Summary
Présentés ici sont des protocoles pour la création de petits vésicules unilamellar à base de peptides capables de croître. Pour faciliter la production de vesiculo du peptide membranaire, ces vésicules sont équipées d'un système de transcription-traduction et du plasmide codant peptide.
Abstract
La compartimentation des réactions biochimiques est un aspect central des cellules synthétiques. À cette fin, les compartiments de réaction à base de peptides constituent une alternative attrayante aux liposomes ou aux vésicules à base d'acides gras. Extérieurement ou à l'intérieur des vésicules, les peptides peuvent être facilement exprimés et simplifier la synthèse des précurseurs de la membrane. Fourni ici est un protocole pour la création de vésicules avec des diamètres de 200 nm à base de l'élastine amphiphile-comme polypeptides (ELP) en utilisant la déshydratation-réhydratation à partir de perles de verre. Sont également présentés des protocoles pour l'expression et la purification bactériennes du PEL par le biais du cycle de température inverse, ainsi que leur fonctionnalisation covalente avec des colorants fluorescents. En outre, ce rapport décrit un protocole pour permettre la transcription du dbroccoli dBroccoli d'aptamer d'ARN à l'intérieur des vésicules d'ELP comme exemple moins complexe pour une réaction biochimique. Enfin, un protocole est fourni, qui permet dans l'expression vesiculo des protéines fluorescentes et le peptide de membrane, tandis que la synthèse de ce dernier entraîne la croissance vésiculeuse.
Introduction
La création de systèmes cellulaires vivants synthétiques est généralement approchée à partir de deux directions différentes. Dans la méthode descendante, le génome d'une bactérie est réduit à ses composants essentiels, conduisant finalement à une cellule minimale. Dans l'approche ascendante, les cellules artificielles sont assemblées de novo à partir de composants moléculaires ou de sous-systèmes cellulaires, qui doivent être intégrés fonctionnellement dans un système cellulaire cohérent.
Dans l'approche de novo, la compartimentation des composants biochimiques nécessaires est généralement réalisée à l'aide de membranes faites de phospholipides ou d'acides gras1,2,3,4. C'est parce que les membranes cellulaires "modernes" se composent principalement de phospholipides, tandis que les acides gras sont considérés comme des candidats plausibles des enceintes de membrane prébiotique5,6. Pour la formation de nouvelles membranes ou pour faciliter la croissance des membranes, les blocs de construction amphiphiles doivent être fournis à partir de l'extérieur7 ou idéalement par la production dans un compartiment membranaire en utilisant les processus anabolisants correspondants4 ,8.
Tandis que la synthèse de lipide est un processus métabolique relativement complexe, les peptides peuvent être produits tout à fait facilement utilisant des réactions d'expression de gène cell-libres9,10. Par conséquent, les membranes peptidiques formées par les peptides amphiphiles représentent une alternative intéressante aux membranes lipidiques comme enclos pour les imitations de cellules artificielles qui sont capables de se développer11.
Les copolymères de di-bloc d'élastine amphiphiles (PEL) sont une classe attrayante de peptides, qui peuvent servir de bloc de construction pour de telles membranes12. Le motif de base de séquence d'acide aminé des PEL est (GaGVP)n, où "a" peut être n'importe quel acide aminé excepté la proline et « n » est le nombre de répétitions de motif13,14,15,16,17 . Les PEL ont été créés avec un bloc hydrophobe contenant principalement de la phénylalanine pour un bloc hydrophile et principalement composé d'acide glutamique11. Selon les paramètres d'une solution, tels que le pH et la concentration de sel, les PEL présentent une transition de température dite inverse à la température Tt, où les peptides subissent une transition de phase entièrement réversible d'un hydrophile à l'hydrophobe état. La synthèse des peptides peut être facilement mis en œuvre à l'intérieur des vésicules à l'aide de l'extrait de cellules bactériennes "TX-TL"11,18,19,20,21, qui fournit tous les composants nécessaires pour les réactions couplées de transcription et de traduction.
Le système TX-TL a été encapsulé ensemble, avec le modèle d'ADN codant les PEL en vésicules ELP en utilisant la déshydratation-réhydratation des perles de verre comme un soutien solide. La formation de vésicules se produit par la réhydratation des peptides séchés de la surface de perle11. D'autres méthodes22 pour la formation de vésicules peuvent être utilisées, qui peuvent potentiellement montrer une polydispersity plus faible et de plus grandes tailles de vésicule (par exemple, électro-formation, transfert de phase d'émulsion, ou méthodes microfluidiques). Pour tester la viabilité de la méthode d'encapsulation, la transcription de l'aptamer fluorogénique dBroccoli23 peut alternativement être utilisée11, ce qui est moins complexe que l'expression génique avec le système TX-TL.
En raison de l'expression des blocs de construction de membrane dans vesiculo et de leur incorporation ultérieure dans la membrane, les vésicules commencent à se développer11. L'incorporation de membrane des PEL peut être démontrée par un analyse FRET. À cette fin, les PEL utilisés pour la formation de la population initiale de vésicules sont conjugués avec des colorants fluorescents en parts égales constituant une paire FRET. Lors de l'expression des PEL non étiquetés en vesiculo et de leur incorporation dans la membrane, les PEL étiquetés dans la membrane sont dilués et, par conséquent, le signal FRET diminuede 11. Comme méthode polyvalente et commune pour la conjugaison, le cuivre catalysé azide-alkyne cycloaddition est utilisé. Avec l'utilisation d'un ligand stabilisateur tel que tris (benzyltriazolylmethyl)-amine, la réaction peut être effectuée dans une solution aqueuse à un pH physiologique sans l'hydrolyse des réactifs11, ce qui est approprié pour les réactions de conjugaison peptides.
Le protocole suivant présente une description détaillée de la préparation pour la croissance des peptidosomes à base de PEL. L'expression des peptides et de la formation de vésicule utilisant la méthode de perles de verre sont décrites. En outre, il est décrit comment mettre en œuvre la transcription de l'aptamer fluorogénique dBroccoli et la réaction de transcription-traduction pour l'expression de protéine à l'intérieur des vésicules d'ELP. Enfin, à condition est une procédure pour la conjugaison des PEL avec des fluorophores, qui peut être utilisé pour prouver la croissance de la vésicule par un test FRET11.
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Protocol
1. Expression de polypeptides de l'élastine
- Jour 1: Préparation d'une culture de démarrage et fournitures pour l'expression peptide
- Préparer et autoclaveexpression des flacons de culture d'expression (4 x 2,5 L) et 3 L de milieu LB. Pour 1 L de lb moyen, ajouter 25 g de poudre LB à 1 L d'eau ultrapure.
- Préparer une culture de démarrage avec 100 ml de milieu LB, 50 l de solution de chloramphenicol filtrée stérile (0,22 m) (25 mg/mL en EtOH) et 50 l de solution de carbenicilline filtrée stérile (0,22 m) (100 mg/mL dans 50 % et 50 % d'eau ultrapure).
- Ajouter une petite strie à partir d'un stock bactérien préfabriqué contenant la souche E. coli BL21(DE3)pLysS avec le vecteur d'expression pET20b (MD) codant la séquence de polypeptide MGHGVGVP((GEGVP)4(GVGVP))4((GFGVP)4(GVGVP))3 (GFGVP)4GWP (abrégé en EF) à une culture de démarrage pré-chauffée de 100 ml et incuber à 37 oC pendant 16 h avec 250 tr/min dans un incubateur secouant (les souches et vecteursE. coli sont disponibles sur demande).
- Préchauffez les flacons de culture d'expression et les supports LB à 37 oC pendant la nuit afin qu'ils soient préparés pour le lendemain.
- Jour 2 : Expression protéinée
- Ajouter 750 ml de lb-moyen à chaque flacon de culture d'expression, 375 l de bouillon de chloramphenicol filtré stérile (0,22 m) (25 mg/mL dans EtOH), et 375 l de stock de carbenicilline filtré e (0,22 m) (100 mg/mL dans 50 % et 50 % d'eau ultrapure).
- Après l'agitation pour distribuer les antibiotiques, prendre 2 mL du support comme échantillon de référence pour la mesure de densité optique à 600 nm (OD600).
- Ajouter 7,5 ml de la culture de départ à la flacon d'expression et incuber pendant 1 h à 37 oC avec 250 tr/min.
- Après cette étape, l'OD600 de chaque flacon sera vérifié toutes les 20 min.
- Lorsque la densité optique atteint environ 0,8 réduire la température à 16 oC et induire l'expression peptide en ajoutant 750 L de 1 M stérile-filtré - isopropyl thiogalactoside (IPTG) dans l'eau ultrapure dans chaque flacon d'expression.
- Incuber le flacon d'expression avec les bactéries induites à 16 oC pendant 16 h avec 250 tr/min.
- Jour 3 : Extraction du polypeptide exprimé
- Pré-peser le flacon de centrifugation pour permettre la détermination de la masse de la granule cellulaire après la récolte.
- Récoltez toutes les bactéries des flacons d'expression par centrifugation pendant 20 min à l'aide d'une centrifugeuse pré-réfrigérée à 4 000 x g et 4 oC.
- Verser le supernatant et éponger les bouteilles de centrifugeuse sur un essuie-tout stérile.
- Peser les flacons de centrifugation et calculer la masse de granules cellulaires.
- Resuspendre les cellules, qui sont granulées à partir de 750 ml de culture cellulaire d'origine, dans 15 ml de saline tamponnée de phosphate (PBS, pH 7,4) par pipetting, et centrifugeuse à 4 000 x g pendant 20 min à 4 oC. Verser le supernatant et éponger les bouteilles de centrifugeuse sur un essuie-tout stérile.
- Resuspendre la pastille cellulaire pour l'étape de lyse dans 2 ml de tampon par 1 gramme de granule cellulaire à l'aide de PBS (pH 7,4) complété avec du lysozyme (1 mg/mL), 1 mM de phénylmethylsulfonyle fluorure (PMSF), 1 mM de benzamidine, et 0,5 U de DNase I.
- Sonicate les cellules pour une lyse supplémentaire sur la glace avec un sonicator à 8 W pour 9 min avec une alternance de 10 s sonication et 20 étapes de pause, suivie d'une pause de 9 minutes au cours de laquelle l'échantillon doit être refroidi sur la glace. Répétez l'étape de sonication de 9 min une fois de plus.
- Ajouter 2 ml de 10 % (w/v) de polyéthylèneimine (PEI) par 1 L de culture cellulaire originale pour les précipitations d'acide nucléique.
- Distribuer l'échantillon dans des tubes centrifugeuses de 2 ml et couver à 60 oC pendant 10 min, puis une incubation de 10 min à 4 oC.
- Centrifuger la solution à 16 000 x g pendant 10 min à 4 oC et recueillir le supernatant contenant le PEL.
- Purification des protéines par cycle de température inverse :
- Ajustez le supernatant à un pH de 2 pour passer la partie hydrophile du peptide à l'agrégation hydrophobe et induire. Pour ajuster le pH, l'acide phosphorique et l'hydroxyde de sodium sont utilisés. Les rayures de pH sont suffisantes pour déterminer le niveau de pH.
- Pour améliorer le rendement de la purification de l'échantillon, chauffer l'échantillon à 60 oC et ajouter du chlorure de sodium jusqu'à 2 M.
- Par la suite, centrifuger l'échantillon à 16 000 x g pendant 10 min à température ambiante (RT).
- Jetez le supernatant et re-dissoudre le granule dans PBS (mais seulement la moitié du volume initial est utilisé par rapport à l'étape précédente).
- Ajuster le pH à 7 avec de l'acide phosphorique et de l'hydroxyde de sodium. Les rayures de pH sont suffisamment précises pour déterminer le pH.
- Centrifuger l'échantillon par la suite à 16 000 x g pendant 10 min à 4 oC.
- Recueillir le supernatant et répéter les étapes 1.4.1 -1.4.6 jusqu'à 3x total, sauf que dans la dernière répétition de l'étape 1.4.4, seule l'eau est ajoutée au lieu de PBS.
- Mesurer la concentration des peptides à l'eau à l'eau avec un spectromètre d'absorption. Utilisez un coefficient d'extinction de 5500/M/cm à 280 nm.
- Ajuster la concentration du PEL à 700 M.
2. Production de vésicule utilisant la méthode des perles de verre
- Concentrez la solution ELP à 1,1 mM à l'aide d'un concentrateur à vide centrifuge.
- Mélanger 200 l de la solution D'ELP concentrée avec 1 250 l d'un mélange chloroforme/méthanol de 2:1 suivi d'un vortex.
- Ajouter 1,5 g de perles de verre sphériques (212 à 300 m) sur un flacon rond de 10 ml.
- Ajouter la solution contenant le PEL et le mélange chloroforme/méthanol au flacon de fond rond et mélanger par une secousse douce.
- Connectez le flacon à un évaporateur rotatif. Ajuster la vitesse à 150 tr/min et réguler la pression à -0,2 x 105 Pa (-200 mbar) pendant environ 4 min jusqu'à ce que le liquide soit évaporé à température ambiante.
- Placer le flacon de fond rond dans un dessiccateur pendant au moins 1 h pour s'assurer que le chloroforme et le méthanol restants sont évaporés. Pour éviter la perte des perles de verre, le papier d'aluminium lâchement attaché devrait être enroulé autour de l'ouverture ronde de flacon de fond.
- Pour une seule expérience, mélanger 100 mg de perles de verre recouvertes de peptide avec 60 L de la solution de gonflement, comme le PBS. Incuber cet échantillon à 25 oC pendant 5 min.
- Centrifugez l'échantillon rapidement à l'eau avec une centrifugeuse de table pour sédimenter les perles de verre.
- Utilisez une pipette pour recueillir le supernatant qui contient les vésicules.
3. Transcription de l'ARN Aptamer dBroccoli à l'intérieur des vésicules
- Nettoyez le banc de laboratoire avec des lingettes contenant une solution de décontamination RNase pour créer un environnement de travail sans RNase.
- Mélanger l'ADNs (5 M) comprenant la séquence promotrice et dBroccoli T7 (GAGACGGTCGGCCATCTGAGACGGTCGGGTCACGATATTCGTTTGTTGTTGTCGTCGAGTAGGTGTGTGCTCAGATGTCGAGGagTAGTAGGTGTGTGTGGGCTC Tampon de réaction RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT), et 2 mM spermidine], pour préparer le modèle d'ADN pour la réaction de transcription.
- Incuber la solution à 90 oC pendant 5 min, suivie d'une baisse lente de la température à 20 oC pendant 30 min.
- Préparer une solution de 1 mM (5Z)-5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2,3-dimethyl-3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one (DFHBI) en dissolvant 1,26 mg de DFHBI en 5 mL de DMSO.
- Préparer la réaction de transcription en mélangeant le tampon de réaction RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (TNT), et 2 mM spermidine] avec 125 mM KCl, 15 mM MgCl2, 4 mM rNTP, 10 M DFHBI, 200 nM DNA template, 0.5 U/L RNase murine inhibiteur, et l'eau.
- Juste avant le début de la réaction, ajouter 4 polymérases T7 U/L T7.
- Utilisez ce mélange de réaction comme solution de gonflement à l'étape 2.7 et incubez à 37 oC pendant la durée de l'expérience, qui est généralement de 1 h.
4. Transcription-traduction (TX-TL) Réaction
REMARQUE: Pour la réaction de transcription-traduction, un extrait brut de cellules est exigé aussi bien que le tampon de réaction et l'ADN. L'extrait de cellules brutes est préparé comme décrit dans Sun et al.18. Pour une réaction TX-TL, utilisez ce qui suit : 33 % (v/v) de l'extrait brut d'E. coli, 42 % (v/v) tampon de réaction et 25 % (v/v) adn purifié phénol-chloroforme plus additifs. Les concentrations finales sont d'environ 9 mg/mL de protéines, 50 mM HEPES (pH 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM coenzyme A, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 68 mM d'acide folinique, 1 mM sM , 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2 % PEG-8000, 13,3 mM maltose, 1 U de T7 RNA polymérase, et 50 nM d'ADN plasmide dans l'eau ultrapure.
-
Purification phénol-chloroforme du modèle d'ADN
- Préparer six cultures de nuit avec 5 ml de lb moyen et 5 l de solution de carbenicilline filtrée stérile (0,22 m) (100 mg/mL dans 50 % d'EtOH et 50 % d'eau ultrapure).
- Ajoutez une petite strie à partir d'un stock bactérien préfabriqué contenant du DH5 E. coli avec le vecteur d'expression pET20b(MD) à chaque culture de nuit préréchauffée de 5 ml et incubez à 37 oC pendant 16 h avec 250 tr/min. Selon le peptide (EF) ou la protéine (YPet ou mVenus) qui doit être exprimé, un plasmide d'encodage spécifique est utilisé.
- Extraire le plasmide avec un kit de mini-préparation tel que décrit dans le manuel de l'utilisateur ou en suivant le protocole fourni par Zhang et al.24.
- Préparer 100 L de l'ADN plasmide prépurifié (la concentration peut varier de 200 à 600 ng/L) et mélanger avec 100 OL de Roti-phenol/chloroform/isoamyl alcohol (pH - 7,5 à 8,0) dans un tube microcentrifugeur pour permettre une meilleure séparation de phase.
- Inverser délicatement le tube jusqu'à 6x et la centrifugeuse pendant 5 min à 16 000 x g à RT.
- Ajouter 200 l de chloroforme à la phase supérieure du tube et inverser le tube jusqu'à 6x.
- Centrifugelifuger l'échantillon à 16 000 x g pendant 5 min à RT.
- Pipet le supernatant à un tube séparé et ajouter 10 L de 3 M d'acétate de sodium pour les précipitations d'éthanol.
- Ajouter 1 ml d'éthanol froid de -80 oC et conserver l'échantillon à -80 oC pendant 1 h.
- Centrifuger l'échantillon à 16 000 x g pendant 15 min à 4 oC.
- Décant le supernatant et ajouter 1 ml d'éthanol froid de -20 oC 70 % (v/v).
- Centrifugeuse à 16 000 x g pendant 5 min à 4 oC.
- Retirer le liquide par pipetage. Veillez à ne pas déranger la pastille d'ADN.
- Conservez l'échantillon à RT pendant environ 15 minutes pour évaporer le reste de l'éthanol.
- Ajouter de l'eau ultrapure à l'échantillon pour ajuster la concentration de l'échantillon à environ 300 nM, qui est mesurée par absorption à 260 nm.
-
Préparation de la réaction TX-TL
- Décongeler l'extrait de cellules brutes préparé et le tampon de réaction sur la glace.
- Pour un mélange de réaction de 60 l, ajouter l'ADN plasmide (phénol-chloroforme purifié) à 37,5 l du tampon de réaction [50 mM HEPES (pH 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM coenzyme A, 0,33 mM NAD , 0,75 mM de cAMP, 68 mM d'acide folinique, 1 mm de spermidine, 30 mM de PEP, 1 mM de TNT, 2 % de PEG-8000 et 13,3 mM de maltose), suivi de l'ajout de 28,7 l d'extrait de cellules brutes. Remplir à un volume final avec de l'eau ultrapure à 58,8 L.
- Juste avant le début de la réaction, ajouter 1,2 l de la solution de polymérase à ARN T7 et mélanger l'échantillon en tirant de haut en bas.
- Utilisez ce mélange de réaction comme solution de gonflement à l'étape 2.7 et incubez à 29 oC pendant toute la durée de l'expérience, qui est généralement de 4 à 8 h.
5. Conjugaison de polypeptides de forme d'élastine avec des fluorophores via Copper Catalyzed Azide-alkyne Huisgen Cycloaddition
- Préparer une solution de 20 mM nhs-azide linker (azidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester) dans DMSO.
- Mélanger 250 oL de la solution ELP (600 M) avec PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L Na2HPO4, 0,27 g/LK 2HPO4, pH -7,2) et NHS-azide (1,2 mM) et incuber pendant 12 h à RT.
- Chargez l'échantillon dans une cassette de dialyse de 10 kDa et conservez-le à 4 oC pendant 12 h dans 1 L d'eau ultrapure pour enlever les sels et les résidus de NHS-azide.
- Mélanger le PEL activé (500 M) avec le colorant conjugué à l'alkyne (500 M), le Cy5-alkyne ou le Cy3-alkyne.
- Mélanger cet échantillon avec 1 mM TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine), 10 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochlorure) et 10 mM CuSO4 et incuber à 4 oC pendant 12 h.
- Chargez l'échantillon dans une cassette de dialyse de 10 kDa et conservez-le à 4 oC pendant 12 h dans 1 L d'eau ultrapure, pour enlever les sels et les colorants résiduels conjugués à l'alkyne.
- Ces PEL modifiés par colorant sont utilisés dans un mélange 1:1 des PEL étiquetés Cy3 et des PEL étiquetés Cy5 analogues aux peptides dans la deuxième partie.
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Representative Results
Production de vésicules
La figure 1 montre des images de microscopie électronique de transmission (TEM) de vésicules préparées avec différentes solutions de gonflement et la méthode des perles de verre (voir aussi Vogele et al.11 ). Pour l'échantillon de la figure 1A, seul le PBS a été utilisé comme solution d'enflure pour prouver la formation de vésicules et déterminer leur taille. Lorsque TX-TL a été utilisé comme solution de gonflement (Figure 1B), les vésicules se sont également formées. Des mesures de diffusion dynamique de la lumière (DLS) ont été effectuées pour montrer que la méthode des perles de verre a un effet sur la formation de la vésicule. La figure 2 représente les courbes d'autocorrélation d'intensité mesurée d'un échantillon EF préparé sans perles de verre en PBS (bleu) et un échantillon EF préparé avec la méthode des perles de verre avec PBS comme solution de gonflement (rouge). Les tailles ont été calculées à partir d'un ajustement cumulatif25 et a abouti à un diamètre de 134 nm avec une polydispersity de 25% lorsque les vésicules ont été préparés sans la méthode des perles de verre. Lorsque les perles de verre ont été utilisées, l'ajustement cumulant a eu comme conséquence un diamètre de 168 nm avec une polydispersity de 21%.
Dans la transcription vesiculo 11 Ans, états-unis (
La figure 3 montre le profil d'intensité de la fluorescence au fil du temps pour la transcription de l'aptamer dBroccoli à l'intérieur des vésicules EF (vert). Comme un contrôle négatif, DNase I a été ajouté à la solution de gonflement et donc également incorporé lors de la formation de vésicule (bleu). Les mesures ont été effectuées dans le lecteur de plaque de fluorescence avec excitation à 480 nm et émission à 520 nm.
Dans l'expression des protéines vesiculo 11 Ans, états-unis (
La figure 4 montre l'intensité de fluorescence de deux protéines fluorescentes qui ont été exprimées à l'intérieur des vésicules du PEL à l'aide d'un lecteur de plaque de fluorescence. Excitation a été réalisée 500 nm et l'émission à 520 nm. Transcription-traduction de mVenus (Figure 4A) a été effectuée pour étudier la dynamique d'expression et le niveau d'expression des protéines dans la vésicule D'ELP. Il est important de noter qu'après la formation des vésicules, le contenu des vésicules et de la solution extérieure est le même. Par conséquent, pour supprimer l'expression des protéines en dehors de la vésicule, la kanamycine antibiotique a été ajouté à la solution extérieure. Comme contrôle, la kanamycine a également été ajoutée à la solution de gonflement, auquel cas l'expression de protéine à l'intérieur du vésicule a été supprimée. Cela indique en outre que la petite molécule kanamycine reste à l'intérieur de la vésicule et suggère que la membrane n'est pas perméable pour cette molécule sur l'échelle de temps de ces expériences. Si la kanamycine diffusait à travers la membrane, l'expression mVenus n'aurait pas été supprimée et à 5 h, la fluorescence serait plus élevée. Dans la deuxième expérience, l'expression de YPet (Figure 4B) a été réalisée. Les deux protéines ont été choisies parce qu'elles présentent un temps de maturation plus rapide que, par exemple, Le GFP. En outre, le promoteur T7 a été utilisé pour la transcription mVenus et un promoteur constitutif utilisé pour la transcription YPet pour montrer que l'expression inductible et continue sont possibles.
L'exemple de FRET 11 Ans, états-unis (
La figure 5A montre les résultats de l'analyse FRET effectuée pour démontrer l'incorporation du PEL dans la membrane. Par conséquent, les vésicules ont été produites à l'aide d'un mélange de deux constructions de fluorophore-peptide également concentrées. Il s'agissait de Cy3-EF (donateur) et Cy5-EF (accepteur). Au moment où t -0, le niveau de DÉPART du FRET a été mesuré. Les signaux du donneur et du signal FRET dépendent de la distance moyenne entre les colorants de la membrane. Lors de l'expression des PEL membranaires, des peptides supplémentaires s'incorporent à la membrane, ce qui augmente la distance moyenne entre les paires fret. Ce dernier a été mesuré par l'augmentation de la fluorescence des donneurs et une diminution du signal FRET à l'époque t - 2,5 h. La figure 5B montre le contrôle négatif. Ici, la kanamycine a été ajoutée à la solution de gonflement avant la formation de vésicule. Kanamycin supprime l'expression des protéines; par conséquent, aucun changement dans FRET n'était visible. Il est important de noter que cet avertissement ne montre que l'incorporation EF.
Figure 1 : Images REPRÉSENTATIVEs tem. (A) Vésicules EF formées dans la solution de gonflement PBS. (B) Vésicules EF formées dans la solution de gonflement TX-TL. Barres d'échelle de 200 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Données DLS représentatives. Courbes d'autocorrélation d'intensité mesurées par DLS. La courbe bleue représente des peptides EF en PBS préparés sans la méthode des perles de verre. La courbe rouge représente une solution EF produite avec la méthode des perles de verre et PBS comme solution de gonflement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : transcription dBroccoli. Données représentatives de la transcription de l'aptamer dBroccoli à l'intérieur des vésicules EF. La courbe verte représente le signal de fluorescence et la courbe bleue de la mesure de contrôle avec DNase encapsulé I. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Expression protéique à l'intérieur des vésicules peptidiques. (A) Un plasmide codant mVenus et le mélange d'expression TX-TL ont été encapsulés dans les vésicules du PEL. Après environ 5 h, la fluorescence saturée. Quand la kanamycine antibiotique a été encapsulée aussi bien, aucune fluorescence n'a été observée. (B) Des résultats similaires ont été obtenus lors de l'encapsulation d'un plasmide YPet. Les barres d'erreur représentent l'écart standard des valeurs mesurées à l'heure indiquée au cours d'une période de 15 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : L'asseth. (A) Niveaux de fluorescence de départ à l'heure t - 0 pour l'émission des donneurs et le signal FRET (émission d'accepteur). À 2,5 h, le donateur a montré une augmentation des émissions, et le signal FRET a diminué. (B) Lorsque seul le PEL hydrophile s'est exprimé à l'intérieur des vésicules, le signal FRET et l'émission des donateurs sont restés constants. Les barres d'erreur représentent l'écart standard des valeurs mesurées à l'heure indiquée au cours d'une période de 15 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Fichier supplémentaire: Contient toutes les séquences de plasmides resp. séquences génétiques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La réhydratation du film est une procédure courante pour la création de petites vésicules unilamellar. La principale source de défaillance est la mauvaise manipulation des matériaux utilisés dans la procédure.
Initialement, les PEL sont produits par des cellules E. coli. Le rendement après la purification du PEL peut varier considérablement en fonction de la prudence avec soin du protocole au cours de ses étapes cruciales. Il s'agit de l'étape inverse du cycle à température (ITC) et de la suspension des PEL après les précipitations. Pour la purification, nous avons déclenché l'effondrement hydrophobe du peptide par l'ajout d'acide phosphorique, qui change le pH à l'acide et conduit à la protonation des chaînes latérales d'acide glutamique dans le bloc hydrophile. Après cette étape, les deux blocs sont hydrophobes à RT. Il est préférable d'utiliser un acide dont le sel est déjà dans la solution pour garder la force ionique constante, mais d'autres acides tels que l'acide chlorhydrique peuvent être utilisés, ainsi. Pour augmenter le rendement de la production de PEL, des sels supplémentaires peuvent être ajoutés pour améliorer le processus de coacérvation, car le sel diminue la température de transition Tt et rend le PEL plus hydrophobe. Habituellement, le chlorure de sodium est utilisé, mais les sels kosmotropes tels que le sulfate de sodium sont beaucoup mieux, tandis que la concentration de sel peut être proche de sa limite de solution. Un chauffage supplémentaire à l'aide d'un bain d'eau peut augmenter le rendement encore plus loin.
Une autre étape critique est la redissolution du peleux PEL. Pour une solubilité maximale du PEL, la solution doit être pré-refroidie, et un réglage rapide du pH peut aider à dissoudre le granule plus rapidement. Le pH peut avoir besoin d'être réajusté au cours de ce processus à plusieurs reprises. Pour une amélioration supplémentaire, l'échantillon peut être conservé dans le réfrigérateur à 4 oC et il faut éviter les secousses de l'échantillon. Pour échanger des sels, l'étape de dialyse décrite à la fin du protocole de purification devrait être préférée. En principe, l'ITC peut être utilisé pour séparer les peptides du supernatant contenant du sel. Mais selon la concentration précédente de sel, le sel résiduel peut encore être trouvé dans cette pastille. En outre, la dialyse peut être utilisée pour concentrer les peptides nécessaires pour les expériences sans pertes comme mentionné précédemment.
La prochaine étape cruciale est l'évaporation du mélange chloroforme/méthanol. Pendant l'évaporation à des pressions réduites, un retard dans l'ébullition peut causer des éclaboussures ou des turbulences, ce qui peut entraîner une perte importante de perles de verre. Cela peut être évité à l'aide de filtres ou de tissus. Le même problème se pose lorsque le dessiccateur est utilisé, mais du papier d'aluminium à l'ouverture du flacon de fond rond peut être utilisé pour empêcher cela. Pour la manipulation des perles de verre enduites d'ELP, il est recommandé d'utiliser la micro-spatule antistatique jetable, qui réduit également les pertes et simplifie la procédure.
L'enflure des vésicules à l'aide de diverses solutions de gonflement telles que PBS et mélange de transcription est simple et moins sujette à l'erreur. Toutefois, pour le système TX-TL, des variations allant d'un lot à l'autre peuvent se produire. Pour minimiser ce problème, toutes les expériences doivent être effectuées avec un seul lot d'extrait sans cellules, qui peut être utilisé pour jusqu'à 3.000 réactions. Après la réhydratation, la teneur en vésicule et la solution externe sont la solution de gonflement. Une purification de la solution extérieure ne doit pas être effectuée, car cela peut changer la différence de pression osmotique entre la vésicule à l'intérieur et à l'extérieur. Il en résulterait un changement de taille incontrôlé ou même une explosion des vésicules. Par conséquent, les réactions possibles à l'extérieur ne devraient être supprimées. Selon la réaction, cela peut être fait, par exemple, par l'ajout DNase I de digérer l'ADN actuel ou en ajoutant des antibiotiques tels que la kanamycine, qui inhibe la traduction.
La réhydratation du film à partir de perles de verre présente plusieurs avantages par rapport à d'autres méthodes de préparation. Contrairement à l'injection de solvant, le transfert de phase d'émulsion ou le déplacement microfluidique du solvant n'est pas nécessaire, puisque le solvant initial est complètement évaporé, et les peptides sont réhydratés dans la solution aqueuse. Par conséquent, la méthode des perles de verre convient particulièrement aux échantillons sensibles tels que le TX-TL, qui peut être considérablement affecté ou même détruit par des solvants organiques résiduels utilisés dans d'autres méthodes. En outre, le protocole est simple, moins sujet aux erreurs, et capable d'être facilement mis à l'échelle. En raison du rapport surface/volume élevé, seules de petites quantités de perles de verre sont nécessaires et permettent un degré élevé de parallélisme avec un débit élevé.
Comme principal inconvénient, la méthode des perles de verre n'est utile que pour la création de petites vésicules unilamellaires, qui ne peuvent pas être observées par microscopie à fluorescence. La méthode décrite est quelque peu limitée lorsque l'observation microscopique de la dynamique des vésicules simples est souhaitée, ce qui est parfois nécessaire (p. ex., lors de l'observation des processus potentiels de division des vésicules). En outre, la petite taille des VUS limite l'encapsulation de composants peu concentrés tels que le plasmide codant peptide, ce qui explique l'expression relativement faible des peptides. Le processus d'encapsulation sous-jacent est un processus Poisson, et donc la concentration d'un composant particulier doit être d'au moins 150 nM pour garantir une probabilité d'encapsulation de 95%. Par conséquent, il est tout à fait remarquable qu'il soit possible d'observer une telle augmentation de la taille des vésicules dans ces expériences.
Le protocole présenté ici permettra aux chercheurs de créer des vésicules à base de peptides à partir de polypeptides ressemblant à de l'élastine. Il ouvre également des possibilités de produire des structures artificielles ressemblant à des cellules encapsulées par des membranes peptidiques, qui représentent des alternatives attrayantes aux compartiments classiques fabriqués à partir d'acides gras ou de phospholipides. Les peptides sont avantageux en ce qu'ils peuvent être facilement exprimés dans un environnement sans cellules (par exemple, dans le système TX-TL utilisé ici), ce qui permet le couplage de la croissance de la membrane directement à un processus de transcription-traduction à l'intérieur de la vésicule. En outre, les PEL peuvent être conçus et ajustés à des paramètres physicochimiques spécifiques tels que la longueur du contour, l'hydrophobicité/hydrophilie du débloc utilisé, et la sensibilité à des stimuli tels que le pH ou la force ionique.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions le soutien financier par le biais de la DFG TRR 235 (Emergence of Life, projet P15), du Conseil européen de la recherche (accord de subvention no 694410 AEDNA) et de la TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (projet no 9.05) . Nous remercions E. Falgenhauer pour son aide dans la préparation des échantillons. Nous remercions A. Dupin et M. Schwarz-Schilling pour leur aide dans le système TX-TL et pour leurs discussions utiles. Nous remercions N. B. Holland pour les discussions utiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| Chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| Phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
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