 400 x g, 7 min, og fjern en alikvot for å telle før siste vask. Filtrer celler ved hjelp av 5 mL filter deksel rør. Legg til DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) beis til 0,3 μM endelige konsentrasjon like før sortering som en markør av celle membran integritet.
- Enkelt celle sortering via Flow flowcytometri
- Forbered 48 brønner på 96-brønn PCR plater for sortering.
- Forbered en Master Mix: (2 μL av 10x RT buffer, 0,5 μL av RNase-hemmer, 7,5 μL av steril PCR-grade vann) per prøve. Alikvot 10 μL per brønn, dekk og oppbevares ved 4 ° c til det er klart til sortering.
- Kjør den negative kontrollen i celle sorteringen, og analyser hele eksemplet.
- Angi flyt flowcytometri porter for å isolere de aktuelle celle populasjoner for enkel celle sortering.
- Plot FSC området vs SSC området og satt gate R1 å isolere lymfocytter.
- Plot FSC høyde vs FSC bredde og satt gate R3 å ekskludere FSC doublets.
- Plot SSC høyde vs SSC bredde og angi gate R4 til å ekskludere SSC doublets.
- Plot SSC høyde vs DAPI og sette gate R5 å isolere levende celler (DAPI-).
- Plott IgG vs CD19 og sett gate R6 for å isolere IgG+ B-celler (CD19+ IgG+).
- Plot IgG vs CD27 og sett gate R7 å velge minne B-celler (CD27høy).
- Plot antigen-PE (AG-PE) vs antigen-APC (AG-APC) og sette gate R8 som AG-PE+/AG-APC+ kvadrant med et lavt antall hendelser i den doble positive gate.
- Angi flyt flowcytometri porter for å isolere de aktuelle celle populasjoner for enkel celle sortering.
- Samle et likt antall minne celler fra antigen-positive (AG+) sample for fastsettelse av signal til støy.
- Sorter enkeltceller har fenotype CD19+ CD27+ AG-PE+ AG-APC+ (gate R8) i forberedt 96-brønn PCR plater.
- Dekkplater med aluminiumsbånd pads, sentrifuger for 1 min ved 400 x g, og lagre ved-80 ° c for fremtidig kloning.
- Forbered 48 brønner på 96-brønn PCR plater for sortering.
3. enkelt celle kloning
-
Omvendt transkripsjon reaksjoner
- Fjern den enkle B-cellens sorterings plate fra 80 ° c. Tin på isen i 2 min. spinn platen i 2 minutter ved 3 300 x g til basseng innholdet i bunnen av brønnene før åpning.
- Forbered en dNTP/buffer Master Mix med 10% ikke-ioniske vaskemiddel og oligo (dT) som omvendt primer. Legg enzym miks til hver brønn som inneholder enkelt celle og ikke bland.
- Ruge 5 min ved 65 ° c. Legg enzym Master Mix inneholder 100 mM DTT, RNase inhibitor, og revers transkriptase enzym for å bringe totalt volum til 20 μL. ruge 10 min ved 50 ° c, deretter 10 min ved 80 ° c.
- Transport til is før du starter PCR-trinnene
-
Flertrinns nestede PCR-reaksjoner
- Bruk separate nestede PCR-reaksjoner brukes til tung kjede (HC) og lett kjede (LC) forsterkning.
- For den første runden av PCR forsterkning (Step I), bruk en pool av fremover primere og en enkelt omvendt primer for å forsterke HC og LC variable regioner i separate PCR reaksjoner (figur 2). Ved design, vil bassenget av fremover primere forsterke en stor andel av germline leder (L) sekvenser og omvendt primer er spesifikk for nedstrøms konstant regioner av hver kjede, inkludert både Kappa (ĸ) og lambda (λ) for lys kjeder16.
- Bruk 2,5 μL av cDNA produkt som mal for hver PCR (Step I) reaksjon. Legg til primere i den endelige reaksjons konsentrasjonen på 1 μM for hver av dem. Dobbel 10x polymerase buffer til 2x konsentrasjon, bringe det endelige volumet til 25 μL per reaksjon. Kjør HC PCR-reaksjoner ved hjelp av [94 ° c/4 min. 94 ° c/15 s, 55 ° c/20 s, 68 ° c/60 s; 68 ° c/3 min] for 50 sykluser. Kjør LC PCR-reaksjoner ved hjelp av [98 ° c/4 min. 98 ° c/15 s, 72 ° c/20 s, 72 ° c/60 s; 72 ° c/3 min] for 50 sykluser.
- Bruk 2,5 μL av Step I-produktet som mal for hver (trinn II) PCR-reaksjon. Legg til utvalget av fremover primere spesifikke for HC og LC (ĸ og λ) rammeverk 1 regionen og en pool av omvendt primere spesifikke for krysset regionen for hver antistoff kjede. Doble 10x polymerase buffer til 2x konsentrasjon, og kjøre PCR reaksjoner 50 sykluser hver ved hjelp av de samme parametrene som Step I.
- Kjør de fullførte PCR-reaksjonene på 1% agarose gel for å visualisere positive forsterknings treff. Gjenopprett sammenkoblede amplicons (både tung og lett kjede fra samme celle) og Isoler via gel-ekstraksjon. Bestem konsentrasjonen av DNA-fragment via OD260 for nøyaktig ligation blandings beregninger.
- Kombiner gjenopprettede tunge og lette kjede fragmenter med en linker fragment og uttrykket vektor ryggraden ved hjelp av en 4-fragment ligation reaksjon ved hjelp av en kommersiell Kit.
- Forvandle ligation reaksjoner til kjemisk kompetente bakterier ved hjelp av et kommersielt sett. Når belagt på antibiotika plater, tilsett 4 mL vekst Media (med antibiotika) til gjenværende transformasjon kultur, og ruge 37 ° c over natten på 250 RPM. Dette er "ligation Mix kultur."
- Forbered miniprep DNA fra natten ligation blanding kulturer ved hjelp av en kommersiell Kit, og bestemme den resulterende plasmider DNA konsentrasjon.
4. ELISA Screen for bekreftelse av antigen-spesifisitet
-
Transfect 10 μg av miniprep DNA med kationiske lipid-basert reagens i 10 mL suspensjon 293 celler, og ruge for 3-4 dager ved 37 ° c (8% CO2) mens roterende ved 125 RPM. For innhøsting, sentrifuge kulturen 10 min for 1 000 x g og komme seg avklart Media.
- Mål IgG-konsentrasjonen i supernatanter via affinitet til protein A.
- Test hver IgG (i supernatanten) ved 20 μg/mL ved enzym koblet adsorbent-analysen (ELISA) mot de enkelte peptider som brukes til sorteringen, fanges på en streptavidin plate eller utgangen som en negativ kontroll. Bruk en geit anti-menneskelige peroksidase sekundære antistoff mot humant IgG FAB å oppdage rekombinant kloner. Etter subtraksjon av bakgrunnen, OD > 0,5 er definert som skjermen positiv.
- Bekreft positive treff på skjermen ved å utføre en ekstra ELISA ved å bruke fortynninger av IgG-supernatanten til å generere en konsentrasjons kurve som starter med 20 μg per mL, og plotting mot OD for hvert antigen som viser reaktivitet i den første skjermen ELISA.
Representative Results
Denne metoden dekker en flertrinnsprosess for å isolere antigen-spesifikke antistoffer fra menneskelige donorer. I representative data som vises her, ble celler inkubert med en pool av fluorescensmerkete-merket peptider som representerer flere forskjellige domener av tau protein, inkludert fosforylert peptider å etterligne antatte fosforylering steder. Disse peptider ble brukt som "agn" for å identifisere celler som er reaktive med tau epitopes (er) av interesse. Som forberedelse for sortering, et panel av fluorescensmerkete-merket fenotypiske markører ble brukt til å identifisere ulike celle populasjoner innenfor beriket B celle befolkning. En rekke flowcytometri porter ble utviklet for å isolere målminnet B-cellene (figur 1). Lymfocytter ble isolert basert på deres Cellestørrelse og detaljnivå ved hjelp Forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) tomter iFlow flowcytometri. Etter utelukkelse av flere celler ("doublets") og døde celler, fenotypiske markører tillot segregering av IgG+ minne B celler via IGG, CD19 (B-celle) og CD27 (minne). I denne tilnærmingen, den CD27 markør ikke distribuere i to diskrete populasjoner, så toppen 45% av CD27+ uttrykke celler er inkludert for den endelige porten. Til slutt, celler dobbelt-positive for både APC og PE fluorophores fordele i øvre høyre kvadrant av gating grafen, noe som indikerer reaktivitet til både merkede versjoner av peptider. Cellene som falt innenfor den tegnede porten ble isolert og sortert i individuelle brønner av en 96-brønn plate. Bruk av antigen med to forskjellige etiketter øker signal-til-støy-forhold og reduserer antall falske positiver i den påfølgende molekylærbiologi prosessen. De sorterte cellene representerte omtrent 0,1% av minne B-cellene i den endelige porten, og 0,001% av Start Celleprøven.
Den første avlesning av enkelt celle kloning er bekreftelse av forsterkning av de respektive tunge og lette variable kjeder (figur 2). Siden sammenkoblingen av begge amplicons er ønskelig, evalueres PCR-reaksjonene side-ved-side på agarose gel, og matchet parene er excised fra gel og DNA fragmenter ekstrahert. Typisk effektivitet av forsterkning er 30-50% tung kjede og 50-70% lys (Kappa) kjede. Gjenvinning av sammenkoblede amplicons er vanligvis mellom 25-40% effektivitet. Disse effektivitet varierer mellom donor bassenger, og representative data (Figur 3) er et eksempel på svært effektiv forsterkning fra 24 enkeltceller (42% PARKOBLET utvinning). Etter IgG kloning, er IgG uttrykket vektoren transfekterte i menneskelig embryonale nyre (HEK-293) suspensjon celler, som brukes til å maksimere uttrykket. Bruken av serum fritt medium reduserer forurensende proteiner fra det rekombinant antistoff prep, og bidrar til å minimere støy i etterfølgende bindende analyser. De gjenopprettede antistoffer er vist mot den opprinnelige panel av tau peptider og scoret for reaktivitet av ELISA (Figur 4). En opprinnelig terskel for OD = 0,5 over bakgrunnen brukes til å indikere positiv antigen reaktivitet, og β-utgangen protein brukes som en kontroll for ikke-spesifikk binding. Hvis flyt flowcytometri og sorterings trinnene bruker en blandet pool av peptider, er screening ELISA det første skrittet i deconvoluting spesifikke reactivities av den gjenopprettede IgG. Tre av de 10 IgG analyseres viste reaktivitet mot fosforylert CBTAU 22.1 peptid, og en var reaktiv til ikke-fosforylert CBTAU 27.1 (Figur 4A). Ytterligere bekreftelse ble gjennomført ved hjelp av en konsentrasjon kurve av samme rekombinant antistoff prøver mot peptider identifisert i den første skjermen, og en ekstra peptid som en negativ kontroll (Figur 4B). For hvert positivt treff ble en individuell plasmider-klone isolert fra det forvandlet bassenget og bekreftet av den samme ELISA-metoden. Bare Clone 34 er vist dataene presentert, og mens reaktivitet til ikke-fosforylert CBTAU 27.1 ble bekreftet, ble lavere affinitet binding også observert med fosforylert 27,1 peptid (Figur 4C).
Figur 1 : Isolering av antigen-reaktive enkeltceller via Flow flowcytometri. (A) vises er et representativt plott der lymfocytter befolkningen var inneholdt innenfor den tegnede porten. (B) Gates basert på fremover og side SCATTER (FSC-høyde v FSC-bredde (R3); SSC-høyde v SSC-Width (R4)) ble brukt til å ekskludere doublets. Bare celler i tegnede porter ble evaluert i etterfølgende tomter. DAPI+ celler ble betraktet som døde og ekskludert (R5). I dette eksperimentet ble 3,7 x 107 "live"-celler avhørt. Flertallet av levende celler var B-celler (CD19+), og IgG+ celler (4,66%) ble isolert fra denne populasjonen (R6). Toppen 43,2% av CD27+-uttrykke minne celler ble inkludert i utvalget gate (R7). (C) kvadrant 2 (Q2) inneholdt celler reaktive til begge merket antigener (PEPTID-APC v PEPTID-PE), og disse cellene ble sortert og utvinnes individuelt i en 96-brønn plate. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : PCR forsterkning gjenvinner IgG tung og lys variabel sekvens for kloning. (A) både Heavy (VH) og Light (VK eller VL) kjede variabel områder er gjenopprettet ved hjelp av nestede PCR-reaksjoner. Trinn jeg primere forsterke fremover fra de innfødte leder sekvensen og reversere fra innenfor den konstante regionen. Flere piler representerer en pool av mellom 7-12 primere, som brukes til å sikre bred dekning av mulige germlines. Trinn II primere er nestet, spesifikke for de ekstreme endene av variabelen åpne lesing ramme, og legge til sekvens til endene av amplicons som er homologe til tilstøtende sekvens i uttrykket vektor. (B) den linker består av konstant lys kjeden (ck eller CL), etterfulgt av den tunge kjeden promoter og en ikke-native signal peptid sekvens. Den amplicons, linker, og plasmider ryggraden er samtidig ligaturer via overlappende homologe sekvens generert under Step II PCR forsterkning, og isolert som en intakt plasmider. Den rekombinant tunge og lys kjeder i det endelige uttrykket vektoren er drevet av uavhengige (og identiske) CMV arrangører, og er oversatt som separate proteiner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : IgG tung og lett variabel kjede amplicons utvinnes fra enkeltceller. De nestede PCR-reaksjonene (trinn II) ble lastet direkte inn i 1% agarose gel og visualisere. Heavy Chain (H) og Kappa Light Chain (L) PCR-reaksjoner fra samme celle ble lastet i tilstøtende brønner, slik at sammenkoblede amplicons ble lett observert. Vellykket tung og lett kjede produkter er omtrent 400 BP og 350 BP hhv. Vellykket gjenoppretting av sammenkoblede amplicons er merket med en (*). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Antigen spesifisitet er bekreftet fra rekombinant IgG. Plasmider som inneholder de gjenopprettede tunge og lette kjede sekvensene, transfekterte inn i HEK-celler for uttrykk. Etter fire dager blir rekombinant antistoffer vurdert for reaktivitet av ELISA. (A) IgG-konsentrasjonen i det avklart mediet ble målt og fortynnet til 20 μg/ml. Utvalget av peptider brukt til sortering ble individuelt vurdert ved hjelp 40 pmol per brønn i streptavidin plater. Alle IgG ble testet i dupliserte brønner. (B) kloner som viste OD450 måling > 0,5 ble re-vurdert (kloner #32, #34, #35) ved hjelp 1:5 fortynning skritt mot peptider identifisert i skjermen. (C) når bekreftet som en hit, en enkelt plasmider klone ble isolert fra klone #34 forvandlet ligations, transfekterte, og bekreftet av Elisa. Det samme ble gjort for kloner #32 og #35 (data ikke vist). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Metoden som presenteres her kombinerer flyt flowcytometri og enkel celle kloning, og metodene vi beskriver her vi basert på metoder som tidligere er utviklet av Tiller og kolleger11. Deres arbeid beskriver utvinning og kloning av monoklonale antistoffer for å studere B-cellen repertoar hos mennesker på nivå med individuelle celler. Vi har tilpasset de viktigste komponentene i prosessen deres for å tillate gjenvinning av antigen-spesifikke monoklonale antistoffer fra en populasjon av minne B-celler, inkludert multi-Step forsterkning primer strategi. Den store endringen er tillegg av merket antigen "agn". Ytterligere tilpasninger er gjort i den publiserte protokollen, inkludert (men ikke begrenset til) å endre kloning vektoren ryggraden i et enkelt uttrykk plasmider, ytterligere primer dekning av germline repertoar (både leder sekvens og rammeverk 1), transfeksjoner av suspensjon HEK293 celler for høyere uttrykk, og bruk av High Fidelity polymerases under PCR forsterkning.
For metodene som beskrives her, er de mest kritiske trinnene nær overgangen mellom strømnings flowcytometri og enkel celle kloning. Først riktig plassering av sorterte enkeltceller inn i platen er avgjørende. Innstilling av drop-forsinkelsen riktig i sorteringen er et viktig trinn. Miljømessige faktorer, for eksempel lav luftfuktighet, må også tas i betraktning, som vi har funnet vår utvinning effektivitet falle betydelig med mindre en statisk pistol brukes på målet sortere platene. Etter celleplassering er platene sentrifugert for å sikre at cellene har kontaktet 10 μL av buffer i bunnen av brønnene. Alle disse tiltakene er avgjørende for at molekylærbiologi delen skal lykkes. Hvis forholdene er sub-optimale for omvendt transkripsjon reaksjonen av en enkelt celle, PCR forsterkning av selv β-utgangen kan være vanskelig. Styrken av metoden som presenteres er muligheten til å forhøre millioner av celler og bare sortere de som samsvarer med antigen reaktivitet kriterier mot antigen av valget. Dette krever at signal til støy-forhold er så høyt som mulig, noe som gjøres ved å optimalisere konsentrasjonen av agn før sortering. To-merket agn brukes til å redusere utvinningen av falske positive celler, som kan oppstå hvis en av fluorophores har høy bakgrunn. Bruke mer enn ett antigen agn kan gjøre signalet: støy optimalisering vanskeligere, men evnen til å forhøre flere peptider samtidig er en annen fordel med denne metoden.
Når utvinning effektivitet er lav, et sett med nestede β-utgangen primere brukes til å bekrefte at malen cDNA er til stede. Ulempen med denne tilnærmingen er at det er vanskelig å avgjøre om det var ingen celle tilstede i brønnen eller omvendt transkripsjon reaksjonen mislyktes, noe som gjør feilsøking vanskelig. Av og til det motsatte vil skje og effektiviteten er høyere enn forventet. Den typiske utvinningen for tunge kjeden er mellom 30-45% og lys kjeder er høyere, mellom 40-60%. Hver PCR-reaksjon (Step I & II) bruker 50 sykluser for å forsterke fra en enkelt celle. Det høye antallet totale sykluser gjør også denne metoden utsatt for forurensning. Sekvens analyse av amplicons kan brukes til å avgjøre om et miljøgifter er innført, eller en uvanlig høy utvinningsgrad er legitimt oppnådd.
Hjelpemidlet av denne metoden å komme seg innfødt Human Antistoffene imot en antigen av valget har adskillige betydelig begrensninger. Først, bare løselige proteiner som kan merkes kan brukes som "agn" for flyten flowcytometri. For sorterer presentert i representative resultater, brukte vi en rekke syntetisert overlappende peptider fra tau protein, siden bruke hele proteinet viste seg å være vanskelig. Bruk av lineære peptider er sannsynligvis ikke optimalt, siden det kan begrense identifisering av antistoffer mot ikke-lineære eller strukturelle epitopes. Men vi var i stand til å identifisere flere unike antistoffer mot tau og disse er for tiden gjennomgår ytterligere evaluering8,9. En annen begrensning er den lave gjennomstrømningen av molekylærbiologi utvinning og kloning av IgG. Den første sorterings strategien tillater screening av millioner av celler, men den påfølgende molekylærbiologi behandling består av flere etapper. Pågående optimalisering innsats for å innlemme nyere teknologi, slik som Gibson Assembly10 har strømlinjeformet flere trinn, men flaskehalsen forblir kloning individuelle tunge og lett kjede parene.
Den "BSelex" metoden utnytter BCR uttrykt på overflaten av minnet B celler for å identifisere celler som viser antigen reaktivitet, og deretter gjenopprette disse individuelle celler viaFlow flowcytometri. På grunn av denne avhengigheten av BCR, er metoden begrenset til minnet B celle rommet, og fanger ikke antistoff sekresjon celler (ASCs) som plasmablasts. Imidlertid kan denne tilnærmingen være en fordel å utvinne et bredere repertoar av antigen-spesifikke immunoglobins sammenlignet med ASCs. Influensa vaksinasjon studier viser at mens reaktive ASCs kan være dominert av et lite antall utvidet B celle kloner, er antigen-spesifikke minne B celle befolkning sjelden klonal12. T-celle reseptoren (TCR) på overflaten av T-celler har likheter med B-celle reseptoren i gen ordning og rekombinasjon for å maksimere mangfoldet. Enkelt celle tilnærminger som ligner på det som er beskrevet i metoden som presenteres her har blitt utviklet for å vurdere T-cellen repertoar, inkludert utvinning og enkel celle kloning av Alpha og beta kjeder13. Men, TCR anerkjennelse krever peptider skal presenteres av MHC molekyler, legge betydelig kompleksitet til merket agn tilnærming for å identifisere peptid-spesifikke T-celler. I motsetning til B-celler, gjør T-celler ikke gjennomgår affinitet modning av hele variabelen regionen, slik identifisering av den korte CDR3 regionen og noen flankerer sekvensen er alt som kreves for identifisering og rekonstituering. Til slutt, denne metoden beskriver identifisering av IgG molekyler ved hjelp av Flow flowcytometri, men det er også mulig å bruke alternative fenotypiske markører for å identifisere B-celler av ulike isotypes.
Foreløpig er det metoder som utvikles for å koble den enorme mengden data som samles inn fra neste generasjons sekvensering med funksjonell analyse av antigen spesifisitet, men disse metodene er fortsatt å være raffinert. Til tross for sine begrensninger, metoden som er beskrevet her har blitt brukt til å identifisere antistoffer med potensiell terapeutisk verdi for både smittsomme og ikke-smittsomme sykdommer8,14,15, og representerer en pålitelig tilnærming til å gjenopprette relevante antigen-spesifikke IgG fra mennesker, uten omfattende manipulering av B-celler eller omfattende cellekultur.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Lucy Chammas, Martha Costa, Julie Kim, Nancy Heredia, og Jeremy Macedo for omfattende testing av mange metode modifikasjoner og foredling av dagens BSelex plattformen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter | MoFlo | cell sorting | |
| Biotinylated peptides | New England Peptide | Cell sorting "bait" | |
| Micro Bio-spin P30 gel column | BioRad | #7326223 | |
| Streptavidin (R-PE) | Thermo Scientific | SA10041 | |
| Streptavidin (APC) | Thermo Scientific | S32362 | |
| CD22 MicroBeads, human | Miltenyi | #130-046-401 | |
| LS columns | Miltenyi | #130-042-401 | |
| Pre separation filters | Miltenyi | #130-041-407 | |
| PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19 | BD Biosciences | BD#340951 | |
| PE-Cy7 mouse anti-human CD27 | BD Biosciences | #560609 | |
| FITC mouse anti-human IgG | BD Biosciences | #560952 | |
| DAPI | Life Technologies | #D21490 | |
| RNaseOUT | Life Technologies | #10777-019 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | Sigma | #A4503 | |
| RPMI media | Hyclone | #SH30096.01 | |
| HI FBS (Fetal bovine serum) | Invitrogen | #10082147 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | Model #6325 | PCR machine |
| PCR 96-well plates | Phenix | MPS-500 | |
| PCR Plate mats | Phenix | SMX-PCR96 | |
| Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix | Clontech | #639125 | |
| Superscript IV First-strand synthesis system | Invitrogen | #18091050 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Scientific | F-531-L | |
| Platinum polymerase | Invitrogen | #10966108 | |
| Nuclease-free water | QIAGEN | #129114 | |
| Oligonucleotide primers | IDT | assorted | Primers for all PCR steps |
| Gel Extraction Kit | QIAGEN | #28706 | |
| PCR Purification kit | QIAGEN | #28106 | |
| Miniprep Kit | QIAGEN | #27106 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Gibson assembly |
| Expi293 Expression Media | Invitrogen | #A14351-01 | |
| ExpiFectamine 293 Transfection Kit | Invitrogen | #A14525 | |
| Opti-MEM Media | Invitrogen | #31985070 | |
| CO2 incubator (Multitron) | |||
| Octet RED384 System | Pall/ Forte Bio | ||
| Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates | Thermo Scientific | #15500 | |
| Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area | Corning | #3690 | |
| Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody | Jackson Labs | #109-036-097 | |
| Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody | Jackson Labs | #115-035-072 | |
| SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component) | KPL | #52-00-03 | |
| TMB Stop Solution | KPL | #50-85-06 |
References
- Su, K. Y., Watanabe, A., Yeh, C. H., Kelsoe, G., Kuraoka, M. Efficient Culture of Human Naive and Memory B Cells for Use as APCs. Journal of Immunology. 197 (10), 4163-4176 (2016).
- Corti, D., Lanzavecchia, A.
- Steinitz, M., Klein, G., Koskimies, S., Makel, O. EB virus-induced B lymphocyte cell lines producing specific antibody. Nature. 269 (5627), 420-422 (1977).
- Bloom, A. D., Nakamura, F. T. Establishment of a tetraploid, immunoglobulin-producing cell line from the hybridization of two human lymphocyte lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2689-2692 (1974).
- Olsson, L., Kaplan, H. S. Human-human hybridomas producing monoclonal antibodies of predefined antigenic specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (9), 5429-5431 (1980).
- Lechner, J., et al. Alterations in Circulating Immune Cells in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. Scientific Reports. 5, 16754 (2015).
- Loken, M. R., Brosnan, J. M., Bach, B. A., Ault, K. A. Establishing optimal lymphocyte gates for immunophenotyping by flow cytometry. Cytometry. 11 (4), 453-459 (1990).
- Pascual, G., et al. Immunological memory to hyperphosphorylated tau in asymptomatic individuals. Acta Neuropathologica. 133 (5), 767-783 (2017).
- van Ameijde, J., et al. Enhancement of therapeutic potential of a naturally occurring human antibody targeting a phosphorylated Ser(422) containing epitope on pathological tau. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 59 (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. Journal of Immunological Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Wrammert, J., et al. Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus. Nature. 453 (7195), 667-671 (2008).
- Han, A., Glanville, J., Hansmann, L., Davis, M. M. Linking T-cell receptor sequence to functional phenotype at the single-cell level. Nature Biotechnology. 32 (7), 684-692 (2014).
- Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).
- Jones, H. G., et al. Structural basis for recognition of the central conserved region of RSV G by neutralizing human antibodies. PLoS Pathogens. 14 (3), 1006935 (2018).
- Janssen Vaccines & Prevention B.B. US patent. , U.S. Patent Application No. 20170210787, Published July 27, 2017 (2017).
