Summary
Aquí se presentan protocolos para la creación de pequeñas vesículas unilamelares basadas en péptidos capaces de crecer. Para facilitar la producción vesiculo del péptido de membrana, estas vesículas están equipadas con un sistema de transcripción-traducción y el plásmido codificante de péptidos.
Abstract
La compartimentación de las reacciones bioquímicas es un aspecto central de las células sintéticas. Para este propósito, los compartimentos de reacción basados en péptidos sirven como una alternativa atractiva a los liposomas o vesículas a base de ácidos grasos. Externamente o dentro de las vesículas, los péptidos se pueden expresar fácilmente y simplificar la síntesis de precursores de membrana. Aquí se proporciona un protocolo para la creación de vesículas con diámetros de 200 nm basados en los polipéptidos anfifílicos similares a la elastina (ELP) utilizando la deshidratación-rehidratación de cuentas de vidrio. También se presentan los protocolos para la expresión y purificación de ELP bacteriana a través del ciclo de temperatura inversa, así como su funcionalización covalente con colorantes fluorescentes. Además, este informe describe un protocolo para permitir la transcripción del ARN aptamer dBroccoli dentro de las vesículas ELP como un ejemplo menos complejo para una reacción bioquímica. Por último, se proporciona un protocolo, que permite la expresión vesiculo de proteínas fluorescentes y el péptido de membrana, mientras que la síntesis de este último da lugar al crecimiento de la vesícula.
Introduction
La creación de sistemas celulares sintéticos vivos se aborda generalmente desde dos direcciones diferentes. En el método de arriba hacia abajo, el genoma de una bacteria se reduce a sus componentes esenciales, lo que en última instancia conduce a una célula mínima. En el enfoque ascendente, las células artificiales se ensamblan de novo a partir de componentes moleculares o subsistemas celulares, que necesitan integrarse funcionalmente en un sistema similar a una célula consistente.
En el enfoque de novo, la compartimentación de los componentes bioquímicos necesarios se logra generalmente utilizando membranas hechas de fosfolípidos o ácidos grasos1,2,3,4. Esto se debe a que las membranas celulares "modernas" consisten principalmente en fosfolípidos, mientras que los ácidos grasos se consideran candidatos plausibles de recintos de membrana prebióticos5,6. Para la formación de nuevas membranas o para facilitar el crecimiento de la membrana, los bloques de construcción anfifílicos deben proporcionarse desde el exterior7 o idealmente a través de la producción dentro de un compartimento membranoso utilizando los procesos anabólicos correspondientes4 ,8.
Mientras que la síntesis de lípidos es un proceso metabólico relativamente complejo, los péptidos se pueden producir con bastante facilidad utilizando reacciones de expresión génica libre de células9,10. Por lo tanto, las membranas peptídicas formadas por péptidos anfifílicos representan una alternativa interesante a las membranas lipídicas como recintos para imitaciones celulares artificiales que son capaces de crecer11.
Los copolímeros dibloquealinas anfifílicas similares a dibloques (ELP) son una atractiva clase de péptidos, que pueden servir como bloque de construcción para tales membranas12. El motivo básico de secuencia de aminoácidos de ELPs es (GaGVP)n, donde "a" puede ser cualquier aminoácido excepto prolina y "n" es el número de repeticiones de motivo13,14,15,16,17 . Los ELP se han creado con un bloque hidrófobo que contiene principalmente fenilalanina para un y un bloque hidrófilo compuesto principalmente de ácido glutámico11. Dependiendo de los parámetros de una y solución, como el pH y la concentración de sal, los ELP presentan una llamada transición inversa de la temperatura a temperatura Tt, donde los péptidos se someten a una transición de fase totalmente reversible de un hidrófilo a un hidrofóbico Estado. La síntesis de los péptidos se puede implementar fácilmente dentro de las vesículas utilizando el extracto de células bacterianas "TX-TL"11,18,19,20,21, que proporciona todos los componentes necesarios para la transcripción acoplada y las reacciones de traducción.
El sistema TX-TL fue encapsulado juntos, con la plantilla de ADN que codifica los ELP en vesículas ELP utilizando la deshidratación-rehidratación de cuentas de vidrio como un soporte sólido. La formación de vesículas se produce a través de la rehidratación de los péptidos secos de la superficie del cordón11. Se pueden utilizar otros métodos22 para la formación de vesículas, que potencialmente muestran una polidispersidad más baja y tamaños de vesícula más grandes (por ejemplo, electroformación, transferencia de fase de emulsión o métodos basados en microfluídicos). Para probar la viabilidad del método de encapsulación, la transcripción del aptámero fluorogénico dBroccoli23 se puede utilizar alternativamente11,que es menos compleja que la expresión génica con el sistema TX-TL.
Debido a la expresión de los bloques de construcción de membrana en vesiculo y su posterior incorporación a la membrana, las vesículas comienzan a crecer11. La incorporación de membrana de los ELP se puede demostrar a través de un ensayo FRET. Con este fin, los ELP utilizados para la formación de la población inicial de vesículas se conjugan con colorantes fluorescentes en partes iguales que constituyen un par FRET. Tras la expresión de ELP no etiquetados en vesiculo y su incorporación a la membrana, los ELP etiquetados en la membrana se diluyen y, en consecuencia, la señal FRET disminuye11. Como método versátil y común para la conjugación, se utiliza la cicloadición de azide-alquino catalizada en cobre. Con el uso de un ligando estabilizador como tris(benzyltriazolylmethyl)-amine, la reacción se puede llevar a cabo en una solución acuosa a un pH fisiológico sin la hidrólisis de los reactivos11,que es apropiado para reacciones de conjugación péptidos.
El siguiente protocolo presenta una descripción detallada de la preparación para el cultivo de peptidosomas basados en ELP. Se describe la expresión de los péptidos y la formación de vesículas utilizando el método de cuentas de vidrio. Además, se describe cómo implementar la transcripción del aptámero fluorogénico de dBroccoli y la reacción de transcripción-traducción para la expresión de proteínas dentro de las vesículas ELP. Por último, se proporciona un procedimiento para la conjugación de ELP con fluoróforos, que se puede utilizar para probar el crecimiento de la vesícula a través de un ensayo FRET11.
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Protocol
1. Expresión de polipéptidos similares a la elastrina
- Día 1: Preparación de un cultivo inicial y suministros para la expresión de péptidos
- Preparación y autoclave de matraces de cultivo de expresión (4 x 2,5 L) y 3 L de medio LB. Para 1 L de medio LB, añadir 25 g de polvo LB a 1 L de agua ultrapura.
- Preparar un cultivo de arranque con 100 ml de medio LB, 50 ml de solución de cloramphenicol filtrada estérilmente (filtro de 0,22 m) (25 mg/ml en EtOH) y 50 ml de solución de carbenicilina filtrada estérilmente (100 mg/ml en 50% De EtOH y 50% de agua ultrapura).
- Añadir una pequeña veta de un stock bacteriano prefabricado que contiene E. coli cepa BL21(DE3)pLysS con el vector de expresión pET20b(+) codificando la secuencia de polipéptidos MGHGVGVP((GEGVP)4(GVGVP))4((GFGVP)4(GVGVP))3 (GFGVP)4GWP (abreviado como EF) a un cultivo de arranque precalentado de 100 ml e incubar a 37 oC durante 16 h con 250 rpm en una incubadora de agitación (las cepas y vectores deE. coli están disponibles bajo petición).
- Precalienta los matraces de cultivo de expresión y los medios LB a 37oC durante la noche para que estén preparados para el día siguiente.
- Día 2: Expresión de proteínas
- Añadir 750 ml de medio LB a cada matraz de cultivo de expresión, 375 ml de material de carbenicilina filtrada estérilmente (filtro de 0,22 m) (25 mg/ml en EtOH) y 375 ml de material de carbenicilina filtrada estérilmente (100 mg/ml en 50% EtOH y 50% de agua ultrapura).
- Después de agitar para distribuir los antibióticos, tomar 2 ml del medio como muestra de referencia para la medición de densidad óptica a 600 nm (OD600).
- Añadir 7,5 ml del cultivo inicial al matraz de expresión e incubar durante 1 h a 37oC con 250 rpm.
- Después de este paso, el OD600 de cada matraz se comprobará cada 20 minutos.
- Cuando la densidad óptica alcanza aproximadamente 0,8, reduzca la temperatura a 16 oC e induzca la expresión de péptidos añadiendo 750 ml de 1 M de tiogalactostido de isopropil estéril (IPTG) en agua ultrapura en cada matraz de expresión.
- Incubar el matraz de expresión con las bacterias inducidas a 16oC durante 16 h con 250 rpm.
- Día 3: Extracción del polipéptido expresado
- Pese previamente el matraz de centrifugación para permitir la determinación de la masa del pellet celular después de la cosecha.
- Cosecha todas las bacterias de los matraces de expresión por centrifugación durante 20 min usando una centrífuga preenfriada a 4.000 x g y 4oC.
- Vierta el sobrenadante y vierta las botellas de centrífuga en una toalla de papel estéril.
- Pesar los matraces de centrifugación y calcular la masa de pellets celulares.
- Resuspender las células, que se peletizan desde 750 ml de cultivo celular original, en 15 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS, pH 7.4) por pipeteo, y centrífuga a 4.000 x g durante 20 min a 4 oC. Vierta el sobrenadante y vierta las botellas de centrífuga en una toalla de papel estéril.
- Resuspender el pellet celular para el paso de lisis en 2 ml de tampón por 1 gramo de pellet celular usando PBS (pH 7.4) complementado con lisozyma (1 mg/ml), 1 mM de flúor de fenilmetilonil (PMSF), 1 mM de benzamidina y 0,5 U de DNase I.
- Sonicar las células para una mayor lisis en el hielo con un sonicador a 8 W durante 9 min con alternando 10 s sonicación y 20 s pausando pasos, seguido de una pausa de 9 minutos durante la cual la muestra debe ser enfriada en hielo. Repita el paso de sonicación de 9 minutos una vez más.
- Añadir 2 ml de 10% (p/v) de polieetilemina (PEI) por 1 L de cultivo celular original para la precipitación de ácido nucleico.
- Distribuir la muestra en tubos centrífugos de 2 ml e incubar a 60 oC durante 10 min seguido de una incubación durante 10 min a 4 oC.
- Centrifugar la solución a 16.000 x g durante 10 min a 4 oC y recoger el sobrenadante que contiene el ELP.
- Purificación de proteínas mediante ciclo de temperatura inverso:
- Ajuste el sobrenadante a un pH de 2 para cambiar la parte hidrófila del péptido a hidrófobo e inducir la agregación. Para ajustar el pH, se utilizan ácido fosfórico e hidróxido de sodio. las franjas de pH son suficientes para determinar el nivel de pH.
- Para mejorar el rendimiento de la purificación de la muestra, calentar la muestra a 60 oC y añadir cloruro de sodio hasta 2 M.
- Posteriormente, centrifugar la muestra a 16.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
- Deseche el sobrenadante y vuelva a disolver el pellet en PBS (pero sólo se utiliza la mitad del volumen inicial en comparación con el paso anterior).
- Ajuste el pH a 7 con ácido fosfórico e hidróxido de sodio. las rayas de pH son lo suficientemente precisas para determinar el pH.
- Centrifugar la muestra posteriormente a 16.000 x g durante 10 min a 4oC.
- Recoja el sobrenadante y repita los pasos 1.4.1–1.4.6 hasta 3 veces en total, excepto que en la última repetición del paso 1.4.4, solo se agrega agua en lugar de PBS.
- Mida la concentración de los péptidos con un espectrómetro de absorción. Utilice un coeficiente de extinción de 5500/M/cm a 280 nm.
- Ajustar la concentración del ELP a 700 m.
2. Producción de vesículas utilizando el método de cuentas de vidrio
- Concentre la solución ELP a 1,1 mM utilizando un concentrador de vacío centrífugo.
- Mezclar 200 ml de la solución de ELP concentrada con 1.250 ml de una mezcla de cloroformo/metanol 2:1 seguida de vórtice.
- Añadir 1,5 g de perlas de vidrio esféricas (212–300 m de tamaño) a un matraz inferior redondo de 10 ml.
- Agregue la solución que contiene ELP y la mezcla de cloroformo/metanol al matraz inferior redondo y mezcle agitando suavemente.
- Conecte el matraz a un evaporador rotatorio. Ajuste la velocidad a 150 rpm y regule la presión a -0,2 x 105 Pa (-200 mbar) durante aproximadamente 4 minutos hasta que el líquido se evapore a temperatura ambiente.
- Coloque el matraz inferior redondo en un desecador durante al menos 1 h para asegurarse de que el cloroformo y el metanol restantes se evaporen. Para evitar la pérdida de las perlas de vidrio, papel de aluminio suelto unido debe envolverse alrededor de la abertura del matraz inferior redondo.
- Para un solo experimento, mezcle 100 mg de las cuentas de vidrio cubiertas de péptido con 60 ml de la solución de hinchazón, como PBS. Incubar esta muestra a 25oC durante 5 min.
- Centrifugar la muestra rápidamente con una centrífuga de mesa para sedimentar las cuentas de vidrio.
- Utilice una pipeta para recoger el sobrenadante que contiene las vesículas.
3. Transcripción del ARN Aptamer dBroccoli Dentro de las Vesículas
- Limpie el banco de laboratorio con toallitas que contienen la solución de descontaminación RNase para crear un entorno de trabajo libre de RNase.
- Mezclar el ssDNA (5 oM) que comprende el promotor T7 y la secuencia de dBroccoli (GAGACGGTCGGGTCCATTCGAGACGGTCGGGTCCAGATATTCGTATCTCGAGTAGAGTGGCGGATGTCGAGTAGGTGTC), así como la hebra no codificante (5-M) en agua libre de nucleasas suplementada con Búfer de reacción de RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH a 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM de ditiothreitol (TDT) y 2 mM de esperdinano], para preparar la plantilla de ADN para la reacción de transcripción.
- Incubar la solución a 90oC durante 5 min seguida de una disminución lenta de la temperatura a 20oC durante 30 min.
- Preparar una solución de 1 mM (5Z)-5-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2,3-dimethyl-3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one (DFHBI) disolviendo 1.26 mg de DFHBI en 5 ml de DMSO.
- Preparar la reacción de transcripción mezclando el tampón de reacción de RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH a 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM de dithiothreitol (DTT), y 2 mM de esspermidina] con 125 mM de KCl, 15 mM MgCl2, 4 mM rNTP, 10 M DFHBI, plantilla de ADN de 200 nM, 0.5 U/N inhibidor de la murino, y el agua.
- Justo antes de iniciar la reacción, añada 4 U/L T7 polimerasa.
- Utilice esta mezcla de reacción como la solución de hinchazón en el paso 2.7 e incubar a 37 oC durante la duración del experimento, que suele ser de 1 h.
4. Transcripción-traducción (TX-TL) Reacción
NOTA: Para la reacción de transcripción-traducción, se requiere un extracto de célula bruta, así como el búfer de reacción y el ADN. El extracto de célula sordo se prepara como se describe en Sun et al.18. Para una reacción TX-TL, utilice lo siguiente: 33% (v/v) del extracto crudo de E. coli, tampón de reacción del 42% (v/v) y 25% (v/v) ADN purificado de fenol-cloroformo más aditivos. Las concentraciones finales son de aproximadamente 9 mg/ml de proteína, 50 mM DE HEPES (pH a 8), 1,5 mM de ATP, 1,5 mM DE GTP, 0,9 mM de CTP, 0,9 mM de UTP, 0,2 mg/mL de ARNm, coenzima A de 26 mM, NAD de 0,33 mM, 0,75 mM de cAMP, 68 mM de ácido foliico, 1 mmde , PEP de 30 mM, TDT de 1 mM, 2% PEG-8000, 13,3 mM de maltosa, 1 U de ARN polimerasa T7 y ADN plásmido de 50 nM en agua ultrapura.
-
Purificación de fenol-cloroformo de la plantilla de ADN
- Preparar seis cultivos nocturnos con 5 ml de medio LB y 5 ml de solución de carbenicilina filtrada estérilmente (filtro de 0,22 m) (100 mg/ml en 50% EtOH y 50% de agua ultrapura).
- Añadir una pequeña veta de un stock bacteriano prefabricado que contenga DH5 e. coli con el vector de expresión pET20b(+) a cada cultivo nocturno de 5 ml precalentado e incubar a 37 oC durante 16 h con 250 rpm. Dependiendo de qué péptido (EF) o proteína (YPet o mVenus) se va a expresar, se utiliza un plásmido de codificación específico.
- Extraiga el plásmido con un mini-preparación kit como se describe en el manual del usuario o siguiendo el protocolo proporcionado por Zhang et al.24.
- Preparar 100 l del ADN plásmido prepurificado (la concentración puede oscilar entre 200 y 600 ng/L) y mezclar con 100 l de alcohol de rotiol/cloroformo/isoamilo (pH a 7,5–8,0) en un tubo de microcentrífuga para permitir una mejor separación de fase.
- Invierta suavemente el tubo hasta 6x y centrífuga durante 5 min a 16.000 x g a RT.
- Añadir 200 ml de cloroformo a la fase superior del tubo e invertir el tubo hasta 6x.
- Centrifugar la muestra a 16.000 x g durante 5 min a RT.
- Pipeta el sobrenadante a un tubo separado y agregue 10 éL de 3 M de acetato de sodio para la precipitación de etanol.
- Añadir 1 mL de etanol frío de -80oC y almacenar la muestra a -80oC durante 1 h.
- Centrifugar la muestra a 16.000 x g durante 15 min a 4oC.
- Decantar el sobrenadante y añadir 1 mL de etanol frío de -20 oC 70% (v/v).
- Centrífuga a 16.000 x g durante 5 min a 4oC.
- Retire el líquido pipeteando. Tenga cuidado de no molestar el pellet de ADN.
- Almacene la muestra en RT durante aproximadamente 15 minutos para evaporar el etanol restante.
- Añadir agua ultrapura a la muestra para ajustar la concentración de la muestra a aproximadamente 300 nM, que se mide por absorción a 260 nm.
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Preparación de la reacción TX-TL
- Descongelar el extracto de células brutas preparado y el búfer de reacción en hielo.
- Para una mezcla de reacción de 60 l, añada el ADN plásmido (purificado de fenol-cloroformo) a 37,5 l del búfer de reacción [50 mM HEPES (pH a 8), 1,5 mM de ATP, 1,5 mM de GTP, 0,9 mM de CTP, 0,9 mM de UTP, 0,2 mg/mL de ARNm, coenzima A de 26 mM, 0,33 mM de NAD , 0,75 mM de cAMP, 68 mM de ácido flínico, 1 mM de esperdina, PEP de 30 mM, TDT de 1 mM, 2% peg-8000 y maltosa de 13,3 mM), seguido de la adición de 28,7 l de extracto de células brutas. Llene a un volumen final con agua ultrapura a 58,8 l.
- Justo antes de que comience la reacción, agregue 1,2 ml de la solución de polimerasa de ARN T7 y mezcle la muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Utilice esta mezcla de reacción como una solución de hinchazón en el paso 2.7 e incubar a 29 oC durante la duración del experimento, que suele ser de 4 a 8 h.
5. Conjugación de polipéptidos similares a la elastina con fluoróforos a través de azide-alkyne Huisgen Cycloaddition
- Preparar una solución de enlace NHS-azida de 20 mM (éster N-hidroxisuccinimida de ácido azidobutírico) en DMSO.
- Mezclar 250 l de la solución ELP (600 m) con PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L Na2HPO4, 0,27 g/L K2HPO4, pH a 7,2) y NHS-azida (1,2 mM) e incubar durante 12 horas en RT.
- Cargue la muestra en un casete de diálisis de 10 kDa y guárdela a 4oC durante 12 h en 1 L de agua ultrapura para eliminar las sales y el NHS-azida residual.
- Mezcle el ELP activado (500 m) con el tinte conjugado de alquino (500 oM), Cy5-alkyne o Cy3-alkyne.
- Mezclar esta muestra con 1 mM tBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine), 10 mM TCEP (tris(2-carboxiletyl)-clorhidrato de fosfina) y 10 mM CuSO4 e incubar a 4oC durante 12 h.
- Cargue la muestra en un casete de diálisis de 10 kDa y guárdela a 4oC durante 12 h en 1 L de agua ultrapura, para eliminar las sales y los colorantes conjugados conjugados en alquino residual.
- Estos ELP modificados por tinte se utilizan en una mezcla 1:1 de los ELP etiquetados Cy3 y los ELP etiquetados Cy5 análogos a los péptidos de la segunda parte.
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Representative Results
Producción de vesículas
La Figura 1 muestra imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de vesículas preparadas con diferentes soluciones de hinchazón y el método de cuentas de vidrio (véase también Vogele et al.11). Para la muestra de la Figura 1A,sólo PBS se utilizó como solución de hinchazón para probar la formación de vesículas y determinar su tamaño. Cuando TX-TL se utilizó como solución de hinchazón (Figura1B),las vesículas también se formaron. Se realizaron mediciones de dispersión dinámica de la luz (DLS) para mostrar que el método de las cuentas de vidrio tiene un efecto en la formación de vesículas. La Figura 2 representa las curvas de autocorrelación de intensidad medida de una muestra EF preparada sin cuentas de vidrio en PBS (azul) y una muestra EF preparada con el método de cuentas de vidrio con PBS como la solución de hinchazón (rojo). Los tamaños se calcularon a partir de un ajuste cumulante25 y resultaron en un diámetro de 134 nm con una polidispersidad del 25% cuando las vesículas se prepararon sin el método de cuentas de vidrio. Cuando se utilizaron las cuentas de vidrio, el ajuste cumulante dio como resultado un diámetro de 168 nm con una polidispersidad del 21%.
En la transcripción vesiculo 11
La Figura 3 muestra el perfil de intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo para la transcripción del aptámero de dBroccoli dentro de las vesículas EF (verde). Como control negativo, DNase I se añadió a la solución de hinchazón y por lo tanto también se incorporó durante la formación de vesículas (azul). Las mediciones se realizaron en lector de placas de fluorescencia con excitación a 480 nm y emisión a 520 nm.
En la expresión de proteína vesiculo 11
La Figura 4 muestra la intensidad de fluorescencia de dos proteínas fluorescentes que se expresaron dentro de las vesículas ELP utilizando un lector de placas de fluorescencia. La excitación se llevó a cabo 500 nm y la emisión a 520 nm. La transcripción-traducción de mVenus (Figura4A)se realizó para investigar la dinámica de expresión y el nivel de expresión de las proteínas en la vesícula ELP. Es importante tener en cuenta que después de la formación de vesículas, el contenido de las vesículas y la solución externa son los mismos. Por lo tanto, para suprimir la expresión proteica fuera de la vesícula, el antibiótico kanamicina se añadió a la solución exterior. Como control, también se añadió kanamicina a la solución de hinchazón, en cuyo caso se suprimió la expresión de proteína dentro de la vesícula. Esto indica además que la pequeña molécula kanamicina permanece dentro de la vesícula y sugiere que la membrana no es permeable para esta molécula en la escala de tiempo de estos experimentos. Si la kanamicina se difundiera a través de la membrana, la expresión mVenus no habría sido suprimida y a las 5 h, la fluorescencia sería mayor. En el segundo experimento, se llevó a cabo la expresión de YPet (Figura4B). Ambas proteínas fueron elegidas porque exhiben un tiempo de maduración más rápido que, por ejemplo, GFP. Además, el promotor T7 fue utilizado para la transcripción de mVenus y un promotor constitutivo utilizado para la transcripción de YPet para mostrar que tanto la expresión inducible como la continua son posibles.
Ensayo FRET 11
La Figura 5A muestra los resultados del ensayo FRET realizado para demostrar la incorporación de ELP en la membrana. Por lo tanto, las vesículas se produjeron utilizando una mezcla de dos construcciones de fluoroforo-péptido igualmente concentradas. Estos fueron Cy3-EF (donante) y Cy5-EF (aceptador). En el momento t a 0, se midió el nivel de FRET inicial. Las señales del donante y la señal FRET dependen de la distancia media entre los colorantes de la membrana. Tras la expresión de los ELP de membrana, se incorporan péptidos adicionales en la membrana, lo que aumenta la distancia media entre los pares de FRET. Este último se midió a través del aumento de la fluorescencia del donante y una disminución de la señal FRET en el tiempo t a 2,5 h. La Figura 5B muestra el control negativo. Aquí, se añadió kanamicina a la solución de hinchazón antes de la formación de vesículas. La kanamicina suprime la expresión de proteínas; por lo tanto, no se pudo ver ningún cambio en EL FRET. Es importante tener en cuenta que este ensayo solo muestra la incorporación de EF.
Figura 1: Imágenes TEM representativas. (A) Vesículas EF formadas en la solución de hinchazón PBS. (B) Vesículas EF formadas en la solución de hinchazón TX-TL. Barras de escala a 200 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Datos DLS representativos. Curvas de autocorrelación de intensidad medidas por DLS. La curva azul representa los péptidos EF en PBS preparados sin el método de cuentas de vidrio. La curva roja representa una solución EF producida con el método de cuentas de vidrio y PBS como la solución de hinchazón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: transcripción de dBroccoli. Datos representativos de la transcripción del aptámero de dBroccoli dentro de las vesículas EF. La curva verde representa la señal de fluorescencia y la curva azul la medida de control con DNase encapsulado I. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Expresión de proteínas dentro de las vesículas de péptidos. (A) Un mVenus de codificación plásmido y la mezcla de expresiones TX-TL se encapsularon en las vesículas ELP. Después de aproximadamente 5 h, la fluorescencia se satura. Cuando el antibiótico kanamicina también fue encapsulado, no se observó fluorescencia. (B) Se obtuvieron resultados similares tras la encapsulación de un plásmido YPet. Las barras de error representan la desviación estándar de los valores medidos en el tiempo indicado durante un período de tiempo de 15 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ensayo FRET. (A) Inicio de los niveles de fluorescencia en el tiempo t a 0 para la emisión del donante y la señal FRET (emisión de aceptación). A t a 2,5 h, el donante mostró un aumento de la emisión, y la señal FRET disminuyó. (B) Cuando sólo se expresaron ELP hidrófilos dentro de las vesículas, la señal FRET y la emisión del donante se mantuvieron constantes. Las barras de error representan la desviación estándar de los valores medidos en el tiempo indicado durante un período de tiempo de 15 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La rehidratación cinematográfica es un procedimiento común para la creación de pequeñas vesículas unilamellares. La principal fuente de fallo es el manejo incorrecto de los materiales utilizados en el procedimiento.
Inicialmente, los ELP son producidos por células de E. coli. El rendimiento después de la purificación de ELP puede variar significativamente dependiendo de la cuidadosa realización del protocolo durante sus pasos cruciales. Estos son el paso de ciclo de temperatura inversa (ITC) y la resuspensión de los ELP después de la precipitación. Para la purificación, desencadenamos el colapso hidrófobo del péptido a través de la adición de ácido fosfórico, que cambia el pH a ácido y conduce a la protonación de las cadenas laterales del ácido glutámico en el bloque hidrófilo. Después de este paso, ambos bloques son hidrófobos en RT. Es preferible utilizar un ácido cuya sal ya está en la solución para mantener la fuerza iónica constante, pero también se pueden utilizar otros ácidos como el ácido clorhídrico. Para aumentar el rendimiento de la producción de ELP, se pueden añadir sales adicionales para mejorar el proceso de coacervación, ya que la sal disminuye la temperatura de transición Tt y hace que el ELP sea más hidrófobo. Por lo general se utiliza cloruro de sodio, pero las sales kosmotrópicas como el sulfato de sodio son mucho mejores, mientras que la concentración de sal puede estar cerca de su límite de solución. La calefacción adicional con un baño de agua puede aumentar aún más el rendimiento.
Otro paso crítico es la resolución del pellet ELP. Para una máxima solubilidad de ELP, la solución debe estar preenfriada, y un ajuste rápido del pH puede ayudar a disolver el pellet más rápido. Es posible que sea necesario reajustar el pH durante este proceso varias veces. Para una mejora adicional, la muestra se puede almacenar en la nevera a 4 oC y se debe evitar el temblor de la muestra. Para intercambiar sales, debe preferirse el paso de diálisis descrito al final del protocolo de purificación. En principio, el ITC se puede utilizar para separar los péptidos del sobrenadante que contiene sal. Pero dependiendo de la concentración de sal anterior, la sal residual todavía se puede encontrar en este pellet. Además, la diálisis se puede utilizar para concentrar los péptidos necesarios para los experimentos sin pérdidas como se mencionó anteriormente.
El siguiente paso crucial es la evaporación de la mezcla de cloroformo/metanol. Durante la evaporación a presiones reducidas, un retraso en la ebullición puede causar salpicaduras o turbulencias, lo que puede resultar en una gran pérdida de cuentas de vidrio. Esto se puede prevenir usando filtros o tejidos. El mismo problema surge cuando se utiliza el desecador, pero la lámina de aluminio en la abertura del matraz de fondo redondo se puede utilizar para evitar esto. Para el manejo de las perlas de vidrio recubiertas con ELP, se recomienda utilizar microespátulas antiestáticas desechables, lo que también reduce las pérdidas y simplifica el procedimiento.
La hinchazón de las vesículas utilizando varias soluciones de hinchazón como PBS y la mezcla de transcripción es directa y menos propensa a errores. Sin embargo, para el sistema TX-TL, pueden producirse variaciones de lote a lote de hasta el 10%. Para minimizar este problema, todos los experimentos deben realizarse con un solo lote de extracto sin celda, que se puede utilizar para hasta 3.000 reacciones. Después de la rehidratación, el contenido de vesícula y la solución externa son la solución de hinchazón. No se debe realizar una purificación de la solución exterior, ya que esto puede cambiar la diferencia de presión osmótica entre la vesícula interior y exterior. El resultado sería un cambio de tamaño incontrolado o incluso una ráfaga de las vesículas. Por lo tanto, las posibles reacciones en el exterior sólo deben suprimirse. Dependiendo de la reacción, esto se puede hacer, por ejemplo, por la adición DNase I para digerir el ADN presente o mediante la adición de antibióticos como la kanamicina, que inhibe la traducción.
La rehidratación de película de cuentas de vidrio tiene varias ventajas en comparación con otros métodos de preparación. A diferencia de la inyección de disolvente, no se requiere la transferencia de fase de emulsión o el desplazamiento microfluídico del disolvente, ya que el disolvente inicial se evapora por completo y los péptidos se rehidratan en solución acuosa. Por lo tanto, el método de perlas de vidrio es particularmente adecuado para muestras sensibles como TX-TL, que pueden verse significativamente afectadas o incluso destruidas por disolventes orgánicos residuales utilizados en otros métodos. Además, el protocolo es sencillo, menos propenso a errores y puede ampliarse fácilmente. Debido a la gran relación superficie-volumen sólo se necesitan pequeñas cantidades de perlas de vidrio y permiten un alto grado de paralelización con un alto rendimiento.
Como principal desventaja, el método de cuentas de vidrio sólo es útil para la creación de pequeñas vesículas unilamellares, que no se pueden observar a través de microscopía de fluorescencia. El método descrito es algo limitado cuando se desea la observación microscópica de la dinámica de vesículas individuales, lo que a veces es necesario (por ejemplo, cuando se observan posibles procesos de división vesícula). Además, el pequeño tamaño de los SUV limita la encapsulación de componentes de baja concentración, como el plásmido de codificación de péptidos, lo que explica la expresión relativamente baja de los péptidos. El proceso de encapsulación subyacente es un proceso de Poisson, y por lo tanto la concentración de cualquier componente en particular debe ser por lo menos 150 nM para garantizar una probabilidad de encapsulación del 95%. Por lo tanto, es bastante notable que es posible observar un aumento tan grande en el tamaño de la vesícula en estos experimentos.
El protocolo presentado aquí permitirá a los investigadores crear vesículas basadas en péptidos a partir de polipéptidos similares a la elastina. También abre oportunidades para producir estructuras artificiales similares a células encapsuladas por membranas peptídicas, que representan alternativas atractivas a los compartimentos clásicos hechos de ácidos grasos o fosfolípidos. Los péptidos son ventajosos en el que se pueden expresar fácilmente en un entorno libre de células (por ejemplo, en el sistema TX-TL utilizado aquí), lo que permite el acoplamiento del crecimiento de la membrana directamente a un proceso de transcripción-traducción dentro de la vesícula. Además, los ELP se pueden diseñar y ajustar a parámetros fisicoquímicos específicos como la longitud del contorno, la hidrofobicidad/hidrofilicidad del desbloque utilizado y la sensibilidad a estímulos como el pH o la resistencia iónica.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos el apoyo financiero a través de la DFG TRR 235 (Emergence of Life, proyecto P15), el Consejo Europeo de Investigación (acuerdo de subvención no 694410 AEDNA) y la TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (proyecto no 9.05) . Agradecemos a E. Falgenhauer por su ayuda con la preparación de muestras. Agradecemos a A. Dupin y M. Schwarz-Schilling por su ayuda con el sistema TX-TL y discusiones útiles. Agradecemos a N. B. Holland por sus útiles discusiones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| Chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| Phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
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