Summary
Præsenteret her er protokoller til oprettelse af peptid-baserede små af vesikler i stand til vækst. For at lette vesiculo produktion af membranen peptid, disse vesikler er udstyret med en transskription-oversættelse system og peptid-kodning plasmid.
Abstract
Opdeling af biokemiske reaktioner er et centralt aspekt af syntetiske celler. Til dette formål tjener peptidbaserede reaktions segmenter som et attraktivt alternativ til Liposomer eller fedtsyre baserede vesikler. Eksternt eller inden for vesicles, peptider kan let udtrykkes og forenkle syntesen af membran prækursorer. Forudsat her er en protokol til oprettelse af vesikler med diametre på ~ 200 Nm baseret på amfifile elastin-lignende polypeptider (ELP) udnytte dehydrering-rehydrering fra glasperler. Også præsenteret er protokoller for bakteriel ELP udtryk og rensning via inverse temperatur cykling, samt deres kovalente funktionalisering med fluorescerende farvestoffer. Desuden beskriver denne rapport en protokol, der gør det muligt at transkriptionen af RNA-aptamer dBroccoli i ELP-vesikler som et mindre komplekst eksempel på en biokemisk reaktion. Endelig er der en protokol, som giver mulighed for vesiculo ekspression af fluorescerende proteiner og membran peptid, mens syntesen af sidstnævnte resulterer i vesikel vækst.
Introduction
Skabelsen af syntetiske levende cellulære systemer er normalt gribes an fra to forskellige retninger. I top-down-metoden reduceres genomet af en bakterie til dens væsentlige bestanddele, hvilket i sidste ende fører til en minimal celle. I bottom-up-tilgangen samles kunstige celler de Novo fra molekylære komponenter eller cellulære delsystemer, som skal integreres funktionelt i et ensartet celle lignende system.
I de Novo-tilgangen opnås der sædvanligvis afskærmning af de nødvendige biokemiske komponenter ved hjælp af membraner fremstillet af phospholipider eller fedtsyrer1,2,3,4. Dette skyldes, at "moderne" cellemembraner hovedsageligt består af phospholipider, mens fedtsyrer betragtes som plausible kandidater af prebiotiske membran kabinetter5,6. For dannelsen af nye membraner eller for at lette membran vækst, skal amfifile byggeklodser leveres fra det udvendige7 eller ideelt gennem produktion i et membranøs rum ved hjælp af de tilsvarende anabolske processer4 ,8.
Mens lipid syntese er en relativt kompleks metabolisk proces, peptider kan produceres ganske let ved hjælp af celle-fri genekspression reaktioner9,10. Derfor, peptid membraner dannet af amfifile peptider repræsenterer et interessant alternativ til lipid membraner som kabinetter for kunstig celle efterligner, der er i stand til at vokse11.
Amphiphilic elastin-lignende di-Block copolymerer (ELPs) er en attraktiv klasse af peptider, som kan tjene som byggesten for sådanne membraner12. Den grundlæggende aminosyresekvens motiv af ELPs er (gagvp)n, hvor "a" kan være enhver aminosyre bortset fra prolin og "n" er antallet af motiv gentagelser13,14,15,16,17 . Elp'er er blevet oprettet med en hydrofobe blok, der hovedsagelig indeholder phenylalanin for a og en hydrofile blok, som hovedsagelig består af glutaminsyre11. Afhængigt af a-og Solution-parametrene, såsom pH-og saltkoncentration, udviser ELPs en såkaldt omvendt temperatur overgang ved temperatur Tt, hvor peptiderne gennemgår en fuldt reversibel faseovergang fra en hydrofile til hydrofobe Staten. Syntesen af peptider kan let implementeres inde vesikler ved hjælp af "TX-TL" bakteriel celle ekstrakt11,18,19,20,21, som giver alle nødvendige komponenter til koblede transskription og oversættelses reaktioner.
TX-TL-systemet blev indkapslet sammen, med DNA-skabelonen, der koder ELPs i ELP-vesikler, der udnytter dehydrering-rehydrering fra glasperler som en solid støtte. Dannelsen af vesikler sker gennem rehydrering af de tørrede peptider fra perlerne overflade11. Andre metoder22 til vesikel dannelse kan anvendes, som potentielt viser lavere polydispersitet og større vesikle størrelser (f. eks. Elektro dannelse, overførsel af emulsions fase eller mikrofluidics-baserede metoder). For at afprøve indkapsling metodens levedygtighed kan transkriptionen af den fluorogene aptamer dBroccoli23 alternativt anvendes11, hvilket er mindre komplekst end genekspression med TX-TL-systemet.
På grund af ekspression af membranen byggesten i vesiculo og deres efterfølgende inkorporering i membranen, begynder vesikler at vokse11. Membran inkorporering af ELPs kan påvises gennem en FRET analyse. Til dette formål er de Elp'er, der anvendes til dannelse af den oprindelige vesikle population, konjugeret med fluorescerende farvestoffer i lige store dele, som udgør et FRET pair. Ved ekspression af ikke-mærkede Elp'er i vesiculo og deres inkorporering i membranen, fortyndes de mærkede Elp'er i membranen, og derfor falder FRET-signalet11. Som en alsidig og almindelig metode til konjugering anvendes kobberkatalyseret Azid-alkyne cycloaddition. Ved brug af en stabiliserende ligand såsom tris (benzyltriazolylmethyl)-Amin kan reaktionen udføres i en vandig opløsning ved en fysiologisk pH-værdi uden hydrolyse af reactanter11, hvilket er passende for konjugering reaktioner involverer peptider.
Følgende protokol indeholder en detaljeret beskrivelse af forberedelsen til dyrkning af ELP-baserede peptidosomer. Udtrykket af peptider og vesikel dannelse ved hjælp af glasperler metode er beskrevet. Desuden er det beskrevet, hvordan man implementerer transkriptionen af den fluorogene dBroccoli aptamer og transskription-oversættelse reaktion for protein ekspression inde i ELP vesikler. Endelig er der fastsat en procedure for konjugering af Elp'er med fluorophorer, som kan bruges til at påvise vesikel vækst gennem en FRET-analyse11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ekspression af elastin-lignende polypeptider
- Dag 1: forberedelse af en start kultur og forsyninger til peptidekspression
- Forbered og autoklave udtryks kultur kolber (4 x 2,5 L) og 3 liter lb medium. For 1 liter lb-medium tilsættes 25 g lb-pulver til 1 liter ultrarent vand.
- Forbered en start kultur med 100 ml lb-medium, 50 μl sterilfiltreret (0,22 μm filter) chloramphenicol opløsning (25 mg/ml i EtOH) og 50 μl sterilfiltreret (0,22 μm filter) carbenicillin opløsning (100 mg/ml i 50% EtOH og 50% ultrarent vand).
- Tilføj en lille stribe fra en præ-lavet bakteriel bestand indeholdende E. coli Strain BL21 (DE3) Plyss med pET20b (+) ekspressions vektor kodning af polypeptidsekvensen MGHGVGVP ((GEGVP)4(gvgvp))4((gfgvp)4(gvgvp))3 (Gfgvp)4GWP (forkortet EF) til en præ-opvarmet 100 ml start kultur og inkubér ved 37 °c i 16 timer med 250 rpm i en ryste inkubator (E. coli -stammer og vektorer er tilgængelige efter anmodning).
- Forvarm udtryks kultur kolberne og LB-mediet ved 37 °C natten over, så de er klar til næste dag.
- Dag 2: protein udtryk
- Tilsæt 750 ml lb medium til hver ekspressions dyrknings kolbe, 375 μl sterilfiltreret (0,22 μm filter) chloramphenicol (25 mg/ml i EtOH) og 375 μl sterilfiltreret (0,22 μm filter) carbenicillin-bestand (100 mg/ml i 50% EtOH og 50% ultrarent vand).
- Efter agitation for at distribuere antibiotika udtages 2 mL af mediet som referenceprøve til måling af optisk tæthed ved 600 nm (OD600).
- 7,5 mL af start kulturen tilsættes til udtryks kolben og inkubates i 1 time ved 37 °C med 250 rpm.
- Efter dette trin vil OD600 af hver kolbe blive kontrolleret hver 20 min.
- Når den optiske tæthed når ca. 0,8, reduceres temperaturen til 16 °c, og peptidekspression fremkommer ved tilsætning af 750 μl 1 M sterilfiltreret β-isopropyl thiogalactoside (iptg) i ultrarent vand i hver udtryks kolbe.
- Med de inducerede bakterier ved 16 °C i 16 timer Inkuber man udtryks kolben med 250 rpm.
- Dag 3: ekstraktion af det udtrykte polypeptid
- Centrifugerings kolben forvejes, så celle pellet massen kan fastslås efter høst.
- Alle bakterier fra udtryks kolberne høstes ved centrifugering i 20 min. ved hjælp af en forkølet centrifuge ved 4.000 x g og 4 °c.
- Hæld supernatanten ud, og blottet centrifuge flaskerne på et sterilt papirhåndklæde.
- Centrifugerings kolberne vejes, og celle pellet massen beregnes.
- Cellerne resuspenderes, som er pelleteret ned fra 750 mL original cellekultur, i 15 mL fosfat-bufferet saltvand (PBS, pH 7,4) ved pipettering, og centrifugeres ved 4.000 x g i 20 minutter ved 4 °c. Hæld supernatanten ud, og blottet centrifuge flaskerne på et sterilt papirhåndklæde.
- Celle pellet opslæmmes i 2 mL buffer pr. 1 gram celle pellet med PBS (pH 7,4) suppleret med lysozym (1 mg/mL), 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM benzamidin og 0,5 U af DNase I.
- Soniker cellerne for yderligere lysis på is med en sonicator ved 8 W i 9 min med skiftevis 10 s sonikering og 20 s pause trin, efterfulgt af en 9 minutters pause, hvor prøven skal afkøles på is. Gentag 9 min sonikering trin endnu en gang.
- Tilsæt 2 mL 10% (w/v) polyethyleneimin (PEI) pr. 1 L original cellekultur for nukleinsyre nedbør.
- Prøven fordeles til 2 mL centrifugeglas og inkuberes ved 60 °C i 10 minutter efterfulgt af en inkubation i 10 minutter ved 4 °C.
- Opløsningen centrifugeres ved 16.000 x g i 10 minutter ved 4 °c, og den supernatanten, der indeholder ELP, opsamles.
- Protein rensning via inverse temperatur cykling:
- Supernatanten justeres til en pH-værdi på 2 for at skifte den hydrofile del af peptid til hydrofobe og inducere aggregering. For at justere pH-værdien anvendes phosphorsyre og natriumhydroxid. pH-striber er tilstrækkelige til at bestemme pH-niveauet.
- For at forbedre udbyttet af rensningen af prøven opvarmes prøven til 60 °C og tilsættes natriumchlorid op til 2 M.
- Derefter centrifugeres prøven ved 16.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Kassér supernatanten og genopløs pellet i PBS (men kun halvdelen af den oprindelige volumen bruges sammenlignet med det foregående trin).
- PH-værdien justeres til 7 med phosphorsyre og natriumhydroxid. pH-striber er tilstrækkeligt nøjagtige til at bestemme pH.
- Prøven centrifugeres efterfølgende ved 16.000 x g i 10 minutter ved 4 °c.
- Saml supernatanten og Gentag trin 1.4.1-1.4.6 op til 3x total, bortset fra at i den sidste gentagelse af trin 1.4.4 tilsættes kun vand i stedet for PBS.
- Mål koncentrationen af peptiderne med et absorptions spektrometer. Brug en ekstinktionskoefficient på 5500/M/cm ved 280 Nm.
- Juster koncentrationen af ELP til 700 μM.
2. vesikel produktion ved hjælp af glasperler metode
- ELP-Opløsningen koncentreres til 1,1 mM ved hjælp af en centrifugal vakuum koncentrator.
- Bland 200 μL af den koncentrerede ELP-opløsning med 1.250 μL af en 2:1 chloroform/methanol-blanding efterfulgt af vortexing.
- Der tilsættes 1,5 g sfæriske glasperler (212 – 300 μm i størrelse) til en 10 mL rund bund kolbe.
- Tilsæt den opløsning, der indeholder ELP, og chloroform/methanol-blandingen til den runde bund kolbe, og bland den med blid omrystning.
- kolben til en rotationsfordamper. Juster hastigheden til 150 rpm og regulere trykket til-0,2 x 105 PA (-200 mbar) i ca 4 min indtil væsken er fordampet ved stuetemperatur.
- Den runde bund kolbe anbringes i en ekssikkator i mindst 1 time for at sikre, at den resterende chloroform og methanol fordampes. For at undgå tab af glasperler, løst vedhæftet aluminiumsfolie bør vikles rundt om den runde bund kolbe åbning.
- For et enkelt eksperiment blandes 100 mg af peptiddækkede glasperler med 60 μL af hævelsen opløsning, såsom PBS. Prøven inkubates ved 25 °C i 5 minutter.
- Centrifuge prøven centrifugeres hurtigt med en bordplade centrifuge for at sedimentér Glasperlerne.
- Brug en pipette til at samle supernatanten, som indeholder vesikler.
3. transkriptionen af RNA Aptamer dBroccoli inde i Vesicles
- Rengør laboratorie bænken med vådservietter, der indeholder RNase-dekontaminerings løsning, for at skabe et RNase-frit arbejdsmiljø.
- Bland ssDNA (5 μM) bestående af T7 promotor-og dBroccoli-sekvensen (GAGACGGTCGGGTCCATCTGAGACGGTCGGGTCCAGATATTCGTATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCAGATGTCGAGTAGAGTGTGGGCTC), og ikke-kodnings streng (5 μM) i nuklease frit vand suppleret med Rnapol reaktionsbuffer [40 mm Tris-HCL (pH = 7,9), 6 mm mgcl2, 1 mm ditiotreitol (DTT) og 2 mm spermidin], for at forberede DNA-skabelonen til transkriptionsreaktionen.
- Opløsningen inkubates ved 90 °C i 5 minutter efterfulgt af en langsom temperatur reduktion til 20 °C i 30 minutter.
- Forbered en 1 mM (5Z)-5-(3, 5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2,3-dimethyl-3, 5-dihydro-4H-imidazol-4-One (DFHBI) opløsning ved at opløse 1,26 mg DFHBI i 5 mL DMSO.
- Transskriptions reaktionen forberedes ved at blande rnapol-reaktionsbuffer [40 mm Tris-HCL (pH = 7,9), 6 mm mgcl2, 1 mm ditiotreitol (DTT) og 2 mm spermidin] med 125 mm KCl, 15 mm mgcl2,4mm rntp, 10 μM dfhbi, 200 Nm DNA-skabelon, 0,5 U/μl RNase hæmmer murine, og vand.
- Lige før reaktionen påbegyndes, tilsættes 4 U/μL T7 polymerase.
- Brug denne reaktionsblanding som opsvulmende opløsning i trin 2,7 og Inkuber ved 37 °C i forsøgsperioden, hvilket typisk er 1 time.
4. transskription-oversættelse (TX-TL) reaktion
Bemærk: For transskription-oversættelse reaktion, en rå celle ekstrakt er påkrævet samt reaktionsbuffer og DNA. Råcelle ekstrakten fremstilles som beskrevet i Sun et al.18. For en TX-TL-reaktion skal du bruge følgende: 33% (v/v) af den rå E. coli ekstrakt, 42% (v/v) reaktionsbuffer, og 25% (v/v) phenol-chloroform renset DNA plus tilsætningsstoffer. De endelige koncentrationer er ca. 9 mg/mL protein, 50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM coenzym A, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 68 mM folinsyre, 1 mM spermidin , 30 mm PEP, 1 mm DTT, 2% peg-8000, 13,3 mm maltose, 1 e af T7 RNA polymerase og 50 nm plasmid DNA i ultrarent vand.
-
Phenol-chloroform rensning af DNA-skabelonen
- Forbered seks overnight kulturer med 5 ml lb medium og 5 μl steril-filtreret (0,22 μm filter) carbenicillin opløsning (100 mg/ml i 50% EtOH og 50% ultrarent vand).
- Tilsæt en lille stribe fra en præ-lavet bakteriel bestand indeholdende DH5α E. coli med pET20b (+) ekspressions vektor til hver præ-varmet 5 ml overnight kultur og inkubere ved 37 °c i 16 timer med 250 rpm. Afhængigt af hvilket peptid (EF) eller protein (YPet eller mVenus) der skal udtrykkes, anvendes en specifik kodnings plasmid.
- Pak plasmid ud med et mini-prep-sæt som beskrevet i brugermanualen eller ved at følge protokollen fra Zhang et al.24.
- Forbered 100 μL af det præ-rensede plasmid-DNA (koncentrationen kan variere fra 200 – 600 ng/μL) og blandes med 100 μL Roti-phenol/chloroform/isoamylalkohol (pH = 7,5 – 8,0) i et mikrocentrifuge glas for at muliggøre en bedre faseadskillelse.
- Vend forsigtigt røret op til 6x og centrifuge i 5 min ved 16.000 x g ved rt.
- Tilsæt 200 μL chloroform til den øvre fase af røret og vend røret op til 6x.
- Prøven centrifugeres ved 16.000 x g i 5 minutter ved rt.
- Pipet supernatanten til et separat rør og tilsæt 10 μL 3 M natriumacetat til ethanol nedbør.
- Tilsæt 1 mL-80 °C kold ethanol, og opbevar prøven ved-80 °C i 1 time.
- Prøven centrifugeres ved 16.000 x g i 15 minutter ved 4 °c.
- Supernatanten og tilsæt 1 mL-20 °C kold 70% (v/v) ethanol.
- Centrifugeres ved 16.000 x g i 5 minutter ved 4 °c.
- Fjern væsken ved pipettering. Vær omhyggelig med ikke at forstyrre DNA-pellet.
- Prøven opbevares ved RT i ca. 15 minutter for at fordampe den resterende ethanol.
- Tilsæt ultrarent vand til prøven for at justere prøve koncentrationen til ca. 300 Nm, hvilket måles ved absorption ved 260 nm.
-
Klargøring af TX-TL-reaktionen
- Tø det tilberedte rå celle ekstrakt og reaktions bufferen på is.
- For en 60 μL reaktionsblanding tilsættes plasmid-DNA (phenol-chloroform renset) til 37,5 μL af reaktions bufferen [50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM coenzym A, 0,33 mM NAD , 0,75 mM cAMP, 68 mM folinsyre, 1 mM spermidin, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000 og 13,3 mM maltose), efterfulgt af tilsætning af 28,7 μL rå celle ekstrakt. Fyld til en endelig volumen med ultrarent vand til 58,8 μl.
- Lige før reaktionen starter, tilsættes 1,2 μL af T7 RNA-polymeraseopløsningen, og prøven blandes ved pipettering op og ned.
- Brug denne reaktionsblanding som en opsvulmende opløsning i trin 2,7 og Inkuber ved 29 °C i forsøgsperioden, hvilket typisk er 4 – 8 timer.
5. konjugering af elastin-lignende polypeptider med Fluorophorer via kobberkatalyseret Azid-alkyne Huisgen Cycloaddition
- Forbered en 20 mM NHS-Azid-linker (γ-azidosmørric syre N-hydroxysuccinimide ester) opløsning i DMSO.
- Bland 250 μL af ELP-opløsningen (600 μM) med PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L na2HPO4, 0,27 g/l K2HPO4, pH = 7,2) og NHS-Azid (1,2 mm) og Inkubér i 12 timer ved rt.
- Prøven indlà ¦ ses i en 10 kDa-dialyse kassette, og den opbevares ved 4 °c i 12 timer i 1 liter ultrarent vand for at fjerne salte og resterende NHS-Azid.
- Den aktiverede ELP (500 μM) blandes med alkyne-konjugeret farvestof (500 μM), Cy5-alkyne eller Cy3-alkyne.
- Bland denne prøve med 1 mM TBTA (tris (benzyltriazolylmethyl) Amin), 10 mM TCEP (tris (2-carboxyethyl)-phosphinhydrochlorid) og 10 mM CuSO4 og Inkuber ved 4 °c i 12 timer.
- Prøven belastes i en 10 kDa-dialyse kassette, og den opbevares ved 4 °C i 12 timer i 1 liter ultrarent vand for at fjerne salte og resterende alkyne konjugerede farvestoffer.
- Disse farve modificerede Elp'er anvendes i en 1:1-blanding af Cy3 mærket ELPs og Cy5 mærket ELPs analogt med peptiderne i anden del.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vesikel produktion
Figur 1 viser transmission Electron mikroskopi (tem) billeder af vesikler tilberedt med forskellige opsvulmende opløsninger og glasperler metode (Se også vogele et al.11). For prøven i figur 1ablev kun PBS anvendt som opsvulmende opløsning til at bevise dannelsen af vesikler og til at bestemme deres størrelse. Når TX-TL blev anvendt som opsvulmende opløsning (figur 1b), dannede vesikler også. Der blev udført målinger af dynamisk lysspredning (DLS) for at vise, at glasperler metoden har en effekt på vesikel dannelse. Figur 2 viser den målte intensitet autokorrelations kurve for en EF-prøve, som er fremstillet uden glasperler i PBS (blå), og en EF-prøve, som er fremstillet med glasperler-metoden med PBS som opsvulmende opløsning (rød). Størrelserne blev beregnet ud fra en cumulant fit25 og resulterede i en diameter på 134 nm med en polydispersitet på 25%, når vesikler blev forberedt uden glasperler metode. Da Glasperlerne blev brugt, resulterede cumulant-pasformen i en diameter på 168 nm med en polydispersitet på 21%.
I vesiculo transkription 11
Figur 3 viser profilen for fluorescens intensitet over tid for transkriptionen af dbroccoli-aptamer inde i EF-vesikler (grøn). Som en negativ kontrol blev DNase I føjet til opsvulmende opløsning og dermed også indarbejdet under vesikel dannelse (blå). Målingerne blev udført i fluorescens plade læser med excitation ved 480 nm og emission ved 520 nm.
I vesiculo protein udtryk 11
Figur 4 viser fluorescens intensiteten af to fluorescerende proteiner, som blev udtrykt i ELP-vesikler ved hjælp af en fluorescens plade læser. Excitation blev udført 500 nm og emission ved 520 nm. Transskription-oversættelse af mVenus (figur 4a) blev udført for at undersøge ekspressions dynamik og ekspressionsniveau af proteiner i ELP vesikle. Det er vigtigt at bemærke, at efter vesikel dannelse er indholdet af vesikler og ydre opløsning de samme. Derfor, at undertrykke protein ekspression uden for vesicle, antibiotika kanamycin blev føjet til den udvendige opløsning. Som en kontrol, kanamycin blev også føjet til hævelsen løsning, i hvilket tilfælde protein ekspression inde i vesikelprotein blev undertrykt. Dette indikerer yderligere, at det lille molekyle kanamycin forbliver inde i vesikle og antyder, at membranen ikke er gennemtrængelig for dette molekyle over tids skalaen af disse eksperimenter. Hvis kanamycin spredes gennem membranen, ville mVenus ekspression ikke være blevet undertrykt og ved 5 timer ville fluorescensen være højere. I det andet eksperiment blev udtrykket YPet (figur 4b) gennemført. Begge proteiner blev valgt, fordi de udviser en hurtigere modningstid end for eksempel GFP. Desuden blev T7 Promoter brugt til mVenus transskription og en konstitutiv promotor, der blev brugt til YPet transkriptionen for at vise, at både inducerbare og kontinuerlige udtryk er mulige.
Fret analyse 11
Figur 5a viser resultaterne af den GENNEMførte fret-analyse for at påvise, at ELP inkorporeres i membranen. Derfor blev vesikler fremstillet ved hjælp af en blanding af to lige koncentrerede fluorophore-peptidkonstruktioner. Disse var Cy3-EF (donor) og Cy5-EF (acceptor). På tidspunktet t = 0 blev start-FRET-niveauet målt. Signalerne fra donor og FRET signal afhænger af middelværdien mellem farvestofferne i membranen. Ved ekspression af membranen ELPs indarbejde yderligere peptider i membranen, hvilket øger den gennemsnitlige afstand mellem FRET par. Sidstnævnte blev målt gennem stigningen i donor fluorescens og et fald i FRET signalet på tidspunktet t = 2,5 h. figur 5b viser den negative kontrol. Her, kanamycin blev føjet til hævelsen opløsning før vesikel dannelse. Kanamycin undertrykker protein ekspression; Derfor var ingen ændring i FRET synlig. Det er vigtigt at bemærke, at denne analyse kun viser EF-inkorporering.
Figur 1: Repræsentative tem-billeder. A) EF-vesikler dannet i opsvulmende opløsning PBS. B) EF-vesikler, som dannes i opsvulmende opløsning TX-TL. Skala stænger = 200 Nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative DLS-data. Intensitet autokorrelations kurver målt ved DLS. Den blå kurve viser EF-peptider i PBS fremstillet uden glasperler metode. Den røde kurve skildrer en EF-opløsning fremstillet med glasperler metode og PBS som hævelse løsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Dbroccoli transskription. Repræsentative data for transkriptionen af dBroccoli aptamer inde i EF-vesikler. Den grønne kurve skildrer fluorescens signalet og den blå kurve kontrol målingen med indkapslet DNase I. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: protein udtryk inde i peptidvesikler. A) en plasmid-kodning af MVENUS og TX-TL-udtryks blandingen var indkapslet i ELP-vesikler. Efter ca. 5 timer er fluorescensen mættet. Da den antibiotika-kanamycin også var indkapslet, sås ingen fluorescens. B) der blev opnået lignende resultater ved indkapsling af et ypet-plasmid. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen for de målte værdier på det angivne tidspunkt i en tidsramme på 15 min. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: fret-analyse. A) start af fluorescens niveauer på tidspunktet t = 0 for donor emission og fret signal (acceptor emission). Ved t = 2,5 h viste donor øget emission, og FRET-signalet faldt. B) Hvis der kun blev udtrykt HYDROFILE ELP i vesikler, forblev fret-signalet og donor emissionen konstant. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen for de målte værdier på det angivne tidspunkt i en tidsramme på 15 min. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil: Indeholder alle plasmid-sekvenser resp. gensekvenser. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Film rehydrering er en fælles procedure for oprettelse af små af vesikler. Den vigtigste kilde til fiasko er den forkerte håndtering af de materialer, der anvendes i proceduren.
I første omgang ELPs produceres af E. coli celler. Udbyttet efter ELP rensning kan variere betydeligt afhængigt af, hvor omhyggeligt protokollen er gennemført i løbet af sine afgørende skridt. Disse er den inverse temperatur cykling (ITC) trin og opblanding af ELPs efter nedbør. Til rensning, vi udløste hydrofobe kollaps af peptid gennem tilsætning af fosforsyre, som ændrer pH til sure og fører til protonation af glutaminsyre sidekæder i hydrofile blok. Efter dette trin, begge blokke er hydrofobe på RT. Det er at foretrække at bruge en syre, hvis salt er allerede i opløsningen til at holde den ioniske styrke konstant, men andre syrer såsom saltsyre kan anvendes, samt. For at øge udbyttet af ELP produktion, yderligere salte kan tilsættes for at forbedre den coacervering proces, fordi salt nedsætter overgangen temperatur tt og gør ELP mere hydrofobe. Normalt anvendes natriumchlorid, men kosmotropic salte såsom natriumsulfat er langt bedre, mens saltkoncentrationen kan være tæt på sin opløsning grænse. Yderligere opvarmning ved hjælp af et vandbad kan øge udbyttet endnu mere.
Et andet kritisk skridt er genopløsningen af ELP pellet. For at opnå maksimal Opløselighed i ELP skal opløsningen forkøles, og en hurtig pH-justering kan hjælpe med at opløse pellet hurtigere. Det kan være nødvendigt at justere pH-værdien i løbet af denne proces flere gange. Til yderligere forbedring kan prøven opbevares i køleskab ved 4 °C, og omrystning af prøven bør undgås. For at udveksle salte bør det beskrevne dialyse trin i slutningen af rensnings protokollen foretrækkes. I princippet kan ITC bruges til at adskille peptiderne fra den salt-holdige supernatant. Men afhængigt af den tidligere saltkoncentration, kan rest salt stadig findes i denne pellet. Desuden kan dialyse bruges til at koncentrere de peptider, der er nødvendige for forsøgene uden tab som nævnt før.
Det næste afgørende skridt er fordampning af chloroform/methanol blanding. Ved fordampning ved reduceret tryk kan en forsinkelse i kogning forårsage splattere eller turbulenser, hvilket kan resultere i store tab af glasperler. Dette kan forhindres ved hjælp af enten filtre eller væv. Det samme problem opstår, når ekssikkator anvendes, men aluminiumsfolie ved åbningen af den runde bund kolbe kan bruges til at forhindre dette. Til håndtering af ELP-belagte glasperler anbefales det at bruge engangs antistatisk mikro-spatel, hvilket også reducerer tab og forenkler proceduren.
Hævelsen af vesikler ved hjælp af forskellige opsvulmende opløsninger såsom PBS og transkriptionsmix er ligetil og mindre fejl tilbøjelige. For TX-TL-systemet kan der dog forekomme variationer fra batch til batch på op til 10%. For at minimere dette problem, bør alle eksperimenter udføres med en batch af celle-fri ekstrakt, som kan bruges til op til 3.000 reaktioner. Efter rehydrering er vesikelprotein-indholdet og den ydre opløsning den opsvulmende opløsning. En rensning af den udvendige opløsning bør ikke udføres, fordi dette kan ændre den osmotiske trykforskel mellem vesikelprotein inde og ude. Resultatet ville være en ukontrolleret størrelse ændring eller endda sprængning af vesikler. Derfor bør mulige reaktioner udefra kun undertrykkes. Afhængigt af reaktionen, kan dette gøres, for eksempel ved tilsætning DNase I at fordøje nuværende DNA eller ved at tilføje antibiotika såsom kanamycin, som hæmmer oversættelsen.
Film rehydrering fra glasperler har flere fordele i forhold til andre tilberedningsmetoder. I modsætning til solvent injektion, emulsion fase overførsel eller microfluidics forskydning af opløsningsmiddel er ikke påkrævet, da den oprindelige opløsningsmiddel er helt fordampet, og peptider er rehydreret i vandig opløsning. Derfor er glasperler metode særligt velegnet til følsomme prøver såsom TX-TL, som kan være betydeligt påvirket eller endda ødelagt af resterende organiske opløsningsmidler, der anvendes i andre metoder. Desuden er protokollen ligetil, mindre fejlbehæftet, og i stand til at være let skaleres op. På grund af den store overflade til volumen forholdet kun små mængder af glasperler er nødvendige og giver en høj grad af parallelisering med høj gennemløb.
Som sin største ulempe, er glasperler metode kun nyttig til dannelse af små af vesikler, som ikke kan observeres via Fluorescens mikroskopi. Den beskrevne metode er noget begrænset, når mikroskopisk observation af dynamikken i enkelte vesikler ønskes, hvilket nogle gange er nødvendigt (f. eks. ved observation af potentielle vesikle divisions processer). Desuden begrænser den lille størrelse af SUVs indkapsling af lav-koncentrerede komponenter såsom peptid-kodning plasmid, hvilket forklarer den relativt lave ekspression af peptider. Den underliggende indkapsling proces er en Poisson proces, og dermed koncentrationen af en bestemt komponent skal være mindst 150 nM for at garantere en indkapsling sandsynlighed på 95%. Derfor er det ganske bemærkelsesværdigt, at det er muligt at observere en så stor stigning i vesikle størrelse i disse eksperimenter.
Den protokol, der præsenteres her, vil gøre det muligt for forskerne at skabe peptidbaserede vesikler fra elastin-lignende polypeptider. Det åbner også muligheder for at producere kunstige celle lignende strukturer indkapslet af peptidmembraner, som repræsenterer attraktive alternativer til klassiske rum fremstillet af fedtsyrer eller phospholipider. Peptider er fordelagtige, fordi de let kan udtrykkes i et celle frit miljø (f. eks. i det TX-TL-system, der anvendes her), som muliggør kobling af membran vækst direkte til en transskription-oversættelsesproces inde i vesikle. Desuden kan Elp'er konstrueres og justeres til specifikke fysisk-kemiske parametre såsom kontur længde, hydrofobiby/hydrophilicity af den anvendte DeBlock og følsomhed over for stimuli såsom pH eller ionstyrke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi anerkender taknemmeligt finansiel støtte gennem DFG TRR 235 (fremkomsten af Life, Project P15), det Europæiske Forskningsråd (tilskudsaftale nr. 694410 AEDNA) og TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (projekt nr. 9,05) . Vi takker E. Falgenhauer for hendes hjælp med prøveforberedelse. Vi takker A. Dupin og M. Schwarz-Schilling for deres hjælp med TX-TL systemet og nyttige diskussioner. Vi takker N. B. Holland for nyttige diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| Chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| Phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
References
- Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
- Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
- Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).
- Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
- Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
- Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
- Chu, H. -S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
- Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
- Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
- Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
