Summary
Здесь представлены протоколы для создания пептидных основе малых unilamellar пузырьков способны к росту. Для облегчения производства везикуло мембранного пептида эти пузырьки оснащены системой транскрипции-перевода и пептидно-кодирующей плазмидой.
Abstract
Соизвобихация биохимических реакций является центральным аспектом синтетических клеток. Для этого реакционные отсеки на основе пептида служат привлекательной альтернативой липосом или пузырькам на основе жирных кислот. Внешне или в пределах пузырьков пептиды могут быть легко выражены и упростить синтез мембранных прекурсоров. Здесь предусмотрен протокол для создания пузырьков диаметром 200 нм на основе амфифильных эластиноподобных полипептидов (ELP), используя обезвоживание-регидратацию из стеклянных бусин. Также представлены протоколы для бактериального выражения И очищения ELP через обратную температуру цикла, а также их ковалентной функционализации с флуоресцентными красителями. Кроме того, в настоящем докладе описывается протокол, позволяющий транскрипции РНК aptamer dBroccoli внутри пузырьков ELP, как менее сложный пример для биохимической реакции. Наконец, предусмотрен протокол, который позволяет в везикуло экспрессии флуоресцентных белков и мембранного пептида, в то время как синтез последнего приводит к росту везикулы.
Introduction
К созданию синтетических живых клеточных систем обычно подходят с двух разных направлений. В методе «сверху вниз» геном бактерии сводится к ее основным компонентам, что в конечном итоге приводит к минимальной клетке. При подходе «снизу вверх» искусственные клетки собираются из молекулярных компонентов или клеточных подсистем, которые должны быть функционально интегрированы в последовательную клеточную систему.
При подходе de novo разобщенное необходимые биохимические компоненты обычно достигается с помощью мембран, изготовленных из фосфолипидов или жирных кислот1,2,3,4. Это потому, что "современные" клеточные мембраны в основном состоят из фосфолипидов, в то время как жирные кислоты считаются правдоподобными кандидатами пребиотических мембранных корпусов5,6. Для образования новых мембран или для облегчения роста мембраны, амфифилические строительные блоки должны быть предоставлены из внешнего7 или в идеале через производство в мембранном отсеке с использованием соответствующих анаболических процессов4 ,8.
В то время как синтез липидов является относительно сложным метаболическим процессом, пептиды могут быть произведены довольно легко с помощью клеточных реакций экспрессии генов9,10. Таким образом, пептидные мембраны, образованные амфифильных пептидов представляют собой интересную альтернативу липидных мембран в качестве корпусов для искусственных клеток мимики, которые способны расти11.
Амфифильные эластиновые диблокитеры (ELPs) являются привлекательным классом пептидов, которые могут служить строительным блоком для таких мембран12. Основной мотив аминокислотной последовательности ELPs является (GaGVP)n, где "а" может быть любой аминокислоты, за исключением пролин и "n" является число мотив повторяет13,14,15,16,17 . ELPs были созданы с гидрофобным блоком, содержащим главным образом фенилаланин для и гидрофильных блоков в основном состоит из глутаминовой кислоты11. В зависимости от параметров раствора, таких как рН и концентрация соли, ELPsдемонстрируют так называемый обратный переход температуры при температуре T t, где пептиды проходят полностью обратимый переход фазы от гидрофильной к гидрофобной Государства. Синтез пептидов может быть легко реализован внутри пузырьков с помощью экстракта бактериальных клеток "TX-TL"11,18,19,20,21, который обеспечивает все необходимые компоненты для сочетания транскрипции и переводческих реакций.
TX-TL система была инкапсулирована вместе, с шаблоном ДНК кодирования ELPs в ELP пузырьков с использованием обезвоживания-регидратации из стеклянных бусин в качестве твердой поддержки. Формирование пузырьков происходит путем регидратации высушенных пептидов с поверхности бисера11. Другие методы22 для образования везикулы могут быть использованы, которые потенциально показывают более низкую polydispersity и более большие размеры везикулы (например, электро-образование, передача участка эмульсии, или microfluidics-основанные методы). Для проверки жизнеспособности метода инкапсуляции, транскрипция флюорогенного aptamer dBroccoli23 может быть использована в качестве альтернативы11, что является менее сложным, чем экспрессия генов с системой TX-TL.
Благодаря экспрессии мембранных строительных блоков в везикуло и их последующему включению в мембрану, пузырьки начинают расти11. Мембрана включения ELPs может быть продемонстрирована с помощью исследования FRET. С этой целью, ELPs, используемые для формирования первоначальной популяции везикл, спрягаются с флуоресцентными красителями в равных долях, составляющих пару FRET. При экспрессии немаркированных ELPs в vesiculo и их вхождение в мембрану, помеченные ЭЛП в мембране разбавляются и, следовательно, сигнал FRET уменьшается11. В качестве универсального и распространенного метода спряжения используется медь катализированный азиде-алкын циклоуг. При использовании стабилизирующего лиганда, такого как трис (бензилтриазолметилметил)-амин, реакция может осуществляться в вавном растворе при физиологическом рН без гидролиза реагентов11, что подходит для спряжений реакций с пептидами.
В следующем протоколе представлено подробное описание подготовки к выращиванию пептидосом на основе ELP. Описано выражение пептидов и образование везикул с использованием метода стеклянных бусин. Кроме того, описано, как реализовать транскрипцию флюорогенного апртами dBroccoli aptamer и транскрипции-перевод реакции для экспрессии белка внутри пузырьков ELP. Наконец, при условии, что это процедура для спряжения ЭЛП с флюорофорами, которые могут быть использованы для доказательства роста везикля через FRET ассссе11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выражение эластиноподобных полипептидов
- День 1: Подготовка стартовой культуры и принадлежностей для экспрессии пептида
- Подготовка и автоклав экспрессии культуры фляги (4 х 2,5 л) и 3 L среды LB. Для 1 L среды LB, добавить 25 г порошка LB 1 л ультрачистой воды.
- Подготовьте стартерную культуру с 100 мл среднего LB, 50 л стерильной фильтрованного (0,22 мкм фильтра) раствора хлорамфеникол (25 мг/мл в EtOH) и 50 л стерильной фильтруе (0,22 мкм фильтра) карбенициллина (100 мг/мл в 50% EtOH и 50% ультрачистых водоотворенных).
- Добавьте небольшую полосу из предсделанного бактериального запаса, содержащего штамм E. coli BL21 (DE3)pLysS с вектором экспрессии pET20b (я), кодируя полипептидную последовательность MGHGVGVP ((GEGVP)4(GVGVP))4((GFGVP) 4 (GFGVP) 4 (GVGVP)3 (GFGVP)4GWP (сокращенно как EF) до предварительно разогретых 100 мл стартовой культуры и инкубировать при 37 кв с для 16 ч с 250 об/мин в дрожащем инкубаторе (E. coli штаммов и векторов доступны по запросу).
- Предварительно разогреть фляги культуры выражения и LB-носители на ночь на 37 градусов по Цельсию, чтобы они были готовы на следующий день.
- День 2: Выражение белка
- Добавьте 750 мл средней для каждой культуры выражения колбу, 375 л стерильной фильтрованного (0,22 мкм фильтра) хлорамфениколного запаса (25 мг/мл в EtOH) и 375 л стерильной фильтрированной (0,22 мкм фильтра) карбенициллина (100 мг/мл в 50% воды).
- После агитации для распространения антибиотиков, принять 2 мл средств массовой информации в качестве эталонного образца для измерения оптической плотности на 600 нм (OD600).
- Добавьте 7,5 мл стартовой культуры в флягу выражения и инкубировать на 1 ч при 37 градусах По цельсии с 250 об/мин.
- После этого шагаOD 600 каждой колбы будут проверяться каждые 20 минут.
- Когда оптическая плотность достигает примерно 0,8 снизить температуру до 16 градусов по Цельсию и вызвать экспрессию пептида, добавив 750 л 1 М стерильной фильтруется й-изопропил тиогалактозид (IPTG) в ультрачистой воде в каждой фляге выражения.
- Инкубировать флягу с индуцированными бактериями при 16 градусах по Цельсию на 16 ч с 250 об/мин.
- День 3: Извлечение выраженного полипептида
- Предварительно взвесить флягу для центрифугирования, чтобы определить массу клеточной гранулы после сбора урожая.
- Урожай все бактерии из экспресс-фляг и центрифугации в течение 20 минут с помощью предварительно охлажденных центрифуги на 4000 х г и 4 кв. C.
- Вылейте супернатант и профолите центрифуги бутылки на стерильное бумажное полотенце.
- Взвесьте фляги центрифугации и вычислите массу клеточных гранул.
- Resuspend клетки, которые pelleted вниз от 750 ml первоначально культуры клетки, в 15 ml фосфат-буферизированного соливого (PBS, pH 7.4) трубацией, и центрифуге на 4,000 x g на 20 min на 4 c. Вылейте супернатант и профолите центрифуги бутылки на стерильное бумажное полотенце.
- Приостановить клеточной гранулы для лизис шаг в 2 мл буфера на 1 грамм клеточной гранулы с использованием PBS (pH 7.4) дополнены лизозим (1 мг/мл), 1 мм фенилметилфонил фтора (PMSF), 1 мМ бензамидина, и 0,5 Ю DNase I.
- Сножайте клетки для дальнейшего лизиса на льду с помощью звукового атлетатора при 8 Вт в течение 9 мин с чередующимися 10 s sonication и 20 s паузы, а затем 9 минут паузы, во время которой образец должен быть охлажден на льду. Повторите 9 мин sonication шаг еще раз.
- Добавьте 2 мл 10% (w/v) полиэтиленеимина (PEI) на 1 л исходной клеточной культуры для осадков нуклеиновой кислоты.
- Распределите образец по 2 мл центрифуговых труб и инкубировать при 60 градусах по Цельсию в течение 10 мин, а затем инкубацию в течение 10 минут при 4 градусах По Цельсию.
- Centrifuge раствор на 16000 х г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия и соберите супернатант, содержащий ELP.
- Очистка белка с помощью обратной температуры цикла:
- Отрегулируйте супернатант до рН 2, чтобы переключить гидрофильные части пептида на гидрофобные и вызвать агрегацию. Для регулировки рН используются фосфорная кислота и гидроксид натрия. полосы pH достаточны для определения уровня рН.
- Для повышения урожайности очистительного образца нагреть образец до 60 градусов по Цельсию и добавить хлорид натрия до 2 М.
- Впоследствии центрифуги образца на 16000 х г в течение 10 минут при комнатной температуре (RT).
- Откажитесь от супернатанта и повторно растворите гранулы в PBS (но только половина первоначального объема используется по сравнению с предыдущим шагом).
- Отрегулируйте рН до 7 с фосфорной кислотой и гидроксидом натрия. полосы рН достаточно точны, чтобы определить рН.
- Centrifuge образец впоследствии на 16000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
- Соберите супернатант и повторите шаги 1.4.1-1.4.6 до 3x всего, за исключением того, что в последнем повторении шага 1.4.4 вместо PBS добавляется только вода.
- Измерьте концентрацию пептидов с помощью спектрометра поглощения. Используйте коэффициент вымирания 5500/M/cm на уровне 280 нм.
- Отрегулируйте концентрацию ЭЛП до 700 мкм.
2. Везикл Производство С использованием стеклянных бусин метод
- Сконцентрируйте раствор ELP до 1,1 мМ с помощью центробежного вакуумного концентратора.
- Смешайте 200 л концентрированного раствора ELP с 1250 л л хлороформом/метаноловой смесью с последующим вихрем.
- Добавьте 1,5 г сферических стеклянных бусин (212–300 мкм в размерах) к круглой нижней колбе размером 10 мл.
- Добавьте раствор, содержащий ELP и смесь хлороформа/метанола, в круглую нижнюю колбу и перемешайте нежной тряской.
- Соедините колбу с роторным испарителем. Отрегулируйте скорость до 150 об/мин и отрегулируйте давление до -0,2 х 105 Па (-200 мбар) в течение примерно 4 минут, пока жидкость не испарится при комнатной температуре.
- Поместите круглую нижнюю колбу в ошикатор, по крайней мере 1 ч, чтобы остальные хлороформы и метанола испаряются. Чтобы избежать потери стеклянных бусин, слабо прикрепленная алюминиевая фольга должна быть обернута вокруг круглого нижнего отверстия колбы.
- Для одного эксперимента смешайте 100 мг пептидных стеклянных бусин с 60 злителю раствора отеков, таких как PBS. Инкубировать этот образец при 25 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
- Centrifuge образец быстро с столешница центрифуга для осадка стеклянные бусы.
- Используйте пипетку для сбора супернатанта, который содержит пузырьки.
3. Транскрипция РНК Aptamer dBroccoli внутри Vesicles
- Очистите лабораторную скамейку салфетками, содержащими решение для обеззараживания RNase, чтобы создать рабочую среду без RNase.
- Смешайте ssDNA (5 мКМ), включающий последовательность T7 promotor и dBroccoli (GAGACGGTCGGGTCCATCTGAGACGGGGGGTCCAGATTCGTGATTCGCTGTTTGAGASGAGGTGGGGGGATGGATTASTAGTGGGGGATTASGATAGTGGGGGGATAGTGGTGG, а также некодирующая прядь (5 мкм) в нуклеайированную воду Рнкпол реакционный буфер (40 мМ Tris-HCl ( pH 7.9), 6 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол (DTT), и 2 мМ спермидин, чтобы подготовить шаблон ДНК для реакции транскрипции.
- Инкубировать раствор при температуре 90 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем медленное снижение температуры до 20 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
- Подготовьте раствор 1 мМ (5)-5-(3,5-дифторо-4-гидроксибензилена)-2,3-диметил-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-один (DFHBI) растворив 1,26 мг DFHBI в 5 мл ДМСО.
- Подготовьте реакцию транскрипции, смешивая буфер реакции РНКПол (40 мМ Tris-HCl (pH 7.9), 6 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол (DTT), и 2 мм спермидин с 125 мМ KCl, 15 мМ MgCl2, 4 мМ rNTP, 10 ММ DFHBI, 200 НМ шаблон ДНК, 0,5 УТ /Л RNase ингибитор мурин, и вода.
- Непосредственно перед началом реакции добавьте 4 U/L Полимеразы T7.
- Используйте эту реакционную смесь в качестве раствора отеков в шаге 2.7 и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение всего эксперимента, который обычно составляет 1 ч.
4. Реакция транскрипции-перевода (TX-TL)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для реакции транскрипции-перевода требуется экстракт сырой клетки, а также буфер реакции и ДНК. Экстракт сырой клетки готовится, как описано в Sun et al.18. Для реакции TX-TL используйте следующее: 33% (v/v) сырого экстракта кишечной палочки, 42% (v/v) буфер реакции и 25% (v/v) фенол-хлороформ очищенной ДНК плюс добавки. Окончательные концентрации составляют примерно 9 мг/мл белка, 50 мМ HEPES (pH 8), 1,5 мм АТФ, 1,5 мм ГТП, 0,9 мм CTP, 0,9 мм UTP, 0,2 мг/мл tRNA, 26 мм кофермента А, 0,33 мм НАД, 0,75 мм ЦАМП, 68 мм фолиновой кислоты, 1 мм , 30 мМ PEP, 1 мМ DTT, 2% PEG-8000, 13,3 мм мальтоза, 1 U T7 РНК полимераза, и 50 нм плазмид ДНК в ультрачистой воде.
-
Фенолхлороформная очистка шаблона ДНК
- Приготовьте шесть ночных культур с 5 мл среднего LB и 5 л стерильной фильтрованного (0,22 мкм фильтра) карбеничиллина (100 мг/мл в 50% EtOH и 50% ультрачистой воды).
- Добавьте небольшую полосу из готовых бактериальных запасов, содержащих DH5 'E. coli с вектором экспрессии pET20b (я) к каждой предварительно разогретой культуре 5 мл на ночь и инкубировать при 37 кВ для 16 ч с 250 об/мин. В зависимости от того, какой пептид (EF) или белок (YPet или mVenus) должен быть выражен, используется специфическая космида кодирования.
- Извлеките плазмид с мини-подготовительным комплектом как описано в руководстве потребителя или путем следовать протоколу обеспеченному Чжан и др.24.
- Подготовьте 100 кЛ предварительно очищенной плазмидной ДНК (концентрация может варьироваться от 200-600 нг/Л) и смешайте с 100 л л роти-фенола/хлороформа/изоамила (рН 7,5-8.0) в микроцентрифуговой трубке, чтобы обеспечить лучшую фазу разделения.
- Аккуратно инвертировать трубку до 6x и центрифуги в течение 5 минут при 16000 х г на RT.
- Добавьте 200 л хлороформа в верхнюю часть трубки и инвертировать трубку до 6x.
- Центрифуги образца на 16000 х г в течение 5 мин на RT.
- Пипот супернатант в отдельную трубку и добавить 10 зл 3 М ацетата натрия для осадков этанола.
- Добавьте 1 мл -80 градусов по Цельсию холодный этанол и храните образец при -80 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
- Центрифуги образца при 16000 х г в течение 15 мин при 4 градусах По Цельсию.
- Декант супернатант и добавить 1 мл -20 градусов по Цельсию холодный 70% (v/v) этанол.
- Центрифуга при 16 000 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
- Удалите жидкость путем пипетки. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить ДНК гранулы.
- Храните образец на RT в течение примерно 15 минут, чтобы испарить оставшийся этанол.
- Добавьте ультрачистую воду в образец, чтобы отрегулировать концентрацию образца примерно до 300 нм, которая измеряется поглощением на уровне 260 нм.
-
Подготовка реакции TX-TL
- Оттепель подготовленный экстракт сырой клетки и буфер реакции на льду.
- Для рекшера реакции 60 л, добавить плазмид ДНК (фенол-хлороформ очищенный) до 37,5 л реакционного буфера 50 мМ HEPES (pH No 8), 1,5 мм ММ АТП, 1,5 мм ГТП, 0,9 мМ CTP, 0,9 мМ UTP, 0,2 мг/мл tRNA, 26 мм. , 0,75 мМ CAMP, 68 мм фолиновой кислоты, 1 мм спермидин, 30 мм ПЭП, 1 мМ DTT, 2% PEG-8000, и 13,3 мм мальтоза), а затем добавление 28,7 мл экстракта сырой клетки. Заполните до окончательного тома с ультрачистой водой до 58,8 л.
- Непосредственно перед началом реакции добавьте 1,2 л раствора полимеразы T7 РНК и смешайте образец, прокладывая вверх и вниз.
- Используйте эту реакционную смесь в качестве раствора отеков в шаге 2.7 и инкубируйте при 29 градусах Цельсия в течение всего эксперимента, который обычно составляет 4–8 ч.
5. Спряжение эластиноподобных полипептидов с флюорофорами через Медный катализдированный Азиде-алкинь Юисген Циклоуг
- Подготовьте в DMSO раствор 20 мМ NHS-azide linker (з-азидобутириновая кислота N-гидроксисуччинимидэ эстер).
- Смешайте 250 л раствора ELP (600 мкм) с PBS (8 г/л NaCl, 0,2 г/l KCl, 1,42 г/L Na2HPO4, 0,27 г/л K2HPO4, pH 7.2) и NHS-azide (1,2 мм) и incubate для 12 ч.
- Загрузите образец в 10 kDa диализной кассеты и хранить его на 4 кк с 12 ч в 1 л ультрачистой воды, чтобы удалить соли и остаточный NHS-azide.
- Смешайте активированный ELP (500 мкм) с алкином-конъюгированным красителем (500 мкм), Cy5-alkyne, или Cy3-alkyne.
- Смешайте этот образец с 1 мМ TBTA (трис (бензилтриазолметилметил) амин), 10 мМ TCEP (трис (2-карбоксетил)-фосфин гидрохлорид) и 10 мМ CuSO4 и инкубировать при 4 КС на 12 ч.
- Загрузите образец в кассету диализа 10 kDa и храните его при 4 градусах по Цельсию на 12 ч в 1 л ультрачистой воды, чтобы удалить соли и остаточные алкиненовые конъюгированные красители.
- Эти одиозные ELPs, модифицированные в красителях, используются в смеси 1:1 с маркировкой Cy3 и с маркировкой Cy5, аналогичной пептидам во второй части.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Везикл производства
На рисунке 1 показаны изображения электрон-микроскопии передачи (TEM), подготовленные с различными растворами отеков и методом стеклянных бусин (также см. Vogele et al.11). Для выборки на рисунке 1A, только PBS был использован в качестве отечного раствора, чтобы доказать образование пузырьков и определить их размер. Когда TX-TL был использован в качестве отеков решение(Рисунок 1B), пузырьки также формируется. Измерения динамического рассеяния света (DLS) были проведены, чтобы показать, что метод стеклянных бусин оказывает влияние на образование везикулы. На рисунке 2 изображены измеренные кривые автокорреляции интенсивности образца EF, подготовленного без стеклянных бусин в PBS (синий) и образец EF, подготовленный методом из стекла с ПОМОЩЬю PBS в качестве отечного раствора (красный). Размеры были рассчитаны из кумулятивных подходят25 и в результате диаметром 134 нм с полидисперсностью 25%, когда пузырьки были подготовлены без стеклянного бисера метода. Когда стеклянные бусы были использованы, кумулятивный подходят в диаметре 168 нм с полидисперсностью 21%.
В транскрипции vesiculo 11 Год
На рисунке 3 показан профиль интенсивности флуоресценции с течением времени для транскрипции dBroccoli aptamer внутри пузырьков EF (зеленый). В качестве отрицательного контроля, DNase I был добавлен в опухоль раствор и, таким образом, также включены во время образования везикул (синий). Измерения проводились в флуоресценционном считывателе с возбуждением на уровне 480 нм и выбросом на уровне 520 нм.
В экспрессии белка везикуло 11 Год
На рисунке 4 показана интенсивность флуоресценции двух флуоресцентных белков, которые были выражены внутри пузырьков ELP с помощью считывателя флуоресценции. Возбуждение было выполнено 500 нм и выбросы на 520 нм. Транскрипция-перевод mVenus(Рисунок 4A) была выполнена для исследования динамики экспрессии и уровня экспрессии белков в ELP везикуле. Важно отметить, что после образования везикулы, содержание пузырьков и внешнего раствора одинаковы. Таким образом, для подавления экспрессии белка за пределами везикулы, антибиотик канамицин был добавлен к внешнему раствору. В качестве контроля, канамицин был также добавлен в опухоль раствор, и в этом случае выражение белка внутри везикулы был подавлен. Это также указывает на то, что небольшая молекула канамицина остается внутри везикулы и предполагает, что мембрана не проницаемая для этой молекулы во время этих экспериментов. Если бы канамицин рассеялся через мембрану, выражение mVenus не было бы подавлено и на 5 ч, флуоресценция была бы выше. Во втором эксперименте было выполнено выражение YPet(рисунок 4B). Оба белка были выбраны потому, что они демонстрируют более быстрое время созревания, чем, например, GFP. Кроме того, промоутер T7 был использован для транскрипции mVenus и составной промоутер, используемый для транскрипции YPet, чтобы показать, что возможны как индуцируемое, так и непрерывное выражение.
ФРЕТ-асссе 11 Год
На рисунке 5A показаны результаты исследования FRET, проведенного для демонстрации включения ELP в мембрану. Поэтому пузырьки производились с использованием смеси двух одинаково концентрированных фторрофорно-пептидных конструкций. Это были Cy3-EF (донор) и Cy5-EF (приемщик). В момент t й 0, начальный уровень FRET был измерен. Сигналы донора и сигнал FRET зависят от среднего расстояния между красителями в мембране. При экспрессии мембранных ELPs в мембрану включат дополнительные пептиды, что увеличивает среднее расстояние между парами ФРЕТ. Последний был измерен за счет увеличения донорской флуоресценции и уменьшения сигнала FRET во время т 2,5 ч. Рисунок 5B показывает отрицательный контроль. Здесь, канамицин был добавлен в опухоль раствор перед образованием везикулы. Канамицин подавляет экспрессию белка; поэтому никаких изменений в ФРЕТ не было видно. Важно отметить, что этот ассс показывает только включение EF.
Рисунок 1: Представитель TEM изображения. (A) EF пузырьки формируется в отек раствор PBS. (B) EF пузырьки, образуемые в растворе отеков TX-TL. Шкала баров 200 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представительные данные DLS. Кривые аутокорреляции интенсивности, измеренные DLS. Синяя кривая изображает пептиды EF в PBS, приготовленные без метода стеклянных бусинок. Красная кривая изображает раствор EF, произведенный методом стеклянных бусин, и PBS в качестве раствора отеков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: транскрипция dBroccoli. Репрезентативные данные транскрипции dBroccoli aptamer внутри EF пузырьков. Зеленая кривая изображает сигнал флуоресценции и синюю кривую измерения управления с инкапсулированным DNase I. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Выражение белка внутри пептидных пузырьков. (A) Плазмид кодирования mVenus и TX-TL выражение смесь были инкапсулированы в пузырьках ELP. Примерно через 5 ч флуоресценция насыщается. Когда антибиотик канамицин был инкапсулирован, а также, не флуоресценция наблюдается. (B) Аналогичные результаты были получены после инкапсуляции плазмида YPet. Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение измеренных значений в указанное время в течение 15 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: ФРЕТ-асссе. (A) Запуск уровней флуоресценции в то время т 0 для донорских выбросов и сигнала FRET (приемная эмиссия). При t 2.5 ч донор показал увеличение выбросов, и сигнал FRET уменьшился. (B) Когда только гидрофильные ELP были выражены внутри пузырьков, сигнал FRET и выбросы доноров оставались постоянными. Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение измеренных значений в указанное время в течение 15 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл: Содержит все плазмидные последовательности resp. последовательности генов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Регидратация пленки является общей процедурой для создания небольших униламеллярных пузырьков. Основным источником отказа является неправильное обращение с материалами, используемыми в процедуре.
Первоначально ЭЛП производятся клетками кишечной палочки. Урожайность после очистки ELP может значительно варьироваться в зависимости от того, насколько тщательно протокол проводится во время его решающих шагов. Это обратный шаг цикла температуры (ITC) и возобновление ELPs после выпадения осадков. Для очистки мы вызвали гидрофобный коллапс пептида путем добавления фосфорной кислоты, которая изменяет рН на кислую и приводит к протонации сторонных цепочек глутаминовой кислоты в гидрофильных блоках. После этого шага оба блока гидрофобны на RT. Предпочтительно использовать кислоту, соль которой уже находится в растворе, чтобы сохранить ионную прочность постоянной, но и другие кислоты, такие как соляная кислота, могут быть использованы, а также. Для увеличения урожайности производства ELP, дополнительные соли могут быть добавлены для повышения процесса коасервизации, потому что соль снижает температуру перехода Tt и делает ELP более гидрофобным. Обычно хлорид натрия используется, но космотропные соли, такие как сульфат натрия гораздо лучше, в то время как концентрация соли может быть близка к пределу ее раствора. Дополнительное отопление с помощью водяной ванны может увеличить урожайность еще больше.
Другим важным шагом является переизмотка гранул ELP. Для максимальной растворимости ELP растворительность, растворитель растворить, решение должно быть предварительно охлаждено, и быстрая регулировка рН может помочь растворить гранулы быстрее. PH, возможно, потребуется скорректировать в ходе этого процесса несколько раз. Для дальнейшего совершенствования, образец может храниться в холодильнике при 4 градусах Цельсия и встряхивания образца следует избегать. Для обмена солями следует предпочесть описанный шаг диализа в конце протокола очистки. В принципе, ЦМТ можно использовать для отделения пептидов от соляносодержащего супернатанта. Но в зависимости от предыдущей концентрации соли, остаточная соль все еще может быть найдена в этом гранулы. Кроме того, диализ может быть использован для концентрации пептидов, необходимых для экспериментов без потерь, как упоминалось ранее.
Следующим важным шагом является испарение хлороформной/метаноловой смеси. Во время испарения при пониженном давлении задержка кипения может вызвать брызги или турбулентности, что может привести к большой потере стеклянных бусинок. Это можно предотвратить с помощью фильтров или тканей. Та же проблема возникает, когда используется обезвляженый, но алюминиевая фольга при открытии круглой нижней колбы может быть использована для предотвращения этого. Для обработки стеклянных бусин ОКП с покрытием рекомендуется использовать одноразовый антистатический микро-шпатель, который также уменьшает потери и упрощает процедуру.
Отек пузырьков с использованием различных решений отеков, таких как PBS и транскрипции смесь проста и менее подвержены ошибкам. Однако для системы TX-TL могут возникать вариации от партии к партии до 10%. Чтобы свести к минимуму эту проблему, все эксперименты должны быть выполнены с одной партии безклеточного экстракта, который может быть использован для до 3000 реакций. После регидратации, содержание везикулы и внешний раствор являются отек решение. Очистка внешнего раствора не должна выполняться, так как это может изменить разницу в осмотическом давлении между везикулой внутри и снаружи. Результатом будет неконтролируемое изменение размера или даже разрыв пузырьков. Поэтому возможные реакции снаружи должны быть только подавлены. В зависимости от реакции, это может быть сделано, например, путем добавления DNase I переварить настоящее ДНК или путем добавления антибиотиков, таких как канамицин, который подавляет перевод.
Регидратация пленки из стеклянных бусин имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами приготовления. В отличие от инъекций растворителя, передача эмульсии или смещение микрофлюиды растворителя не требуется, так как первоначальный растворитель полностью испаряется, а пептиды регидратируются в вавочный раствор. Таким образом, метод стеклянных бусин особенно подходит для чувствительных образцов, таких как TX-TL, которые могут быть значительно затронуты или даже уничтожены остаточными органическими растворителями, используемыми в других методах. Кроме того, протокол прост, менее подвержен ошибкам и может быть легко масштабирован. Из-за большого соотношения поверхности и объема требуется лишь небольшое количество стеклянных бусинок, что позволяет обеспечить высокую степень параллелизации с высокой пропускной стоимостью.
В качестве основного недостатка метод стеклянных бусин пригодится только для создания небольших униламеллярных пузырьков, которые не могут наблюдаться с помощью флуоресцентной микроскопии. Описанный метод несколько ограничен, когда требуется микроскопическое наблюдение за динамикой одиночных пузырьков, что иногда необходимо (например, при наблюдении за потенциальными процессами деления везиклов). Кроме того, небольшой размер внедорожников ограничивает инкапсуляцию низкоконцентрированных компонентов, таких как пептид-кодирующая плазмида, что объясняет относительно низкое выражение пептидов. Основной процесс инкапсуляции является процесс Омассон, и, таким образом, концентрация какого-либо конкретного компонента должна быть не менее 150 нМ, чтобы гарантировать вероятность инкапсуляции 95%. Поэтому весьма примечательно, что в этих экспериментах можно наблюдать такое значительное увеличение размеров везикулы.
Представленный здесь протокол позволит исследователям создавать пептидные пузырьки из эластиноподобных полипептидов. Он также открывает возможности для производства искусственных клеточных структур, инкапсулированных пептидными мембранами, которые представляют собой привлекательную альтернативу классическим отсекам, изготовленным из жирных кислот или фосфолипидов. Пептиды являются выгодными в том, что они могут быть легко выражены в среде, свободной от клеток (например, в системе TX-TL используется здесь), что позволяет присоединение роста мембраны непосредственно транскрипции-перевода процесса внутри везикулы. Кроме того, ЭЛП могут быть разработаны и адаптированы к конкретным физико-химическим параметрам, таким как длина контура, гидрофобность/гидрофиливность используемого деблока и чувствительность к раздражителям, таким как рН или ионная прочность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.
Acknowledgments
Мы с благодарностью отмечаем финансовую поддержку через DFG TRR 235 (Появление жизни, проект P15), Европейский исследовательский совет (грантовое соглашение No 694410 AEDNA) и Международную высшую школу науки и инженерии TUM (проект No 9.05) . Мы благодарим Э. Фальгенгауэр за помощь в подготовке образцов. Мы благодарим А. Дупина и М. Шварца-Шиллинга за помощь в системе TX-TL и полезные дискуссии. Мы благодарим Н.Б. Холланда за полезные дискуссии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| Chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| Phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
References
- Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
- Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
- Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).
- Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
- Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
- Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
- Chu, H. -S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
- Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
- Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
- Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
