Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

طريقة فحص خلية واحدة لاختيار واستعادة الأجسام المضادة مع الخصائص المطلوبة من الذاكرة البشرية المخصب B مجموعات الخلايا

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59809
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1World Without Disease Accelerator, Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson and Johnson, 2Janssen Prevention Center, Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson and Johnson

Summary

طريقة BSelex لتحديد واستعادة الأجسام المضادة الفردية مستضد محددة من خلايا الدم الطرفية البشرية أحادية النووية يجمع بين تدفق الخلايا مع PCR خلية واحدة والاستنساخ.

Abstract

يمثل مرجع الأجسام المضادة البشرية مصدراً غير مستغل إلى حد كبير للأجسام المضادة العلاجية المحتملة والمؤشرات الحيوية المفيدة. في حين أن الأساليب الحسابية الحالية، مثل تسلسل الجيل التالي (NGS)، تسفر عن مجموعات هائلة من البيانات عن ذخيرة الأجسام المضادة على مستوى التسلسل، فإن البيانات الوظيفية مطلوبة لتحديد التسلسلات ذات الصلة بمستضد معين أو مجموعة من مستضدات. هنا، نقوم بوصف طريقة لتحديد واستعادة الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد من الخلايا أحادية النووية في الدم المحيطي (PBMCs) من متبرع بالدم البشري. تستخدم هذه الطريقة الإثراء الأولي للخلايا الناضجة B وتتطلب مزيجًا من علامات الخلايا الفينوتية والبروتين المسمى بفلورسنت لعزل خلايا ذاكرة IgG B عبر قياس التدفق الخلوي. ثم يتم استنساخ المناطق المتغيرة سلسلة الثقيلة والخفيفة وإعادة فرزها. على الرغم من أن تقتصر على حجرة الخلية B الذاكرة، هذا الأسلوب يستفيد من تدفق قياس الخلايا لاستجواب الملايين من الخلايا B وإرجاع المقترنة سلسلة الثقيلة والخفيفة تسلسل من خلية واحدة في شكل جاهز للتعبير وتأكيد الخصوصية. ويمكن النظر في الأجسام المضادة التي يتم استردادها بهذه الطريقة للإمكانات العلاجية، ولكن يمكن أيضا ربط الخصوصية والوظيفة مع نُهج المعلوماتية الحيوية لتقييم ذخيرة الخلية باء داخل الأفراد.

Introduction

الأجسام المضادة هي فئة متنامية من الجزيئات العلاجية، وذخيرة الخلية B الموجودة في أي إنسان هو مصدر محتمل لهذه الأجسام المضادة. وعندما يتم استردادها من متبرع بشري، فإنها لا تحتاج إلى تكييف أو "إضفاء الطابع الإنساني"، وهي خطوات مطلوبة للأجسام المضادة المتولدة في نظم حيوانية أخرى. توجد عدة طرق لتحديد وعزل الأجسام المضادة البشرية، بمافي ذلك تنشيط الخلية B وانتشارها 1، الخلود عبر تحويل EBV2،3،وتوليد خطوط الخلايا الهجينة4 ،5. ومع ذلك، تتطلب كافة هذه الطرق ثقافة الخلية واسعة لفحص واستعادة الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد. وقد تم توسيع نطاق المعلومات المتعلقة بذخيرة الأجسام المضادة البشرية إلى حد كبير مع تطوير الجيل التالي من تكنولوجيا التسلسل ، مما يسمح بتحديد كميات هائلة من التسلسلات الفردية الموجودة في عينات المانحين. ومع ذلك، ونظراً لأن الـ NGS تعطي رؤية لا أدرية لجميع التسلسلات الموجودة، فإنها لا تسمح بتحديد وعزل الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد، لا سيما في حالة الأجسام المضادة النادرة أو المنخفضة التردد.

الغرض من طريقة "BSelex" هو تحديد الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد من تعميم خلايا الدم الطرفية أحادية النووية في المتبرعين البشريين، وعزل واستعادة تسلسل هذه الأجسام المضادة لمزيد من التحليل. تستخدم هذه الطريقة قياس التدفق الخلوي وفرز الخلايا للاستفادة من مستقبلات الخلايا B (BCR) المعبر عنها على سطح خلايا الذاكرة B. يمكن فحص الملايين من الخلايا B للحصول على خصوصية المستضد عن طريق قياس التدفق الخلوي قبل بدء أساليب البيولوجيا الجزيئية ذات الإنتاجية المنخفضة. لا يمكن التعرف على سلسلة الثقيلة والخفيفة المقترنة في معظم أساليب NGS، التي تحلل تسلسل الخلايا بكميات كبيرة. في الطريقة التي نصفها هنا، يتم عزل الخلايا بشكل فردي، والانتعاش المقترن من كل من تسلسل سلسلة الثقيلة والخفيفة هو ممكن، والذي يسمح الاستنساخ المباشر والتعبير عن IgG الكامل.

Protocol

واتبع استخدام عينات من المتطوعين البشريين البروتوكولات التي وافق عليها مجلس الاستعراض المؤسسي لمعهد سكريبس للبحوث. تم الحصول على موافقة مستنيرة من الجهات المانحة قبل التبرع بالدم.

1. إعداد الكاشف

  1. الخلايا أحادية النكوائية في الدم المحيطي (PBMCs)
    1. استعادة خلايا الدم الطرفية أحادية النووية من المتبرعين الإنسان العادي عن طريق العزلة فيكول بلاك بلس. الحفظ بالتبريد في 50 مليون خلية /مل في 90٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). تجميد الخلايا في -80 درجة مئوية ونقلها إلى النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.
  2. وضع العلامات على الببتيدات المستضدة المستهدفة للفرز
    1. توليد أو الحصول على الببتيدات الخاصة بالبروتين المستهدف (ما يصل إلى 70 بقايا طويلة) مع البيوتين الطرفية.
    2. تسمية 4 نمول من كل الببتيد biotinylated الفردية مع streptavidin تعلق بشكل مشترك إلى PE (R-phycoerythrin) أو APC (allophycocyanin) في أنابيب منفصلة. الاستعداد باستخدام نسبة الأضراس من الببتيد 9:1 إلى streptavidin (SA)، مع تركيز نهائي من حوالي 3.2 درجة مئوية لSA-PE و 5.7 ميكرومتر SA-APC. إعداد رباعيات البيوتين كسيطرة سلبية.
    3. احتضان كل مزيج الببتيد بين عشية وضحاها، في الظلام، في 4 درجة مئوية مع خلط بطيء.
    4. إزالة الفلوروفور غير منضم عن طريق تمرير الببتيدات المسماة من خلال الأعمدة الدقيقة التي تحتوي على حبات البولي أكريلاميد.
    5. تخزين رباعيات الببتيد تصل إلى 2 أشهر في 4 درجة مئوية.

2. فرز الخلايا

  1. ما لا يقل عن 1 ساعة حتى 16 ساعة قبل عزل CD22+، إذابة PBMCs المانحة والسماح للراحة عند 37 درجة مئوية.
    1. إزالة قارورة من PBMCs المجمدة من الثلاجة ونقل فورا إلى حمام المياه 37 درجة مئوية. عندما يتم إذابة القنينات تقريبا، نقل إلى منطقة العمل.
    2. نقل محتويات كل قارورة إلى أنبوب 50 مل تحتوي على وسط prewarmed (الحفاظ على الجهات المانحة منفصلة). إضافة متوسطة إلى حجم نهائي من 50 مل. خلط المحتويات بلطف.
    3. الطرد المركزي في 370 × ز لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل supernatant، إعادة تعليق الخلايا في 15 مل من RPMI المتوسطة كاملة وإجراء عدد الخلايا.
    4. ضبط تركيز الخلية إلى 2.0 × 107 خلايا / مل مع RPMI المتوسطة كاملة، ونقل الخلايا إلى قارورة T75 أو أكبر وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل وتصل إلى 16 ساعة للسماح وقت الانتعاش للخلايا المذابة.
    5. جمع الخلايا (تجمع إذا رغبت في ذلك) والطرد المركزي في 370 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 5 مل من الجليد الباردMACS العازلة (PBS، pH 7.6 التي تحتوي على 0.5٪ BSA و 2 MM EDTA)، وجلب إلى 50 مل مع المخزن المؤقت MACS وإجراء عدد الخلايا.
    6. طرد مركزي الخلايا في 400 × ز لمدة 7 دقائق في 4 درجة مئوية.
    7. عزل خلايا CD22+ B عن طريق التحديد الإيجابي عن طريق التقاط على microbeads CD22. استخدم المخزن المؤقت MACS لكافة عمليات النُشال. العد والطرد المركزي 400 × ز لمدة 7 دقائق في 4 درجة مئوية. الانتعاش المتوقع هو 5-10٪ من مجموع السكان PBMC.
    8. إعادة تعليق الخلايا في 40 مليون لكل مل FACS العازلة (تريس العازلة، وpH 8.0 تحتوي على 0.5٪ BSA و 2 MM EDTA) والمضي قدما في تلطيخ الخلايا من الجهات المانحة بشكل فردي أو كتجمع.
  2. خلايا وصمة عار لفرز الخلايا B الذاكرة
    1. إزالة aliquot من الخلايا لمقياس السيتومتر إعداد والتعويض عن كل من الفلوروفورات وضع العلامات المستخدمة. تضمين الخلايا غير الملطخة كعنصر تحكم.
    2. حساب حجم تلطيخ النهائي لعدد CD22+ الخلايا التي تم الحصول عليها (تلطيخ 2 مليون لكل 100 درجة مئوية).
    3. أضف علامات خارج الخلية للخلايا B (CD19-PerCP-Cy5.5) وIgG (IgG-FITC) ومقصورة الذاكرة (CD27-PECy7) حسب توصيات تخفيف الشركات المصنعة، واخلطها بلطف. Aliquot 107 خلايا في أنبوب 1.5 مل للسيطرة السلبية ونقل الخلايا المتبقية إلى أنبوب 15 مل.
    4. إضافة رباعيات البيوتين-SA المزدوجة المسماة إلى أنبوب التحكم السلبي بتركيز نهائي قدره 36 nM لكل من PE وAPC مضروبة في عدد الببتيدات في أنبوب الفرز وإحضار الحجم إلى 0.5 مل النهائي مع المخزن المؤقت FACS (على سبيل المثال، 10 الببتيدات × 36 nM = 360 nM).
    5. إضافة رباعيات الببتيد إلى أنبوب الفرز في 36 nM لكل من PE وAPC وجلب الخلايا إلى 2x106 لكل 100 درجة مئوية مع المخزن المؤقت TBS. الحضانة في 4 درجة مئوية في الظلام ومع تناوب لطيف لمدة 30-60 دقيقة.
    6. غسل 2X في 4 درجة مئوية، 400 × ز،7 دقيقة، وإزالة aliquot لحساب قبل الغسيل الأخير. تصفية الخلايا باستخدام أنابيب غطاء مرشح 5 مل. إضافة DAPI (4', 6-دياميدينو-2-فينيليندول) وصمة عار إلى 0.3 ميكرومتر التركيز النهائي فقط قبل الفرز كعلامة على سلامة غشاء الخلية.
  3. فرز خلية واحدة عن طريق قياس التدفق الخلوي
    1. إعداد 48 بئرا من 96 جيدا PCR لوحات للفرز.
      1. إعداد مزيج رئيسي: (2 ميكرولتر من 10X RT العازلة، 0.5 ميكرولتر من مثبطات RNase، 7.5 ميكرولتر من المياه المعقمة PCR الصف) لكل عينة. Aliquot 10 درجة مئوية لكل بئر، وتغطي، وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى جاهزة للفرز.
    2. قم بتشغيل عنصر التحكم السالب على فارز الخلية، وتحليل العينة بأكملها.
      1. تعيين بوابات قياس التدفق لعزل مجموعات الخلايا المناسبة لفرز الخلايا المفردة.
        1. مؤامرة منطقة FSC مقابل منطقة SSC وتعيين بوابة R1 لعزل الخلايا الليمفاوية.
        2. رسم ارتفاع FSC مقابل عرض FSC وتعيين بوابة R3 لاستبعاد doublets FSC.
        3. رسم ارتفاع SSC مقابل عرض SSC وتعيين بوابة R4 لاستبعاد doublets SSC.
        4. مؤامرة ارتفاع SSC مقابل DAPI وتعيين بوابة R5 لعزل الخلايا الحية (DAPI-).
        5. مؤامرة IgG مقابل CD19 وتعيين بوابة R6 لعزل IgG+ B الخلايا (CD19+ IgG+).
        6. رسم IgG مقابل CD27 وتعيين بوابة R7 لتحديد خلايا الذاكرة B (CD27عالية).
        7. مؤامرة Antigen-PE (Ag-PE) مقابل مستضد-APC (Ag-APC) وتعيين بوابة R8 كما Ag-PE+/ Ag-APC+ الربع مع عدد قليل من الأحداث في البوابة الإيجابية المزدوجة.
    3. جمع عدد متساو من خلايا الذاكرة من مستضد إيجابية (Ag+) عينة لتحديد إشارة إلى الضوضاء.
    4. فرز الخلايا المفردة التي تحتوي على النمط الظاهري CD19+ CD27+ Ag-PE+ Ag-APC+ (بوابة R8) في لوحات PCR 96-well المعدة.
    5. تغطية لوحات مع منصات الشريط الألومنيوم، الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 400 × ز، وتخزينها في -80 درجة مئوية للاستنساخ في المستقبل.

3. استنساخ خلية واحدة

  1. ردود فعل النسخ العكسي
    1. قم بإزالة لوحة فرز الخلايا B المفردة من 80 درجة مئوية. إذابة على الجليد لمدة 2 دقيقة.
    2. إعداد مزيج الرئيسي dNTP / العازلة مع المنظفات غير الأيونية 10٪ وoligo (dT) كما التمهيدي العكسي. إضافة مزيج إنزيم إلى كل بئر تحتوي على خلية واحدة ولا تخلط.
    3. حضانة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية. إضافة مزيج رئيسي إنزيم يحتوي على 100 mM DTT، مثبط RNase، وإنزيم النسخ العكسي ليصل الحجم الإجمالي إلى 20 ميكرولتر.
    4. نقل إلى الجليد قبل بدء خطوات PCR
  2. ردود فعل PCR متداخلة متعددة الخطوات
    1. استخدام تفاعلات PCR متداخلة منفصلة تستخدم للسلسلة الثقيلة (HC) وسلسلة الضوء (LC) تضخيم.
    2. بالنسبة للجولة الأولى من تضخيم PCR (الخطوة الأولى)، استخدم مجموعة من المواد التمهيدية الأمامية والتمهيدي العكسي واحدلتضخيم المناطق المتغيرة HC وLC في ردود فعل منفصلة PCR (الشكل 2). حسب التصميم، فإن مجموعة من التمهيديات إلى الأمام تضخيم نسبة كبيرة من سلسلة زعيم الجرثومة (L) والتمهيدي العكسي هو محدد للمناطق الثابتة المصب من كل سلسلة، بما في ذلك كل من كابا (و) لامدا (י) لسلاسل الضوء16.
      1. استخدم 2.5 ميكرولتر من منتج cDNA كقالب لكل تفاعل PCR (الخطوة I). إضافة التمهيديات إلى تركيز رد الفعل النهائي من 1 μM لكل. مضاعفة العازلة بوليميراز 10X إلى تركيز 2X، وجلب الحجم النهائي إلى 25 درجة مئوية لكل رد فعل. تشغيل تفاعلات HC PCR باستخدام [94 درجة مئوية / 4 دقيقة؛ 94 درجة مئوية / 15 s، 55 درجة مئوية / 20 s، 68 درجة مئوية / 60 s؛ 68 درجة مئوية / 3 دقيقة] لمدة 50 دورة. تشغيل ردود فعل PCR LC باستخدام [98 درجة مئوية / 4 دقيقة؛ 98 درجة مئوية / 15 s، 72 درجة مئوية / 20 s، 72 درجة مئوية / 60 s؛ 72 درجة مئوية / 3 دقيقة] لمدة 50 دورة.
    3. استخدم 2.5 ميكرولتر من منتج الخطوة الأولى كقالب لكل تفاعل PCR (الخطوة الثانية). إضافة مجموعة من التمهيديات إلى الأمام محددة إلى HC وLC (و وو) إطار 1 المنطقة ومجموعة من التمهيديات العكسية الخاصة بمنطقة تقاطع كل سلسلة الأجسام المضادة. مضاعفة العازلة بوليميراز 10X إلى تركيز 2X، وتشغيل ردود الفعل PCR 50 دورات كل باستخدام نفس المعلمات كما الخطوة I.
    4. تشغيل ردود الفعل PCR الانتهاء على هلام أجاروز 1٪ لتصور الضربات تضخيم إيجابية. استعادة amplicons المقترنة (سلسلة ثقيلة وخفيفة على حد سواء من نفس الخلية) وعزل عن طريق استخراج هلام. تحديد تركيز جزء الحمض النووي عن طريق OD260 لحسابات مزيج الربط دقيقة.
    5. الجمع بين الشظايا الثقيلة والخفيفة المستردة سلسلة مع جزء linker والعمود الفقري ناقلات التعبير باستخدام رد فعل ربط 4-جزء باستخدام مجموعة تجارية.
    6. تحويل تفاعلات الربط إلى بكتيريا مختصة كيميائيا باستخدام مجموعة تجارية. مرة واحدة مطلية على لوحات المضادات الحيوية، إضافة 4 مل من وسائل الإعلام النمو (مع المضادات الحيوية) إلى ثقافة التحول المتبقية، وحضانة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في 250 دورة في الدقيقة. هذه هي "ثقافة مزيج الربط".
    7. إعداد الحمض النووي miniprep من الثقافات مزيج الربط بين عشية وضحاها باستخدام مجموعة تجارية، وتحديد تركيز الحمض النووي بلازميد الناتجة.

4. شاشة ELISA لتأكيد خصوصية المستضد

  1. Transfect 10 ميكروغرام من الحمض النووي miniprep مع الكاشف القائم على الدهون الموجبة في 10 مل من تعليق 293 خلية، وحضانة لمدة 3-4 أيام في 37 درجة مئوية (8٪ CO2)أثناء الدوران في 125 دورة في الدقيقة. للحصاد، وثقافة الطرد المركزي 10 دقيقة في 1000 × ز واستعادة وسائل الإعلام أوضح.
    1. قياس تركيز IgG في supernatants عن طريق التقارب إلى البروتين A.
    2. اختبار كل IgG (في supernatant) في 20 ميكروغرام / مل عن طريق اختبار الممتزة المرتبطة بالإنزيم (ELISA) ضد الببتيدات الفردية المستخدمة لهذا النوع، التي تم التقاطها على لوحة streptavidin أو أكتين كسيطرة سلبية. استخدام الماعز المضادة للإنسان بيروكسيداز الأجسام المضادة الثانوية ضد الإنسان IgG فاب للكشف عن استنساخ المؤتلف. بعد طرح الخلفية، يتم تعريف OD > 0.5 على أنها شاشة إيجابية.
    3. تأكيد الزيارات الإيجابية الشاشة عن طريق تنفيذ ELISA إضافية، وذلك باستخدام تمييع من Supernatant IgG لتوليد منحنى تركيز بدءا من 20 ميكروغرام لكل مل، والتآمر ضد OD لكل مستضد تظهر التفاعل في الشاشة الأولية ELISA.

Representative Results

تغطي هذه الطريقة عملية متعددة الخطوات لعزل الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد عن المتبرعين البشريين. في البيانات التمثيلية الموضحة هنا، تم احتضان الخلايا مع مجموعة من الببتيدات ذات العلامات الفلورية التي تمثل عدة مجالات مختلفة من بروتين تاو، بما في ذلك الببتيدات الفوسفورية لمحاكاة مواقع الفوسفورالمفترض. وقد استخدمت هذه الببتيدات ك "طعم" لتحديد الخلايا التي هي رد فعل مع epitopes تاو (ق) من الفائدة. في التحضير للفرز، تم استخدام لوحة من العلامات الفينوتية التي تحمل علامة الفلورسنت لتحديد مجموعات الخلايا المختلفة ضمن مجموعة الخلايا B المخصب. وقد وضعت سلسلة من بوابات قياس الخلايا لعزل الخلايا الذاكرة الهدف B (الشكل1). تم عزل الخلايا الليمفاوية على أساس حجم الخلية والحبيبات باستخدام مبعثر إلى الأمام (FSC) ومؤامرة التشتت الجانبي (SSC) في قياس التدفق الخلوي6و7. بعد استبعاد خلايا متعددة ("doublets") والخلايا الميتة، سمحت علامات الفينوتيبيك بفصل خلايا IgG+ الذاكرة B عبر IgG وCD19 (خلية B) وCD27 (الذاكرة). في هذا النهج، لا توزع علامة CD27 إلى اثنين من السكان منفصلة، بحيث يتم تضمين أعلى 45% من CD27+ التعبير عن الخلايا للبوابة النهائية. وأخيراً، فإن الخلايا ذات الإيجابية المزدوجة لكل من APC وPE fluorophores توزع في الربع الأيمن العلوي من الرسم البياني gating، مما يشير إلى التفاعل على كل من الإصدارات المسماة من الببتيدات. تم عزل الخلايا التي سقطت داخل البوابة المرسومة وفرزها في آبار فردية من لوحة 96 بئر. استخدام مستضد مع اثنين من تسميات مختلفة يزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء ويقلل من عدد الإيجابيات كاذبة في عملية البيولوجيا الجزيئية اللاحقة. تمثل الخلايا التي تم فرزها حوالي 0.1% من خلايا الذاكرة B في البوابة النهائية و 0.001% من عينة خلية البداية.

القراءة الأولى لاستنساخ خلية واحدة هو تأكيد تضخيم سلاسل متغير الثقيلةوالخفيفة ذات الصلة (الشكل 2). منذ الانتعاش المقترنة من كل من amplicons هو المطلوب، يتم تقييم ردود فعل PCR جنبا إلى جنب على هلام أغاروز، ويتم استئصال أزواج المتطابقة من هلام وشظايا الحمض النووي المستخرجة. كفاءة نموذجية من التضخيم هو 30-50٪ سلسلة ثقيلة و 50-70٪ ضوء (كابا) سلسلة. استرداد amplicons المقترنة عادة ما بين 25-40٪ كفاءة. وتختلف أوجه الكفاءة هذه بين تجمعاتالمانحين، والبيانات التمثيلية (الشكل 3) مثال على التضخيم الفعال جداً من 24 خلية واحدة (42٪ الانتعاش المقترن). بعد استنساخ IgG، يتم نقل متجه التعبير IgG إلى خلايا تعليق الكلى الجنينية البشرية (HEK-293)، والتي تستخدم لتحقيق أقصى قدر من التعبير. استخدام المصل خالية من المتوسطة يقلل من تلوث البروتينات من الإعدادية الأجسام المضادة المؤتلف، ويساعد على تقليل الضوضاء في الاختبارات الملزمة اللاحقة. يتم فحص الأجسام المضادة المستردة ضد اللوحة الأصلية من الببتيدات تاو وسجل لتفاعل من قبل ELISA (الشكل4). يتم استخدام عتبة أولية من OD = 0.5 أعلاه الخلفية للإشارة إلى تفاعل مستضد إيجابي، ويستخدم بروتين β-أكتين كتحكم في الربط غير محدد. إذا كان تدفق السيتومترية والفرز الخطوات استخدام مجموعة مختلطة من الببتيدات، والفرز ELISA هو الخطوة الأولى من deconvoluting إعادة أنشطة محددة من IgGs تعافى. أظهرت ثلاثة من 10 IgGs مُفسّر التفاعل ضد الببتيد CBTAU22.1 الفوسفوري، وكان أحدها رد فعل على CBTAU27.1 غير الفوسفوري (الشكل4ألف). تم الانتهاء من تأكيد إضافي باستخدام منحنى تركيز من نفس عينات الأجسام المضادة المؤتلفة ضد الببتيدات المحددة في الشاشة الأولية، والببتيد إضافية كتحكم سلبي (الشكل4ب). لكل ضربة إيجابية، تم عزل استنساخ بلازميد فردي من التجمع المحول وأعيد تأكيده بنفس طريقة ELISA. يظهر فقط استنساخ 34 البيانات المقدمة، وبينما تم تأكيد التفاعل إلى CBTAU27.1 غير الفوسفورية، لوحظ أيضا انخفاض الربط التقارب مع الببتيد الفوسفورية 27.1 (الشكل4C).

Figure 1
الشكل 1 عزل الخلايا المفردة المستضدية عن طريق قياس التدفق. (أ) هو مبين مؤامرة تمثيلية حيث تم احتواء السكان الخلايا الليمفاوية داخل البوابة المرسومة. (ب) بوابات تستند إلى مبعثر أمامي وجانبي (ارتفاع FSC v FSC-width (R3)؛ تم استخدام ارتفاع SSC v SSC- العرض (R4)) لاستبعاد الدوبلات. ولم يتم تقييم سوى الخلايا داخل البوابات المرسومة في قطع أرض لاحقة. DAPI+ اعتبرت الخلايا ميتة ومستبعدة (R5). وفي هذه التجربة، استُجوبت 3.7 x 107 زنزانات "حية". كانت غالبية الخلايا الحية خلايا B (CD19+) ، وIgG+ الخلايا (4.66٪) تم عزلها عن هذه السكان (R6). تم تضمين أعلى 43.2٪ من CD27+-التعبير عن خلايا الذاكرة في بوابة التحديد (R7). (C) الربع 2 (Q2) تحتوي على خلايا رد فعل على كل من المستضدات المسماة (الببتيد-APC الخامس الببتيد-PE)، وتم فرز هذه الخلايا واستعادتها بشكل فردي في لوحة 96 جيدا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 يسترد تضخيم PCR تسلسل ًا متغيرًا ثقيلًا وخفيفًا للاستنساخ: (A) يتم استرداد كل من الثقيلة (VH) والضوء (Vk أو Vl) سلسلة المناطق المتغيرة باستخدام ردود فعل PCR متداخلة. الخطوة الأول التمهيديات تضخيم إلى الأمام من تسلسل زعيم الأصلي وعكس من داخل المنطقة الثابتة. الأسهم متعددة تمثل مجموعة من بين 7-12 التمهيدية، والتي تستخدم لضمان تغطية واسعة للجراثيم المحتملة. يتم تداخل التمهيديات الخطوة الثانية، محددة للنهايات القصوى لإطار القراءة المفتوح المتغير، وإضافة تسلسل إلى نهايات amplicons التي هي متجانسة للتسلسل المجاور في ناقلات التعبير. (B) يتكون الرابط من سلسلة الضوء الثابتة (Ck أو Cl)، متبوعاً بالمروج سلسلة ثقيلة وتسلسل الببتيد إشارة غير أصلية. يتم ربط المكبرات والرابط والعمود الفقري للبلازميد في نفس الوقت عبر تسلسل متجانس متداخل تم إنشاؤه أثناء تضخيم PCR الخطوة الثانية، ويتم عزلها كبلازميد سليم. السلاسل الثقيلة والخفيفة المؤتلف في ناقلات التعبير النهائي مدفوعة من قبل المروجين CMV مستقلة (ومتطابقة)، وتترجم كبروتينات منفصلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 يتم استرداد التضخيم سلسلة الثقيلة والخفيفة المتغيرة IgG من خلايا واحدة. تم تحميل ردود فعل PCR المتداخلة (الخطوة الثانية) مباشرة على هلام أغاروز 1٪ وتصور. تم تحميل سلسلة ثقيلة (H) وسلسلة ضوء كابا (L) ردود فعل PCR من نفس الخلية في الآبار المجاورة حتى تم ملاحظة الامبوليكونات المقترنة بسهولة. منتجات سلسلة الثقيلة والخفيفة الناجحة هي ما يقرب من 400 نقطة أساس و 350 نقطة أساس على التوالي. يتم الإشارة إلى الاسترداد الناجح للأمبوليكون المقترنة بواسطة (*). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 يتم تأكيد خصوصية المستضد من IgGs المؤتلف. يتم نقل البلازميدات التي تحتوي على تسلسل سلسلة الثقيلة والخفيفة المستردة إلى خلايا HEK للتعبير عنها. بعد أربعة أيام، يتم تقييم الأجسام المضادة المؤتلفة لتفاعل هاليسا. (أ) تم قياس تركيز IgG في الوسائط الواضحة وتم تخفيفه إلى 20 ميكروغرام/مل. تم تقييم مجموعة من الببتيدات المستخدمة للفرز بشكل فردي باستخدام 40 بمول لكل بئر في لوحات streptavidin. تم اختبار جميع الـ IgGs في آبار مكررة. (B) تم إعادة تقييم الحيوانات المستنسخة التي عرضت قياس OD450 >0.5 (#32، #34، #35) باستخدام 1:5 خطوات تخفيف ضد الببتيدات المحددة في الشاشة. (C) مرة واحدة وأكد كإصابة، تم عزل استنساخ بلازميد واحد من استنساخ #34 تحول الأربطة، transfected، وأكد من قبل ELISA. وقد حدث الشيء نفسه بالنسبة للمستنسخين #32 #35 (لم تظهر البيانات). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

الطريقة المعروضة هنا تجمع بين قياس التدفق الخلوي واستنساخ خلية واحدة، والأساليب التي نصفها هنا استنادا إلى الأساليب التي وضعتها سابقا تيلر والزملاء11. يصف عملهم الانتعاش واستنساخ الأجسام المضادة أحادية النسيلة من أجل دراسة ذخيرة الخلية B في البشر على مستوى الخلايا الفردية. لقد قمنا بتكييف المكونات الرئيسية لعمليتها للسماح باستعادة الأجسام المضادة أحادية النسيلة الخاصة بالمستضد من مجموعة من خلايا الذاكرة B، بما في ذلك استراتيجية التمهيدي التضخيم متعددة الخطوات. التعديل الرئيسي هو إضافة مستضد المسمى "الطعم". وقد أُدخلت تعديلات إضافية على البروتوكول المنشور، بما في ذلك (على سبيل المثال لا الحصر) تعديل العمود الفقري لناقلات الاستنساخ إلى بلازميد واحد، وتغطية تمهيدية إضافية لذخيرة النضدة (تسلسل القائد والإطار 1 على حد سواء)، نقل خلايا HEK293 تعليق للتعبير العالي، واستخدام البوليمرات عالية الدقة أثناء تضخيم PCR.

بالنسبة للأساليب الموضحة هنا، فإن الخطوات الأكثر أهمية هي بالقرب من الانتقال بين قياس التدفق الخلوي واستنساخ خلية واحدة. أولا، وضع السليم من الخلايا المفردة فرزها في لوحة أمر ضروري. تعيين تأخير الإفلات بشكل صحيح على فارز خطوة رئيسية. ويجب أيضا أن تؤخذ في الاعتبار العوامل البيئية، مثل انخفاض الرطوبة، حيث وجدنا أن كفاءة الانتعاش لدينا تنخفض انخفاضا كبيرا ما لم يستخدم مدفع ثابت على لوحات الفرز المستهدفة. بعد وضع الخلية، يتم طرد الصفائح للتأكد من أن الخلايا قد اتصلت 10 ميكرولتر من العازلة في الجزء السفلي من الآبار. كل هذه التدابير حاسمة بالنسبة لجزء البيولوجيا الجزيئية لتكون ناجحة. إذا كانت الظروف دون الأمثل لرد فعل النسخ العكسي لخلية واحدة، يمكن أن يكون من الصعب تضخيم PCR حتى β-actin. قوة الطريقة المعروضة هي القدرة على استجواب الملايين من الخلايا وفرز فقط تلك التي تتطابق مع معايير التفاعل مستضد ضد مستضد الاختيار. وهذا يتطلب نسبة الإشارة إلى الضوضاء لتكون عالية قدر الإمكان، ويتم ذلك عن طريق تحسين تركيزات الطعم قبل الفرز. يتم استخدام الطعم المزدوج المسمى للحد من استعادة الخلايا الإيجابية الكاذبة، والتي يمكن أن تحدث إذا كان أحد الفلوروفورس لديه خلفية عالية. استخدام أكثر من طعم مستضد واحد يمكن أن تجعل الإشارة: تحسين الضوضاء أكثر صعوبة، ولكن القدرة على استجواب الببتيدات متعددة في وقت واحد هو فائدة أخرى من هذه الطريقة.

عندما تكون كفاءة الاسترداد منخفضة، يتم استخدام مجموعة من التمهيديات المتداخلة β-actin لتأكيد وجود قالب cDNA. العيب في هذا النهج هو أنه من الصعب تحديد ما إذا كان هناك أي خلية موجودة في البئر أو فشل رد فعل النسخ العكسي، مما يجعل استكشاف الأخطاء وإصلاحها صعبة. في بعض الأحيان سوف يحدث العكس والكفاءة أعلى مما كان متوقعا. الانتعاش نموذجي للسلسلة الثقيلة بين 30-45٪ وسلاسل الضوء هي أعلى، بين 40-60٪. كل تفاعل PCR (الخطوة الأولى والثانية) يستخدم 50 دورة لتضخيم من خلية واحدة. كما أن العدد الكبير من الدورات الإجمالية يجعل هذه الطريقة عرضة للتلوث. ويمكن استخدام تحليل تسلسل الامبوليكون اتّبع لتحديد ما إذا كان قد تم إدخال ملوث، أو إذا كان معدل استرداد مرتفع بشكل غير عادي قد تحقق بصورة مشروعة.

فائدة هذه الطريقة لاسترداد الأجسام المضادة البشرية الأصلية ضد مستضد من الاختيار لديها العديد من القيود الهامة. أولا، يمكن استخدام البروتينات القابلة للذوبان فقط التي يمكن وصفها بأنها "طعم" لتدفق قياس السيتومترية. بالنسبة للأنواع المعروضة في النتائج التمثيلية، استخدمنا سلسلة من الببتيدات المتداخلة المركبة من بروتين تاو، حيث أن استخدام البروتين بأكمله ثبت أنه صعب. استخدام الببتيدات الخطية من المرجح أن لا يكون الأمثل، لأنه قد يحد من تحديد الأجسام المضادة ضد الepitopes غير الخطية أو الهيكلية. ومع ذلك، تمكنا من تحديد العديد من الأجسام المضادة فريدة من نوعها ضد تاو وهذه تخضع حاليا لمزيد من التقييم8،9. وثمة قيد آخر هو انخفاض الإنتاجية لاسترداد البيولوجيا الجزيئية واستنساخ الـ IgGs. تسمح استراتيجية الفرز الأولية بفحص الملايين من الخلايا، ولكن معالجة البيولوجيا الجزيئية اللاحقة تتكون من مراحل متعددة. وقد أدت جهود التحسين الجارية لدمج التكنولوجيات الأحدث، مثل جمعية جيبسون10، إلى تبسيط عدة خطوات، ولكن لا يزال الاختناق هو استنساخ أزواج السلاسل الثقيلة والخفيفة الفردية.

تستخدم طريقة "BSelex" BCR المعرب عنها على سطح خلايا الذاكرة B لتحديد الخلايا التي تعرض تفاعلالمستضد، ثم استرداد هذه الخلايا الفردية عبر قياس التدفق 11و12. وبسبب هذا الاعتماد على BCR، يقتصر الأسلوب على حجرة الخلية B الذاكرة، ولا يلتقط خلايا إفراز الأجسام المضادة (ASCs) مثل البلازما. ومع ذلك، قد يكون هذا النهج مفيداً لاستعادة ذخيرة أوسع من الغلوبين المناعي الخاص بالمستضد اتّبع بالمقارنة بـ ASCs. وتبين دراسات التطعيم ضد الأنفلونزا أنه في حين يمكن أن يهيمن على هذه اللقاحات التفاعلية عدد صغيرمن الحيوانات المستنسخة من الخلايا باء الموسعة، فإن عدد الخلايا B الذاكرة الخاصة بالمستضد نادراً ما يكون 12. مستقبلات الخلايا T (TCR) على سطح الخلايا T تمتلك أوجه التشابه مع مستقبلات الخلية B في ترتيب الجينات وإعادة تركيب هادىن التنوع. وقد وضعت نهج خلية واحدة مماثلة لما هو موضح في الطريقة المعروضة هنا لتقييم ذخيرة الخلية T، بما في ذلك الاستعادة واستنساخ خلية واحدة من سلاسل ألفا وبيتا13. ومع ذلك، يتطلب التعرف على TCR الببتيدات التي تقدمها جزيئات MHC، مما يضيف تعقيدًا كبيرًا لنهج الطعم المسمى لتحديد الخلايا T الخاصة بالببتيد. على عكس الخلايا B، لا تخضع الخلايا T لنضج التقارب للمنطقة المتغيرة بأكملها، لذلك فإن تحديد منطقة CDR3 القصيرة وبعض التسلسل المحيط هو كل ما هو مطلوب لتحديد وإعادة تشكيل. وأخيرا، يصف هذا الأسلوب تحديد جزيئات IgG باستخدام قياس التدفق الخلوي، ولكن من الممكن أيضا استخدام علامات الفينوتيبيك البديلة لتحديد الخلايا B من أنواع متساوية مختلفة.

وفي الوقت الراهن، يجري تطوير أساليب لربط الكمية الهائلة من البيانات التي يتم جمعها من الجيل التالي من التسلسل بالتحليل الوظيفي لخصوصية المستضد، ولكن هذه الأساليب لا تزال قيد التحسين. على الرغم من قيوده، وقد استخدمت الطريقة الموصوفة هنا لتحديد الأجسامالمضادة ذات القيمة العلاجية المحتملة لكل من الأمراض المعدية وغير المعدية 8،14،15،ويمثل موثوق بها نهج لاستعادة IgGs مستضد محددة ذات الصلة من البشر، دون التلاعب واسعة النطاق من الخلايا B أو ثقافة الخلية واسعة النطاق.

Disclosures

أصحاب البلاغ ليس لديهم ما يكشفون عنه

Acknowledgments

ويود المؤلفون أن يشكروا لوسي شماس، ومارثا كوستا، وجولي كيم، ونانسي هيريديا، وجيريمي ماسيدو على الاختبار المكثف للعديد من تعديلات الأسلوب وصقل منصة BSelex الحالية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter MoFlo cell sorting
Biotinylated peptides New England Peptide Cell sorting "bait"
Micro Bio-spin P30 gel column BioRad #7326223
Streptavidin (R-PE) Thermo Scientific SA10041
Streptavidin (APC) Thermo Scientific S32362
CD22 MicroBeads, human  Miltenyi #130-046-401
LS columns Miltenyi #130-042-401
Pre separation filters  Miltenyi #130-041-407
PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19 BD Biosciences BD#340951
PE-Cy7 mouse anti-human CD27  BD Biosciences #560609
FITC mouse anti-human IgG BD Biosciences #560952
DAPI Life Technologies #D21490
RNaseOUT Life Technologies #10777-019
Bovine serum albumin, Fraction V Sigma #A4503
RPMI media Hyclone #SH30096.01
HI FBS (Fetal bovine serum) Invitrogen #10082147
Mastercycler Gradient Eppendorf Model #6325 PCR machine
PCR 96-well plates Phenix MPS-500
PCR Plate mats Phenix SMX-PCR96
Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix Clontech #639125
Superscript IV First-strand synthesis system Invitrogen #18091050
Phusion High Fidelity Polymerase Thermo Scientific F-531-L
Platinum polymerase Invitrogen #10966108
Nuclease-free water QIAGEN #129114
Oligonucleotide primers IDT assorted Primers for all PCR steps
Gel Extraction Kit QIAGEN #28706
PCR Purification kit QIAGEN #28106
Miniprep Kit QIAGEN #27106
NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5520S Gibson assembly
Expi293 Expression Media Invitrogen #A14351-01
ExpiFectamine 293 Transfection Kit Invitrogen #A14525
Opti-MEM Media Invitrogen #31985070
CO2 incubator (Multitron)
Octet RED384 System Pall/ Forte Bio
Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates Thermo Scientific #15500
Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area Corning #3690
Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody Jackson Labs #109-036-097
Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody Jackson Labs #115-035-072
SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component)  KPL #52-00-03
TMB Stop Solution KPL #50-85-06

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Su, K. Y., Watanabe, A., Yeh, C. H., Kelsoe, G., Kuraoka, M. Efficient Culture of Human Naive and Memory B Cells for Use as APCs. Journal of Immunology. 197 (10), 4163-4176 (2016).
  2. Corti, D., Lanzavecchia, A. Broadly neutralizing antiviral antibodies. Annual Review of Immunology. 31, 705-742 (2013).
  3. Steinitz, M., Klein, G., Koskimies, S., Makel, O. EB virus-induced B lymphocyte cell lines producing specific antibody. Nature. 269 (5627), 420-422 (1977).
  4. Bloom, A. D., Nakamura, F. T. Establishment of a tetraploid, immunoglobulin-producing cell line from the hybridization of two human lymphocyte lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2689-2692 (1974).
  5. Olsson, L., Kaplan, H. S. Human-human hybridomas producing monoclonal antibodies of predefined antigenic specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (9), 5429-5431 (1980).
  6. Lechner, J., et al. Alterations in Circulating Immune Cells in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. Scientific Reports. 5, 16754 (2015).
  7. Loken, M. R., Brosnan, J. M., Bach, B. A., Ault, K. A. Establishing optimal lymphocyte gates for immunophenotyping by flow cytometry. Cytometry. 11 (4), 453-459 (1990).
  8. Pascual, G., et al. Immunological memory to hyperphosphorylated tau in asymptomatic individuals. Acta Neuropathologica. 133 (5), 767-783 (2017).
  9. van Ameijde, J., et al. Enhancement of therapeutic potential of a naturally occurring human antibody targeting a phosphorylated Ser(422) containing epitope on pathological tau. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 59 (2018).
  10. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  11. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. Journal of Immunological Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  12. Wrammert, J., et al. Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus. Nature. 453 (7195), 667-671 (2008).
  13. Han, A., Glanville, J., Hansmann, L., Davis, M. M. Linking T-cell receptor sequence to functional phenotype at the single-cell level. Nature Biotechnology. 32 (7), 684-692 (2014).
  14. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).
  15. Jones, H. G., et al. Structural basis for recognition of the central conserved region of RSV G by neutralizing human antibodies. PLoS Pathogens. 14 (3), 1006935 (2018).
  16. Janssen Vaccines & Prevention B.B. US patent. , U.S. Patent Application No. 20170210787, Published July 27, 2017 (2017).

Tags

علم المناعة والعدوى العدد 150 مرجع الخلية B مستقبلات الخلايا B استنساخ خلية واحدة فرز الخلايا اكتشاف الأجسام المضادة استنساخ الخلايا B خلية الذاكرة B سلسلة ثقيلة سلسلة الضوء
طريقة فحص خلية واحدة لاختيار واستعادة الأجسام المضادة مع الخصائص المطلوبة من الذاكرة البشرية المخصب B مجموعات الخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perry, S. T., Keogh, E., Morton, M., … More

Perry, S. T., Keogh, E., Morton, M., Koudstaal, W., Pascual, G. Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations. J. Vis. Exp. (150), e59809, doi:10.3791/59809 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter