Dans Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Summary

Présentés ici sont des protocoles pour la création de petits vésicules unilamellar à base de peptides capables de croître. Pour faciliter la production de vesiculo du peptide membranaire, ces vésicules sont équipées d'un système de transcription-traduction et du plasmide codant peptide.

Abstract

La compartimentation des réactions biochimiques est un aspect central des cellules synthétiques. À cette fin, les compartiments de réaction à base de peptides constituent une alternative attrayante aux liposomes ou aux vésicules à base d'acides gras. Extérieurement ou à l'intérieur des vésicules, les peptides peuvent être facilement exprimés et simplifier la synthèse des précurseurs de la membrane. Fourni ici est un protocole pour la création de vésicules avec des diamètres de 200 nm à base de l'élastine amphiphile-comme polypeptides (ELP) en utilisant la déshydratation-réhydratation à partir de perles de verre. Sont également présentés des protocoles pour l'expression et la purification bactériennes du PEL par le biais du cycle de température inverse, ainsi que leur fonctionnalisation covalente avec des colorants fluorescents. En outre, ce rapport décrit un protocole pour permettre la transcription du dbroccoli dBroccoli d'aptamer d'ARN à l'intérieur des vésicules d'ELP comme exemple moins complexe pour une réaction biochimique. Enfin, un protocole est fourni, qui permet dans l'expression vesiculo des protéines fluorescentes et le peptide de membrane, tandis que la synthèse de ce dernier entraîne la croissance vésiculeuse.

Introduction

La création de systèmes cellulaires vivants synthétiques est généralement approchée à partir de deux directions différentes. Dans la méthode descendante, le génome d'une bactérie est réduit à ses composants essentiels, conduisant finalement à une cellule minimale. Dans l'approche ascendante, les cellules artificielles sont assemblées de novo à partir de composants moléculaires ou de sous-systèmes cellulaires, qui doivent être intégrés fonctionnellement dans un système cellulaire cohérent.

Dans l'approche de novo, la compartimentation des composants biochimiques nécessaires est généralement réalisée à l'aide de membranes faites de phospholip....

Protocol

1. Expression de polypeptides de l'élastine

1. Jour 1: Préparation d'une culture de démarrage et fournitures pour l'expression peptide
   1. Préparer et autoclaveexpression des flacons de culture d'expression (4 x 2,5 L) et 3 L de milieu LB. Pour 1 L de lb moyen, ajouter 25 g de poudre LB à 1 L d'eau ultrapure.
   2. Préparer une culture de démarrage avec 100 ml de milieu LB, 50 l de solution de chloramphenicol filtrée stérile (0,22 m) (25 mg/mL en EtOH) et 50 l de solution de carbenicilline filtrée stérile (0,22 m) (100 mg/mL dans 50 % et 50 % d'eau ultrapure).
   3. Ajouter une petite strie à partir d'un stock bactérien préfabri....

Results

Production de vésicules
La figure 1 montre des images de microscopie électronique de transmission (TEM) de vésicules préparées avec différentes solutions de gonflement et la méthode des perles de verre (voir aussi Vogele et al.11 ). Pour l'échantillon de la figure 1A, seul le PBS a été utilisé comme solution d'enflure pour prouver la formation de vésicules et déterminer leur taille. Lorsque TX-TL a été utilisé comme so.......

Discussion

La réhydratation du film est une procédure courante pour la création de petites vésicules unilamellar. La principale source de défaillance est la mauvaise manipulation des matériaux utilisés dans la procédure.

Initialement, les PEL sont produits par des cellules E. coli. Le rendement après la purification du PEL peut varier considérablement en fonction de la prudence avec soin du protocole au cours de ses étapes cruci.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2xYT	MP biomedicals	3012-032
3-PGA	Sigma-Aldrich	P8877
5PRIME Phase Lock GelTM tube	VWR	733-2478
alkiné Cy3	Sigma-Aldrich	777331
alkine-conjugué Cy5	Sigma-Aldrich	777358
ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Benzamidine	Carl Roth	CN38.2
BL21 Rosetta 2 E. coli souche	Novagen	71402
Bradford BSA Protein Assay Kit	Bio-rad	500-0201
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501
Carbenicilline	Carl Roth	6344.2
Chloramphénicol	Sigma-Aldrich	C1919
Chloramphénicol	Carl Roth	3886.3
Chloroforme	Carl Roth	4432.1
CoA	Sigma-Aldrich	C4282
CTP	USB	14121
CuSO4	Carl Roth	P024.1
DFHBI	Lucerna Technologies	410
DMSO	Carl Roth	A994.1
DNase I	NEB	M0303S
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Éthanol	Carl Roth	9065.2
Acide folinique	Sigma-Aldrich	F7878
Perles de verre, lavées à l’acide	Sigma-Aldrich	G1277
GTP	USB	16800
HEPES	Sigma-Aldrich	H6147
IPTG (&beta ;-isopropyl thiogalactoside )	Sigma-Aldrich	I6758
KCl	Carl Roth	P017.1
K-glutamate	Sigma-Aldrich	G1149
LB Bouillon	Carl Roth	X968.2
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
Méthanol	Carl Roth	82.2
MgCl2	Carl Roth	KK36.3
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605
Colonnes de chromatographie Micro Bio-Spin	Bio-Rad	732-6204
NAD	Sigma-Aldrich	N6522
NHS-azide linker (ester d’oxysuccinimide d’acide y-azidobutyrique)	Baseclick	BCL-033-5
PEG-8000	Carl Roth	263.2
Bandes de pH	Carl Roth	549.2
Fluorure de phénylméthylsulfonyle	Carl Roth	6367.2
Solution saline tamponnée au phosphate	VWR	76180-684
Acide	phosphoriqueSigma-Aldrich	W290017
Polyéthylèneimine	Sigma-Aldrich	408727
Phosphate de potassium dibasique	solution Sigma-Aldrich	P8584
Phosphate de potassium monobasique	Sigma-Aldrich	P8709
Qiagen Miniprep Kit	Qiagen	27106
Tampon de réaction RNAPol	NEB	B9012
Inhibiteur de la RNase murine	NEB	M0314S
Lingettes RNaseZap	ThermoFisher	AM9788
rNTP	NEB	N0466S
Roti-Phenol/Chloroforme/Alcool isoamylique	Carlroth	A156.1
RTS Échantillonneur d’acides aminés	5 Cassettes de
Slide-A-Lyzer, 10k MWCO (Kit)	Thermo-Scientific	66382
Chlorure de sodium	Carl Roth	9265.1
Hydroxyde de sodium	Carl Roth	8655.1
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558
Filtré stérilement (0.22 µ ; Filtre m)	Carl Roth	XH76.1
T7 polymérase	NEB	M0251S
TBTA (tris(benzyltriazolylméthyl)amine)	Sigma-Aldrich	678937
TCEP (chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)-phospine)	Sigma-Aldrich	C4706
Tris base	Fischer	BP1521
ARNt (issu d’E. coli)	Roche Applied Science	MRE600
UTP	USB	23160