Summary
这里介绍了创建能够生长的基于肽的小型单片杆菌囊泡的协议。为了便于膜肽的囊泡生产,这些囊泡配备了转录翻译系统和肽编码质粒。
Abstract
生化反应的分块化是合成细胞的核心方面。为此,肽反应室是脂体或脂肪酸基囊泡的诱人替代品。在体囊外部或内部,肽可以很容易地表达并简化膜前体的合成。此处提供了一种基于两栖弹性蛋白样多肽 (ELP) 利用玻璃珠脱水补液创建直径为 ±200 nm 的囊泡的协议。还介绍了细菌ELP表达和通过逆温循环纯化的协议,以及它们与荧光染料的共价功能化。此外,本报告还描述了一种使RNA aptamer dBroccoli在ELP囊泡内转录的协议,作为生化反应的一个不太复杂的例子。最后,提供了一个方案,允许荧光蛋白和膜肽的囊泡表达,而后者的合成导致囊泡生长。
Introduction
合成活细胞系统的创建通常从两个不同的方向进行。在自上而下的方法中,细菌的基因组被简化为其基本成分,最终导致最小的细胞。在自下而上的方法中,人工细胞从分子组分或细胞子系统中组装,需要功能上集成到一致的细胞样系统中。
在de novo方法中,必要的生化成分的分门别类通常是使用磷脂或脂肪酸1、2、3、4制成的膜实现的。这是因为"现代"细胞膜主要由磷脂组成,而脂肪酸被认为是益生菌膜外壳5、6的可信候选体。为了形成新膜或促进膜生长,必须从外部7提供两栖积木,或者最好使用相应的合成代谢工艺在膜腔内生产4 ,8.
脂质合成是一个相对复杂的代谢过程,而肽可以很容易地使用无细胞基因表达反应9,10。因此,由两栖肽形成的肽膜是脂质膜的有趣替代品,作为能够生长11的人工细胞模拟的外壳。
嗜血弹性蛋白样二块共聚物(ELPs)是一种有吸引力的肽类,它可以作为这种膜12的构建基块。ELPs的基本氨基酸序列图案是(GaGVP)n,其中"a"可以是除proline以外的任何氨基酸,"n"是主题重复的数量13,14,15,16,17.ELPs已经创建与主要含有苯丙氨酸a和亲水性块主要由谷氨酸11组成的疏水块。根据和溶液参数(如pH和盐浓度),ELPs在温度Tt下表现出所谓的逆温过渡,其中肽经历了从亲水性到疏水性完全可逆的相变状态。使用"TX-TL"细菌细胞提取物11、18、19、20、21,在囊泡内轻松实现肽的合成,这提供了耦合转录和翻译反应所需的所有组件。
TX-TL系统封装在一起,DNA模板利用玻璃珠的脱水补液将ELP编码到ELP囊泡中作为固体支撑。囊泡的形成是通过从珠表面11的干肽的补液而形成的。可以使用其他方法22用于囊泡形成,这可能显示较低的多分散度和较大的囊泡尺寸(例如,电形成、乳液相转移或基于微流体的方法)。为了测试封装方法的可行性,荧光能的转录法dBroccoli2可以交替使用11,这比TX-TL系统的基因表达要复杂。
由于囊泡中膜积块的表达及其随后的加入膜,囊泡开始生长11。ELP的膜结合可以通过FRET测定进行演示。为此,用于形成初始囊泡总体的 ELPs 与构成 FRET 对的相等份额中的荧光染料结合使用。当在囊泡中表达未标记的ELP并将其并融入膜中时,膜中标记的ELP被稀释,因此FRET信号减小11。铜催化阿齐德-烷基环增法是一种通用且常见的结合方法。使用稳定配体,如三s(苯基苯甲酰乙-胺),反应可以在生理pH的水溶液中进行,无需水解反应物11,这适用于结合反应涉及肽。
以下协议详细介绍了生长基于ELP的肽类的制备情况。介绍了使用玻璃珠法的肽和囊泡形成表达式。此外,还介绍了如何实现氟化德布罗图阿图默的转录和ELP囊泡内蛋白质表达的转录-翻译反应。最后,提供了一个ELPs与荧光荧光的结合程序,它可以用来通过FRET测定11来证明囊泡的生长。
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Protocol
1. 类似艾莱他一样的多肽的表达
- 第1天:为肽表达准备启动培养和供应
- 制备和高压灭菌表达培养瓶(4 x 2.5 L)和3升LB介质。对于 1 L LB 介质,将 25 g LB 粉末添加到 1 L 的超纯水中。
- 使用 100 mL LB 培养基、50 μL 无菌过滤 (0.22 μm 过滤器) 氯霉素溶液(EtOH 中为 25 mg/mL)和 50 μL 无菌过滤 (0.22 μm 过滤器) 卡比霉素溶液(50% EtOH 和 50% 超纯水)制备起动机培养基。
- 从含有大肠杆菌菌株 BL21 (DE3)pLySS 的预制造细菌库存中加入一小条条纹,用 pET20b(+) 表达载体编码多肽序列 MGHGVGVP ((GEGVP)4(GVGVP))4((GFGVP)4(GVGVP))3(GFGVP)4GWP(简称EF)至预加热的100 mL起动机培养物,在37°C下孵育16小时,在摇动培养箱中250rpm(大肠杆菌菌株和载体可应要求提供)。
- 在 37°C 过夜时预热表达文化瓶和 LB 介质,以便它们为第二天做好准备。
- 第2天:蛋白质表达
- 在每个表达培养瓶中加入750 mL的LB介质,将375μL的无菌过滤(0.22μm过滤器)氯霉素(EtOH中的25毫克/升)和375μL的无菌过滤(0.22 μm过滤器)的霉菌素(50%EtOH和50%超纯水中的100毫克/mL)。
- 搅拌分配抗生素后,以2 mL的介质作为600nm(OD600)光学密度测量的参考样本。
- 将 7.5 mL 的起始培养基添加到表达瓶中,在 37°C 下在 250 rpm 下孵育 1 小时。
- 此步骤后,每 20 分钟检查一次每个烧瓶的 OD600。
- 当光学密度达到约0.8时,将温度降低至16°C,并通过在超纯水中将750μL的1 M无菌过滤β-同丙基硫丙酮(IPTG)加入每个表达瓶中诱导肽表达。
- 在16°C下用诱导细菌孵育表达瓶16小时,转速为250rpm。
- 第3天:提取表达的多肽
- 预称重离心烧瓶,以便在收获后确定细胞颗粒的质量。
- 使用4000 x g和4°C的预冷却离心机,通过离心从表达瓶中采集所有细菌20分钟。
- 倒出上清液,将离心机瓶在无菌纸巾上。
- 称量离心烧瓶并计算细胞颗粒质量。
- 通过移液将细胞从750 mL的原始细胞培养基中悬浮在15 mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.4)中,并在4000 x g下离心20分钟,在4°C下。倒出上清液,将离心机瓶在无菌纸巾上。
- 使用PBS(pH 7.4)补充酶酶(1mg/mL)、1mM苯基硫磺酸氟化物(PMSF)、1 mM苯酰胺和0.5 U的DNasE I,将裂解步骤的细胞颗粒重新悬浮在每1克细胞颗粒的2 mL缓冲液中。
- 用8W的声波器在冰上对细胞进行进一步裂变,9分钟,交替10秒的声波和20秒的暂停步骤,然后暂停9分钟,在此期间样品应在冰上冷却。再次重复 9 分钟的声波步骤。
- 在核酸沉淀中,每1L的原始细胞培养中加入2 mL 10%(w/v)聚乙烯胺(PEI)。
- 将样品分配到2 mL离心管中,在60°C孵育10分钟,随后在4°C下孵育10分钟。
- 在4°C下在16,000 x g下将溶液离心10分钟,并收集含有ELP的上清液。
- 通过逆温循环进行蛋白质纯化:
- 将上清液调整到pH值2,将肽的亲水部分切换到疏水性,并诱导聚合。为了调整pH,使用磷酸和氢氧化钠。pH 条纹足以确定 pH 水平。
- 为了提高样品的纯化产量,将样品加热到60°C,并加入高达2M的氯化钠。
- 随后,在室温(RT)下,在16,000 x g下将样品离心10分钟。
- 丢弃上清液,在 PBS 中重新溶解颗粒(但与上一步相比,只使用了初始体积的一半)。
- 用磷酸和氢氧化钠将pH态调整到7。pH 条纹足够精确,足以确定 pH。
- 随后在4°C下以16,000 x g将样品离心10分钟。
- 收集上清液并重复步骤 1.4.1~1.4.6,总和为 3 倍,但步骤 1.4.4 的最后一次重复中仅添加水而不是 PBS。
- 使用吸收光谱仪测量肽的浓度。在 280 nm 时使用 5500/M/cm 的消光系数。
- 将 ELP 的浓度调节到 700 μM。
2. 使用玻璃珠法进行碎鱼生产
- 使用离心真空集中器将 ELP 溶液浓缩至 1.1 mM。
- 将浓缩ELP溶液的200μL与1,250μL的2:1氯仿/甲醇混合物混合,然后涡旋。
- 将 1.5 克球形玻璃珠(212~300 μm 大小)添加到 10 mL 圆形底瓶中。
- 将含有ELP和氯仿/甲醇混合物的溶液加入圆底烧瓶,通过轻轻摇动混合。
- 将烧瓶连接到旋转蒸发器。将转速调节到 150 rpm,并将压力调节到 -0.2 x 105 Pa (-200 mbar)约 4 分钟,直到液体在室温下蒸发。
- 将圆形底瓶放入干燥器中至少 1 小时,以确保剩余的氯仿和甲醇蒸发。为避免玻璃珠丢失,松散连接的铝箔应包裹在圆形底瓶开口处。
- 对于单个实验,将 100 mg 肽覆盖的玻璃珠与 60 μL 的膨胀溶液(如 PBS)混合。在25°C下孵育此样品5分钟。
- 使用桌面离心机快速将样品离心,以沉淀玻璃珠。
- 使用移液器收集包含囊泡的上清液。
3. 囊泡内RNA阿普塔默德布罗图的转录
- 使用含有 RNase 去污溶液的湿巾清洁实验室工作台,以创建无 RNase 的工作环境。
- 混合ssDNA (5 μM) 包括T7前电机和德布罗图序列(GAGACGCGGGGGCTCTATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATGGGGGGGGATATGGGGGGGGGGCTC),以及无核酸酶水中的非编码链(5 μM)RNAPol反应缓冲液[40 mM Tris-HCl (pH = 7.9),6 mM MgCl2,1 mM 二硫精醇 (DTT) 和 2 mM 精氨酸] ,为转录反应准备 DNA 模板。
- 在90°C孵育溶液5分钟,然后缓慢温度降至20°C30分钟。
- 通过在DMSO的5mL中溶解1.26毫克的DFHBI,制备1 mM(5Z)-5-(3-5-二氟化-4-羟基苯甲酸酯)-2、3-二甲基-3、5-二氢-4H-imidazol-4-1(DFHBI)溶液。
- 通过混合RNAPol反应缓冲液[40 mM Tris-HCl(pH = 7.9)、6 mM MgCl 2、1 mM二硫精醇(DTT)和2mM精氨酸]与125 mM KCl制备转录反应, 15 mM MgCl2, 4 mM rNTP, 10 μM DFHBI, 200 nM DNA 模板, 0.5 U/μL RNase抑制剂鼠和水。
- 在反应开始之前,加入4U/μL T7聚合酶。
- 在步骤 2.7 中使用此反应混合物作为膨胀溶液,并在实验期间(通常为 1 小时)在 37°C 孵育。
4. 转录-转换 (TX-TL) 反应
注:对于转录-转化反应,需要粗细胞提取物以及反应缓冲液和DNA。粗细胞提取物是按Sun等人18所述制备的。对于 TX-TL 反应,请使用以下:粗大肠杆菌提取物的 33% (v/v),42% (v/v) 反应缓冲液,以及 25% (v/v) 苯酚-氯仿纯化 DNA 加添加剂。最终浓度约为9mg/mL蛋白质,50 mM HEPES (pH = 8),1.5 mM ATP,1.5 mM GTP,0.9 mM CTP,0.9 mM UTP,0.2mg/mL tRNA,26 mM辅酶A,0.33 mM M NAD,0.75 mM cAMP,68 mM叶酸,1m m m m dinei,30 mM PEP、1 mM DTT、2% PEG-8000、13.3 mM 麦芽糖、1 U T7 RNA 聚合酶和 50 nM 质粒 DNA 在超纯水中。
-
DNA模板的苯酚氯仿纯化
- 用 5 mL 的 LB 介质和 5 μL 的无菌过滤 (0.22 μm 过滤器) 卡比西林溶液(50% EtOH 和 50% 超纯水中 100 mg/mL)制备 6 种隔夜培养物。
- 从含有DH5+大肠杆菌的预造细菌库存中加入一小块条纹,将pET20b(+)表达载体加入每个预加热的5 mL过夜培养物中,并在37°C下孵育16小时,转速为250 rpm。根据要表达的肽 (EF) 或蛋白质 (YPet 或 mVenus),使用特定的编码质粒。
- 按照用户手册中描述的微型制备试剂盒或按照张等人24提供的协议提取质粒。
- 制备预纯化质粒DNA的100μL(浓度范围为200~600纳克/μL),并在微离心管中与100μL的罗蒂酚/氯仿/异丙醇(pH = 7.5~8.0)混合,实现更好的相分离。
- 轻轻反转管达6倍,在RT时以16,000 x g离心5分钟。
- 在管的上相中加入 200 μL 氯仿,并将管反转至 6 倍。
- 在 RT 时将样品在 16,000 x g下离心 5 分钟。
- 将上清液移至单独的管中,并加入10μL的3M醋酸钠,用于乙醇沉淀。
- 加入1 mL-80°C冷乙醇,将样品储存在-80°C1小时。
- 在 4°C 下在 16,000 x g下将样品离心 15 分钟。
- 去上清液,加入1 mL的-20°C冷70%(v/v)乙醇。
- 在 16,000 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。
- 通过移液去除液体。小心不要干扰DNA颗粒。
- 将样品储存在RT中约15分钟,以蒸发剩余的乙醇。
- 向样品中加入超纯水,将样品浓度调整到约300 nM,在260nm处通过吸收进行测量。
-
TX-TL 反应的准备
- 在冰上解冻制备的粗细胞提取物和反应缓冲液。
- 对于 60 μL 反应混合物,将质粒 DNA(苯酚-氯仿纯化)添加到反应缓冲液的 37.5 μL [50 mM HEPES (pH = 8)、1.5 mM ATP、1.5 mM GTP、0.9 mM CTP、0.9 mM UTP、0.2 mg/mL tRNA、26 mM 辅酶 A、0.33 mM,0.75 mM cAMP,68 mM 叶酸,1 mM精氨酸,30 mM PEP,1 mM DTT,2% PEG-8000 和 13.3 mM 麦芽糖,然后加入 28.7 μL 的粗细胞提取物。用超纯水填充到最终体积至 58.8 μL。
- 在反应开始之前,加入1.2 μL的T7 RNA聚合酶溶液,通过上下移液混合样品。
- 在步骤 2.7 中使用此反应混合物作为膨胀溶液,并在实验期间(通常为 4-8 小时)在 29°C 孵育。
5. 通过铜催化阿齐德-烷基宁惠斯根环状剂将弹性蛋白样多肽与荧光团结合
- 在 DMSO 中制备 20 mM NHS-azide 链接剂 (β-阿奇丁酸 N-羟基琥珀酯) 溶液。
- 将 250 μL 的 ELP 溶液 (600 μM) 与 PBS(8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.42 g/L Na2HPO4、0.27 g/L K2HPO 4、pH = 7.2)和 NHS-azide (1.2 mM) 混合,并在 RT 孵育 12 小时。
- 将样品装入10 kDa透析盒中,在4°C下储存12小时,在1L的超纯水中去除盐和残留的NHS-azide。
- 将活性ELP(500μM)与烷基偶联染料(500μM)、Cy5-烷基或Cy3-烷基。
- 将该样品与1 mM TBTA(三苯基苯甲酸酯)胺、10 mM TCEP(三组(2瓶乙酰)-盐酸磷酸混合,并在4°C孵育12小时。
- 将样品装入10 kDa透析盒中,在4°C下储存12小时,在1L的超纯水中,去除盐和残留的烷基结合染料。
- 这些染料修饰的ELPs用于Cy3标记ELP和Cy5标记ELPs的1:1混合物中,类似于第二部分中的肽。
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Representative Results
囊泡生产
图1显示了用不同膨胀溶液和玻璃珠法制备的囊泡的透射电子显微镜(TEM)图像(另见Vogele等人11)。对于图1A中的样本,只有PBS用作膨胀溶液,以证明囊泡的形成并确定其大小。当TX-TL被用作膨胀溶液时(图1B),囊泡也形成。进行了动态光散射(DLS)测量,表明玻璃珠法对囊泡形成有影响。图 2描述了在 PBS 中制备不含玻璃珠的 EF 样品的测量强度自相关曲线,以及使用以 PBS 作为膨胀溶液的玻璃珠法制备的 EF 样品。大小是根据一个cumulantfit25计算的,当在没有玻璃珠法的情况下制备囊泡时,其直径为134nm,多分散度为25%。当使用玻璃珠时,聚氨酯的配合使直径达到168nm,多分散度为21%。
在囊泡转录 11
图 3显示了 EF 囊泡(绿色)内 dbroccoli aptamer 转录的荧光强度曲线随时间而发生的情况。作为阴性对照,DNase I被添加到肿胀溶液中,因此在囊泡形成期间也加入(蓝色)。测量在荧光板读取器中进行,激发在 480 nm,发射在 520 nm。
在囊泡蛋白表达中 11
图4显示了使用荧光板读取器在ELP囊泡内表达的两种荧光蛋白的荧光强度。激励在 500 nm 时进行,在 520 nm 下发射。对mVenus的转录-转录(图4A)进行了研究ELP囊泡中蛋白质的表达动力学和表达水平。需要注意的是,囊泡形成后,囊泡和外溶液的含量是相同的。因此,为了抑制囊泡外的蛋白质表达,将抗生素卡那霉素添加到外部溶液中。作为一种控制,卡那霉素也被添加到肿胀溶液中,在这种情况下,囊泡内的蛋白质表达被抑制。这进一步表明小分子卡那霉素留在囊泡内,并表明在这些实验的时间尺度上,该分子的膜不能渗透。如果卡那霉素扩散到膜中,mVenus表达就不会被抑制,在5小时时,荧光会更高。在第二个实验中,进行了YPet的表达(图4B)。选择这两种蛋白质是因为它们比GFP表现出更快的成熟时间。此外,T7启动子用于mVenus转录和用于YPet转录的构成启动子,以表明诱导和连续表达是可能的。
FRET 测定 11
图5A显示了FRET测定结果,以表明ELP结合膜。因此,囊泡是使用两个同样浓缩的荧光肽结构的混合物生产的。这些是Cy3-EF(捐赠者)和Cy5-EF(接受者)。在时间 t = 0 时,测量了起始 FRET 电平。捐赠者的信号和FRET信号取决于膜中染料之间的平均距离。在表达膜ELPs时,额外的肽结合到膜中,从而增加FRET对之间的平均距离。后者是通过供体荧光的增加和FRET信号在t = 2.5 h时的下降来测量的。图5B显示了负对照。在这里,卡那霉素在囊泡形成前被添加到肿胀溶液中。卡那霉素抑制蛋白质表达;因此,FRET 没有变化是可见的。请务必注意,此测定仅显示 EF 自成。
图 1:代表 TEM 图像。(A) 在膨胀溶液PBS中形成的 EF囊泡.(B) 在膨胀溶液TX-TL中形成的EF囊泡。刻度条 = 200 nm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:代表 DLS 数据。由 DLS 测量的强度自相关曲线。蓝色曲线描绘了PBS中没有玻璃珠法制备的EF肽。红色曲线描绘了使用玻璃珠法和 PBS 作为膨胀溶液生产的 EF 溶液。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:德布罗科利转录。在EF囊泡内,德布罗科利阿普的转录的代表性数据。绿色曲线描述荧光信号和蓝色曲线,用封装的DNase I进行控制测量。
图4:肽囊内的蛋白质表达。(A) 质粒编码 mVenus 和 TX-TL 表达式混合被封装在 ELP 囊泡中.大约 5 小时后,荧光饱和。当抗生素卡那霉素也封装时,没有观察到荧光。(B) 在包封装YPet质粒时也获得类似的结果。误差条表示在15分钟的时间范围内,在指定时间内测量值的标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:FRET测定。(A) 在时间 t = 0 处启动荧光水平,用于供体发射和 FRET 信号(受体发射)。在 t = 2.5 h 时,供体显示发射增加,FRET 信号减少。(B) 当囊泡内只表达亲水性ELP时,FRET信号和供体发射保持不变。误差条表示在15分钟的时间范围内,在指定时间内测量值的标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。
补充文件:包含所有质粒序列,并包含基因序列。请点击此处下载此文件。
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Discussion
薄膜补液是创建小型单片囊泡的常见程序。故障的主要来源是对程序中使用的材料处理错误。
最初,ELPs由大肠杆菌细胞产生。ELP 纯化后的产量可能有很大差异,具体取决于协议在关键步骤中执行的谨慎程度。这些是逆温循环 (ITC) 步骤和降水后 ELP 的重新悬浮。为了纯化,我们通过添加磷酸触发了肽的疏水性崩溃,磷酸将pH值变为酸性,并导致亲水块中谷氨酸侧链的亲酸侧链的亲酸。在此步骤之后,两个模块在 RT 处均具有疏水性。最好使用盐已经存在于溶液中的酸来保持离子强度不变,但也可以使用盐酸等其他酸。为了增加ELP产量,可以增加盐,以增强增熟过程,因为盐降低过渡温度Tt,使ELP更具疏水性。通常使用氯化钠,但硫酸钠等热带盐要好得多,而盐浓度可以接近其溶液极限。使用水浴的额外加热可以进一步提高产量。
另一个关键步骤是重新溶解 ELP 颗粒。为了获得最大的ELP溶解度,溶液应预冷却,快速的pH值调整有助于更快地溶解颗粒。pHH 可能需要在此过程中多次重新调整。为进一步改进,样品可在4°C下储存在冰箱中,应避免摇动样品。要交换盐分,最好选择在纯化方案末尾的透析步骤。原则上,国泰公司可用于将肽与含盐的上清液分离。但根据以前的盐浓度,残留盐仍然可以在这个颗粒中找到。此外,透析可用于浓缩实验所需的肽,而不会像以前那样损失。
下一个关键步骤是氯仿/甲醇混合物的蒸发。在压力降低的蒸发过程中,煮沸的延迟会导致飞溅或湍流,从而导致玻璃珠的大量损失。这可以通过过滤器或组织来预防。当使用干燥器时,也会出现同样的问题,但圆底瓶开口处的铝箔可用于防止这种情况发生。对于处理ELP涂层玻璃珠,建议使用一次性防静电微刮,这也减少了损失并简化了程序。
使用各种肿胀溶液(如PBS和转录混合)的囊泡肿胀是直接的,不易出错。但是,对于 TX-TL 系统,可能会出现高达 10% 的批次变化。为了尽量减少此问题,所有实验应只使用一批无细胞提取物进行,该提取物可用于多达 3,000 种反应。补液后,囊泡含量和外溶液是肿胀溶液。不应对外部溶液进行纯化,因为这可能改变囊泡内外的渗透压力差。其结果将是一个不受控制的大小变化,甚至爆裂的囊泡。因此,外部可能的反应应仅被抑制。根据反应的不同,这可以通过添加DNase I来消化目前的DNA,或者添加抑制翻译的抗生素,如卡那霉素。
与其他制备方法相比,玻璃珠薄膜补液具有多种优点。与溶剂注射相比,不需要乳液相转移或溶剂微流体置换,因为初始溶剂完全蒸发,肽在水溶液中补水。因此,玻璃珠法特别适用于TX-TL等敏感样品,因为其他方法中使用的残留有机溶剂会显著影响甚至破坏这些样品。此外,该协议简单明了,不易出错,并且易于扩展。由于表面与体积比较大,因此只需要少量玻璃珠,并且可实现高通量的高度并行化。
玻璃珠法的主要缺点是,它只可用于创建小型单片囊泡,这无法通过荧光显微镜观察到。当需要对单个囊泡动力学进行微观观察时,所述方法有些有限,有时是必要的(例如,在观察潜在的囊泡分裂过程时)。此外,SUV的体积小限制了低浓度成分(如肽编码质粒)的封装,这解释了肽表达相对较低的原因。基础封装过程是一个泊森过程,因此任何特定组件的浓度必须至少为 150 nM,才能保证封装概率为 95%。因此,在这些实验中观察到囊泡尺寸如此大的增加是十分了不起的。
这里提出的协议将使研究人员能够从类似艾莱他一样的多肽中产生基于肽的囊泡。它还为生产由肽膜封装的人工细胞状结构提供了机会,这些结构代表了由脂肪酸或磷脂制成的经典隔间的有吸引力的替代品。肽具有优势,因为它们可以在无细胞环境中(例如,这里使用的TX-TL系统中)轻松表达,这使得膜生长与囊泡内的转录-转换过程直接耦合。此外,ELP 可以根据特定的物理化学参数进行设计和调整,例如轮廓长度、所用除滞块的疏水性/亲水性以及对刺激的敏感性(如 pH 或离子强度)。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢通过DFG TRR 235(生命出现,项目P15)、欧洲研究理事会(赠款协议694410 AEDNA)和TUM国际科学与工程研究生院IGSSE(项目9.05)提供的财政支持。.我们感谢E.Falgenhauer在样品制备方面的帮助。我们感谢A.杜平和M.施瓦茨-席林在TX-TL系统和有益的讨论方面所做的帮助。我们感谢荷兰进行了有益的讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| Chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| Phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
References
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