Summary
Presenteras här är protokoll för skapandet av peptid-baserade små små blåsor som kan växa. För att underlätta i vesikulobullösa produktion av membran peptid, dessa blåsor är utrustade med en transkription-översättningssystem och peptid-kodning plasmid.
Abstract
Compartmentalization av biokemiska reaktioner är en central aspekt av syntetiska celler. För detta ändamål, peptid-baserade reaktions utrymmen fungera som ett attraktivt alternativ till liposomer eller fettsyrabaserade vesikler. Externt eller inom vesiklarna, peptider kan lätt uttryckas och förenkla syntesen av membran prekursorer. Förutsatt att här är ett protokoll för skapandet av blåsor med diametrar på ~ 200 nm baserat på den amfifila elastin-liknande polypeptider (ELP) utnyttjar uttorkning-rehydrering från glaspärlor. Också presenteras är protokoll för bakteriell ELP uttryck och rening via omvänd temperatur Cykling, liksom deras kovalenta funktionalisering med fluorescerande färgämnen. Dessutom beskriver detta betänkande ett protokoll för att möjliggöra transkription av RNA aptamer dbroccoli inuti ELP blåsor som ett mindre komplext exempel för en biokemisk reaktion. Slutligen ges ett protokoll, som gör att vesikulobullösa uttryck för fluorescerande proteiner och membran peptid, medan syntesen av de senare resulterar i vesikler tillväxt.
Introduction
Skapandet av syntetiska levande cellulära system är oftast närmade sig från två olika riktningar. I uppifrån-och-ner-metoden reduceras genomet hos en bakterie till dess viktiga komponenter, vilket i slutändan leder till en minimal cell. I bottom-up-metoden är konstgjorda celler monterade de Novo från molekylära komponenter eller cellulära delsystem, som måste integreras funktionellt i ett konsekvent cell-liknande system.
I de Novo-metoden uppnås vanligen uppdelning av de nödvändiga biokemiska komponenterna med hjälp av membran tillverkade av fosfolipider eller fettsyror1,2,3,4. Detta beror på att "moderna" cellmembran består huvudsakligen av fosfolipider, medan fettsyror betraktas rimliga kandidater av prebiotiska membran kapslingar5,6. För bildandet av nya membran eller för att underlätta membran tillväxt, amfifila byggstenar måste tillhandahållas från utsidan7 eller helst genom produktion i ett membranös fack med hjälp av motsvarande anabola processer4 ,8.
Medan lipid syntes är en relativt komplex metabolisk process, peptider kan produceras ganska lätt med hjälp av cell-Free genuttryck reaktioner9,10. Därav, peptid membran bildas av amfifila peptider utgör ett intressant alternativ till lipid membran som kapslingar för konstgjorda cell härmar som kan växa11.
Amphiphilic elastin-liknande di-block sampolymerer (ELPs) är en attraktiv klass av peptider, som kan fungera som byggstenen för sådana membran12. Den grundläggande aminosyran sekvens motiv av ELPs är (gagvp)n, där "a" kan vara någon aminosyra utom prolin och "n" är antalet motiv upprepas13,14,15,16,17 . ELPs har skapats med ett hydrofobiskt block som huvudsakligen innehåller fenylalanin för a och ett hydrofila block, huvudsakligen sammansatt av glutaminsyra11. Beroende på a-och lösnings parametrar, såsom pH-och saltkoncentration, uppvisar ELPs en så kallad omvänd temperatur övergång vid temperatur Tt, där peptiderna genomgår en helt reversibel fasövergång från en hydrofilt till hydrofoba Statligt. Syntesen av peptiderna kan enkelt implementeras inuti blåsor med hjälp av "TX-TL" bakteriecell extrakt11,18,19,20,21, som ger alla nödvändiga komponenter för kopplade transkription och översättnings reaktioner.
TX-TL-systemet kapslades ihop, med DNA-mallen kodning av ELPs i ELP blåsor utnyttja uttorkning-rehydrering från glaspärlor som en solid stöd. Bildandet av vesikler sker genom rehydrering av de torkade peptiderna från pärlytan11. Andra metoder22 för vesikelbildning kan användas, som potentiellt visar lägre polydispersitet och större vesikler storlekar (t. ex., Electro-formation, emulsion fas överföring, eller mikrofluidics-baserade metoder). För att testa inkapslings metodens genomförbarhet kan transkription av den fluorogena aptamer dBroccoli23 alternativt användas11, vilket är mindre komplext än genuttryck med TX-TL-systemet.
På grund av uttrycket av membran byggstenarna i vesikulobullösa och deras senare inkorporering i membranet börjar vesiklarna att växa11. Membran inkorporering av ELPs kan påvisas genom en FRET analys. För detta ändamål är de ELPs som används för bildandet av den initiala vesikeln befolkningen konjugeras med fluorescerande färgämnen i lika delar som utgör en FRET par. Vid uttryck av icke-märkta ELPs i vesikulobullösa och deras införlivande i membranet, den märkta ELPs i membranet späds ut och därmed bandet signalen minskar11. Som en mångsidig och gemensam metod för konjugering, koppar katalyseras azid-alkyne cykloaddition används. Med hjälp av en stabiliserande ligand såsom tris (benzyltriazolylmetyl)-Amin, kan reaktionen utföras i en vattenlösning vid ett Fysiologiskt pH utan hydrolys av reaktanter11, vilket är lämpligt för konjugation reaktioner med peptider.
I följande protokoll presenteras en detaljerad beskrivning av förberedelserna för odling av ELP-baserade peptidosomer. Uttrycket av peptider och vesikelbildning med hjälp av glaspärlor metoden beskrivs. Vidare beskrivs hur man genomför transkription av den fluorogena dBroccoli aptamer och transkription-översättning reaktion för proteinuttryck inuti ELP blåsor. Slutligen, förutsatt är ett förfarande för konjugering av ELPs med fluoroforer, som kan användas för att bevisa vesikler tillväxt genom en FRET analys11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. uttryck av elastin-liknande polypeptider
- Dag 1: förberedelse av en förrätt kultur och tillförsel för peptid uttryck
- Förbered och autoklav uttryck kultur flaskor (4 x 2,5 L) och 3 L LB medium. För 1 l lb-medium, tillsätt 25 g lb pulver till 1 l ultrarent vatten.
- Förbered en förrätt kultur med 100 ml lb-medium, 50 μl sterilt filtrerat (0,22 μm filter) kloramfenikollösning (25 mg/ml i EtOH) och 50 μl av sterilt filtrerat (0,22 μm filter) carbenicillin-lösning (100 mg/ml i 50% EtOH och 50% ultrarent vatten).
- Tillsätt en liten strimma från en Pre-Made bakterie bestånd som innehåller E. coli stam BL21 (de3) plyss med pET20b (+) uttryck vektor kodning av polypeptid sekvens MGHGVGVP ((GEGVP)4(gvgvp))4((gfgvp)4(gvgvp))3 (Gfgvp)4GWP (förkortat EF) till en pre-warmed 100 ml starter kultur och inkubera vid 37 ° c för 16 h med 250 rpm i en skakande inkubator (E. coli stammar och vektorer finns tillgängliga på begäran).
- Förvärm uttrycket kultur flaskor och LB media vid 37 ° c över natten så att de är förberedda för nästa dag.
- Dag 2: protein uttryck
- Tillsätt 750 ml lb-medium till varje Expression Culture-kolv, 375 μl sterilt filtrerat (0,22 μm filter) kloramfenikolbeståndet (25 mg/ml i EtOH) och 375 μl av sterilt filtrerat (0,22 μm filter) carbenicillin-lager (100 mg/ml i 50% EtOH och 50% ultrarent vatten).
- Efter agitation för att fördela antibiotika, ta 2 mL av mediet som ett referensprov för optisk densitet mätning vid 600 Nm (OD600).
- Tillsätt 7,5 mL av start kulturen till uttrycks kol ven och inkubera i 1 h vid 37 ° c med 250 RPM.
- Efter detta steg kommer OD600 i varje kolv att kontrolleras var 20: de minut.
- När den optiska densiteten når cirka 0,8 minska temperaturen till 16 ° c och inducera peptid uttryck genom att tillsätta 750 μl av 1 M steril-filtrerad β-isopropyl thiogalactoside (IPTG) i ultrarent vatten i varje Expression kolv.
- Inkubera uttrycks kol ven med de inducerade bakterierna vid 16 ° c i 16 timmar med 250 RPM.
- Dag 3: extraktion av den uttryckta polypeptiden
- Före vägning av centrifugeringskolven för att möjliggöra bestämning av massan av cellpelleten efter skörd.
- Skörda alla bakterier från uttrycket kolvar genom centrifugering i 20 minuter med hjälp av en förkyld centrifug vid 4 000 x g och 4 ° c.
- Häll ut supernatanten och blot centrifug flaskorna på en steril pappershandduk.
- Väg centrifugeringsflaskor och beräkna cellens pelletmassa.
- Omsuspendera cellerna, som pelleteras ner från 750 mL av den ursprungliga cellkulturen, i 15 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4) genom pipettering, och centrifugera vid 4 000 x g i 20 min vid 4 ° c. Häll ut supernatanten och blot centrifug flaskorna på en steril pappershandduk.
- Omsuspendera cellpelleten för Lys-steget i 2 mL buffert per 1 gram cellpellet med hjälp av PBS (pH 7,4) kompletterat med lysozym (1 mg/mL), 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM benzamidin och 0,5 U DNase I.
- Sonikera cellerna för ytterligare Lys på is med en sonikator vid 8 W för 9 min med alternerande 10 s ultraljudsbehandling och 20 s pausa steg, följt av en 9 min paus under vilken provet ska kylas på is. Upprepa 9 min ultraljudsbehandling steg en gång till.
- Tillsätt 2 mL 10% (w/v) polyetyleneimin (PEI) per 1 liter ursprunglig cellkultur för nukleinsyrlig nederbörd.
- Fördela provet i 2 mL centrifugrör och inkubera vid 60 ° c i 10 min följt av en inkubering i 10 min vid 4 ° c.
- Centrifugera lösningen på 16 000 x g i 10 min vid 4 ° c och samla upp supernatanten som innehåller ELP.
- Protein rening via omvänd temperatur cykling:
- Justera supernatanten till ett pH på 2 för att byta hydrofila delen av peptiden till hydrofoba och inducera aggregering. För att justera pH-värdet används fosforsyra och natriumhydroxid. pH-ränder är tillräckliga för att bestämma pH-nivån.
- För att förbättra avkastningen av rening provet, värm provet till 60 ° c och tillsätt natriumklorid upp till 2 M.
- Därefter Centrifugera provet vid 16 000 x g i 10 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Kassera supernatanten och återlös pelleten i PBS (men endast hälften av den initiala volymen används jämfört med föregående steg).
- Justera pH till 7 med fosforsyra och natriumhydroxid. pH-ränder är tillräckligt noggranna för att bestämma pH-värdet.
- Centrifugera provet därefter vid 16 000 x g i 10 min vid 4 ° c.
- Samla supernatanten och upprepa steg 1.4.1-1.4.6 upp till 3x totalt, förutom att i den sista upprepningen av steg 1.4.4, endast vatten läggs istället för PBS.
- Mät koncentrationen av peptiderna med en absorptionsspektrometer. Använd en utrotningskoefficient på 5500/M/cm vid 280 nm.
- Justera ELP-koncentrationen till 700 μM.
2. vesikelproduktion med hjälp av glaspärlor metoden
- Koncentrera ELP-lösningen till 1,1 mM med en centrifugal vakuum koncentrator.
- Blanda 200 μL av den koncentrerade ELP-lösningen med 1 250 μL av en blandning av 2:1 kloroform och metanol följt av vortexing.
- Tillsätt 1,5 g sfäriska glaspärlor (212 – 300 μm i storlek) till en 10 mL rund botten kolv.
- Tillsätt den lösning som innehåller ELP och kloroform/metanol blandningen i den runda botten kolven och blanda genom skonsam skakning.
- Anslut kolven till en roterande indunstare. Justera hastigheten till 150 rpm och reglera trycket till-0,2 x 105 PA (-200 mbar) i ca 4 min tills vätskan avdunsta i rumstemperatur.
- Placera den runda botten kolven i en exsickator i minst 1 h för att säkerställa att kvarvarande kloroform och metanol avdunsta. För att undvika förlust av glaspärlor, löst ansluten aluminiumfolie bör lindas runt den runda botten kolven öppningen.
- För ett enda experiment, blanda 100 mg av peptid täckta glaspärlor med 60 μL av svullnad lösning, såsom PBS. Inkubera detta prov vid 25 ° c i 5 min.
- Centrifugera provet snabbt med en bords centrifug för att sedimentera glaspärlor.
- Använd en pipett för att samla in supernatanten som innehåller vesiklarna.
3. transkription av RNA aptamer dBroccoli inne i vesiklarna
- Rengör laboratorie bänken med våtservetter som innehåller RNase dekontamineringslösning för att skapa en RNase-fri arbetsmiljö.
- Blanda ssDNA (5 μM) bestående av T7 promotor och dBroccoli sekvens (GAGACGGTCGGGTCCATCTGAGACGGTCGGGTCCAGATATTCGTATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCAGATGTCGAGTAGAGTGTGGGCTC), och icke-kodning av strand (5 μM) i nukleasfritt vatten kompletterat med RNAPol reaktionsbuffert [40 mM Tris-HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mm ditiothreitol (dTT) och 2 mm Spermidin], för beredning av DNA-mallen för transkriptionsreaktionen.
- Inkubera lösningen vid 90 ° c i 5 min följt av en långsam temperatursänkning till 20 ° c i 30 min.
- Förbered en 1 mM (5Z)-5-(3, 5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2, 3-dimetyl-3,5-dihydro-4H-Imidazol-4-One (DFHBI) lösning genom att lösa 1,26 mg DFHBI i 5 mL av DMSO.
- Förbered transkriptionsreaktionen genom att blanda RNAPol-reaktionsbufferten [40 mM Tris-HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mm ditiothreitol (dTT) och 2 mm Spermidin] med 125 mm KCL, 15 mm mgcl2, 4 mm Rntp, 10 μm dfhbi, 200 nm DNA-mall, 0,5 U/μl RNase inhibitor murin och vatten.
- Precis innan reaktionen påbörjas, tillsätt 4 U/μL T7 Polymerase.
- Använd denna reaktionsblandning som svällningslösning i steg 2,7 och inkubera vid 37 ° c under experimentets varaktighet, vilket normalt är 1 h.
4. transkription-översättning (TX-TL) reaktion
Anmärkning: För transkription-översättning reaktion, en rå cell extrakt krävs samt reaktionsbuffert och DNA. Det råa cell extraktet bereds enligt beskrivningen i Sun et al.18. För en TX-TL-reaktion, Använd följande: 33% (v/v) av det råa E. coli -extraktet, 42% (v/v) reaktionsbuffert, och 25% (v/v) fenol-kloroform renat DNA plus tillsatser. De slutliga koncentrationerna är cirka 9 mg/ml protein, 50 mm Hepes (pH = 8), 1,5 mm ATP, 1,5 mm GTP, 0,9 mm CTP, 0,9 mm UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 26 mm coenzym A, 0,33 mm nad, 0,75 mm läger, 68 mm folinsyra syra, 1 mm Spermidin , 30 mm PEP, 1 mm DTT, 2% PEG-8000, 13,3 mm maltos, 1 U T7 RNA-polymeras och 50 nm plasmid-DNA i ultrarent vatten.
-
Fenol-kloroformrening av DNA-mallen
- Förbered sex övernattnings kulturer med 5 mL LB-medium och 5 μL sterilt filtrerat (0,22 μm-filter) carbenicillin-lösning (100 mg/mL i 50% EtOH och 50% ultrarent vatten).
- Tillsätt en liten strimma från ett förtillverkat bakterie bestånd innehållande DH5α E. coli med pET20b (+) uttrycks vektorn till varje förvärmd 5 ml över natten kultur och inkubera vid 37 ° c för 16 h med 250 RPM. Beroende på vilken peptid (EF) eller protein (YPet eller mVenus) ska uttryckas, en specifik kodning plasmid används.
- Extrahera Plasmid med en mini-prep kit som beskrivs i bruksanvisningen eller genom att följa det protokoll som tillhandahålls av Zhang et al.24.
- Bered 100 μL av det förrenade plasmid-DNA (koncentrationen kan variera mellan 200 och 600 ng/μL) och blanda med 100 μL Roti-fenol/kloroform/isoamylalkohol (pH = 7,5 – 8,0) i ett microcentrifugerör för att möjliggöra bättre fasseparation.
- Vänd försiktigt röret upp till 6x och Centrifugera i 5 min vid 16 000 x g vid RT.
- Tillsätt 200 μL kloroform till den övre fasen av röret och vänd på röret upp till 6x.
- Centrifugera provet på 16 000 x g i 5 minuter vid RT.
- Pipet supernatanten till ett separat rör och tillsätt 10 μL av 3 M natriumacetat för etanol nederbörd.
- Tillsätt 1 mL-80 ° c kall etanol och förvara provet vid-80 ° c i 1 h.
- Centrifugera provet på 16 000 x g i 15 min vid 4 ° c.
- Dekanera supernatanten och tillsätt 1 mL-20 ° c kallt 70% (v/v) etanol.
- Centrifugera vid 16 000 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Ta bort vätskan genom att Pipettera. Var noga med att inte störa DNA-pelleten.
- Förvara provet vid RT i ca 15 min för att avdunta resterande etanol.
- Tillsätt ultrarent vatten till provet för att justera prov koncentrationen till ca 300 nm, vilket mäts genom absorption vid 260 Nm.
-
Beredning av TX-TL-reaktionen
- Tina det beredda råa cell extraktet och reaktionsbufferten på is.
- För en 60 μL reaktionsblandning, tillsätt plasmid-DNA (fenol-kloroform renat) till 37,5 μL av reaktionsbufferten [50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM coenzym A, 0,33 mM NAD , 0,75 mM läger, 68 mM folinsyra, 1 mM Spermidin, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, och 13,3 mM maltos), följt av tillsats av 28,7 μL av rå cell extrakt. Fyll till en slutlig volym med ultrarent vatten till 58,8 μl.
- Precis innan reaktionen börjar, tillsätt 1,2 μl av T7 RNA-polymeras-lösningen och blanda provet genom att Pipettera upp och ner.
- Använd denna reaktionsblandning som en svällnings lösning i steg 2,7 och inkubera vid 29 ° c under experimentets varaktighet, vilket normalt är 4 – 8 timmar.
5. konjugering av elastin-liknande polypeptider med Fluorophores via kopparkatalyserad azid-alkyne Huisgen cykloaddition
- Bered en 20 mM NHS-azid-länkare (γ-azidobutyric Acid N-hydroxysuccinimide ester) lösning i DMSO.
- Blanda 250 μL av ELP-lösningen (600 μM) med PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L na2HPO4, 0,27 g/l K2hpo4, pH = 7,2) och NHS-azid (1,2 mm) och inkubera i 12 timmar vid RT.
- Fyll på provet i en 10 kDa dialys kassett och förvara den vid 4 ° c i 12 timmar i 1 liter ultrarent vatten för att avlägsna salter och kvarvarande NHS-azid.
- Blanda den aktiverade ELP (500 μM) med alkyne-konjugerat färgämne (500 μM), Cy5-alkyne, eller Cy3-alkyne.
- Blanda detta prov med 1 mM TBTA (tris (benzyltriazolylmetyl) Amin), 10 mM TCEP (tris (2-karboxyethyl)-fosfinhydroklorid) och 10 mM CuSO4 och inkubera vid 4 ° c i 12 timmar.
- Fyll på provet i en 10 kDa dialys kassett och förvara den vid 4 ° c i 12 timmar i 1 liter ultrarent vatten, för att avlägsna salter och kvarvarande alkylkonjugerade färgämnen.
- Dessa Dye-modifierade ELPs används i en 1:1 blandning av Cy3 märkta ELPs och Cy5 märkta ELPs analogt med peptider i del två.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vesikelproduktion
Bild 1 visar transmissionselektronmikroskopi (TEM)-bilder av blåsor som bereds med olika svällningslösningar och glaspärlor metoden (se även Vogele et al.11). För provet i figur 1aanvändes endast PBS som svällningslösning för att bevisa bildandet av blåsor och för att bestämma deras storlek. När TX-TL användes som svällningslösning (figur 1b), bildade vesiklarna också. Mätningar av dynamisk ljusspridning (DLS) utfördes för att visa att glaspärlor metoden påverkar vesikelbildningen. Figur 2 visar de uppmätta intensiteten autokorrelations kurvor för ett EF-prov berett utan glaspärlor i PBS (blått) och ett EF-prov berett med glaspärlor metoden med PBS som svällningslösning (röd). Storlekarna beräknades från en ackumulant Fit25 och resulterade i en diameter på 134 nm med en polydispersitet på 25% när vesiklarna var beredda utan glaspärlor metoden. När glaspärlor användes, resulterade cumulant Fit i en diameter på 168 nm med en polydispersitet på 21%.
I vesikulobullösa transkription elva
Figur 3 visar fluorescensintensitetsprofilen över tid för transkription av dbroccolin aptamer inuti EF vesiklarna (grön). Som en negativ kontroll, DNase jag lades till svullnad lösningen och därmed också införlivas under vesikelbildning (blå). Mätningarna utfördes i fluorescens-Plattläsare med excitation vid 480 nm och emission vid 520 Nm.
I vesikulobullösa proteinuttryck elva
Figur 4 visar fluorescensintensiteten hos två fluorescerande proteiner som uttrycks inuti ELP-vesiklarna med hjälp av en fluorescens-Plattläsare. Excitation utfördes 500 Nm och emission vid 520 Nm. Transkription-översättning av mVenus (figur 4a) utfördes för att undersöka uttryckets dynamik och uttrycksnivå hos proteiner i ELP-vesikeln. Det är viktigt att notera att efter vesikelbildning är innehållet i vesiklarna och den yttre lösningen desamma. Därför, att undertrycka proteinuttryck utanför vesikeln, antibiotikum kanamycin lades till den yttre lösningen. Som en kontroll, kanamycin lades också till svullnad lösning, i vilket fall proteinuttryck insidan av vesikeln dämpades. Detta indikerar ytterligare att den lilla molekylen kanamycin stannar inne i vesikeln och föreslår att membranet inte är permeabel för denna molekyl över tidsskalan av dessa experiment. Om kanamycin sprids genom membranet skulle mVenus-uttrycket inte ha undertryckt och vid 5 timmar skulle fluorescensen vara högre. I det andra experimentet utfördes uttrycket av YPet (figur 4b). Båda proteinerna valdes eftersom de uppvisar en snabbare mogning tid än, till exempel, GFP. Dessutom användes T7 promotorn för mVenus transkription och en konstitutiv promotor som används för YPet transkription för att visa att både inducerbara och kontinuerliga uttryck är möjliga.
FRET analys elva
Figur 5a visar resultaten av bandet analysen utförs för att demonstrera ELP inkorporering i membranet. Därför var vesiklarna produceras med hjälp av en blandning av två lika koncentrerade fluorophore-peptid konstruktioner. Dessa var Cy3-EF (givare) och Cy5-EF (acceptor). Vid tiden t = 0, var start bandet nivå mätt. Signalerna från givaren och bandet signalen beror på det genomsnittliga avståndet mellan färgerna i membranet. Vid uttryck av membranet ELPs, ytterligare peptider införliva i membranet, vilket ökar den genomsnittliga avståndet mellan bandet par. Den senare mättes genom ökningen av givaren fluorescens och en minskning av bandet signalen vid tiden t = 2,5 h. Figur 5b visar den negativa kontrollen. Här, kanamycin lades till svullnad lösningen före vesikelbildning. Kanamycin dämpar protein uttrycket; Därför var ingen förändring i FRET synlig. Det är viktigt att notera att denna analys visar endast EF inkorporering.
Figur 1: Representativa tem-bilder. A) EF vesikler som bildas i svällningslösningen PBS. B) EF vesikler som bildas i svällningslösningen TX-TL. Skalstreck = 200 nm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa DLS-data. Intensitet autokorrelations kurvor mätt med DLS. Den blå kurvan skildrar EF peptider i PBS beredd utan glaspärlor metoden. Den röda kurvan skildrar en EF-lösning som produceras med glaspärlor metoden och PBS som svullnad lösning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Dbroccoli transkription. Representativa data för transkription av Dbroccolin aptamer inuti EF vesicles. Den gröna kurvan skildrar fluorescenssignalen och den blå kurvan kontroll mätningen med inkapslad DNase I. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: protein uttryck inuti peptidvesikler. A) en Plasmid-kodning av mvenus och uttrycks blandningen TX-TL kapslades in i ELP-vesiklarna. Efter ca 5 h, fluorescens mättad. När antibiotikum kanamycin inkapslades också, observerades ingen fluorescens. Bliknande resultat erhölls vid inkapsling av en ypet-plasmid. Felstaplar representerar standardavvikelsen för uppmätta värden vid den angivna tiden under en tidsram på 15 min. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: FRET analys. A) startfluorescensnivåer vid tiden t = 0 för givar emission och FRET signal (acceptor emission). Vid t = 2,5 h, givaren visade ökade utsläpp, och bandet signalen minskade. (B) när endast HYDROFILA ELP uttrycks inuti vesiklarna, bandet signal och givare utsläpp stannade konstant. Felstaplar representerar standardavvikelsen för uppmätta värden vid den angivna tiden under en tidsram på 15 min. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil: Innehåller alla plasmid-sekvenser resp. gensekvenser. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Film rehydrering är ett vanligt förfarande för skapandet av små små blåsor. Den huvudsakliga källan till misslyckande är felhantering av de material som används i förfarandet.
Inledningsvis, den ELPs produceras av E. coli celler. Avkastningen efter ELP rening kan variera avsevärt beroende på hur noggrant protokollet genomförs under dess avgörande steg. Dessa är den inversa temperatur cykling (ITC) steg och resuspension av ELPs efter nederbörd. För rening, vi utlöste hydrofoba kollaps av peptiden genom tillsats av fosforsyra, som förändrar pH till sura och leder till protonering av glutaminsyra sidokedjor i hydrofila blocket. Efter detta steg är båda blocken hydrofoba vid RT. Det är bättre att använda en syra vars salt är redan i lösningen för att hålla jonisk styrka konstant, men andra syror såsom saltsyra kan användas, samt. För att öka avkastningen av ELP produktion, ytterligare salter kan tillsättas för att förbättra coacervation processen, eftersom salt minskar övergången temperatur Tt och gör ELP mer hydrofoba. Vanligtvis används natriumklorid, men kosmotropiska salter som natriumsulfat är mycket bättre, medan salt koncentrationen kan vara nära sin lösnings gräns. Ytterligare uppvärmning med hjälp av ett vattenbad kan öka avkastningen ännu mer.
En annan kritisk steg är redissolution av ELP pellets. För maximal löslighet i ELP, bör lösningen vara förkyld, och en snabb pH-justering kan bidra till att lösa upp pelleten snabbare. PH-värdet kan behöva justeras under denna process flera gånger. För ytterligare förbättring kan provet förvaras i kylskåpet vid 4 ° c och skaka av provet bör undvikas. För att utbyta salter bör det beskrivna dialys steget i slutet av renings protokollet föredras. I princip kan ITC användas för att separera peptiderna från den salthaltiga supernatanten. Men beroende på den tidigare salt koncentrationen, restsalt kan fortfarande hittas i denna pellet. Dessutom kan dialys användas för att koncentrera de peptider som behövs för experimenten utan förluster som tidigare nämnts.
Nästa avgörande steg är avdunstning av kloroform/metanol blandningen. Under avdunstning vid reducerat tryck kan en försening i kokningen orsaka stänk eller turbulenser, vilket kan resultera i stor förlust av glaspärlor. Detta kan förhindras med hjälp av antingen filter eller vävnader. Samma problem uppstår när exsickatorn används, men aluminiumfolie vid öppnandet av den runda botten kolven kan användas för att förhindra detta. För hantering av ELP-belagda glaspärlor, det rekommenderas att använda disponibel antistatisk mikro-spatel, vilket också minskar förlusterna och förenklar förfarandet.
Svullnaden av vesiklarna med hjälp av olika svällningslösningar såsom PBS och transkription mix är enkel och mindre felbenägna. För TX-TL-systemet kan dock variationer från batch-till-sats på upp till 10% förekomma. För att minimera detta problem, bör alla experiment utföras med ett parti av cellfritt extrakt endast, som kan användas för upp till 3 000 reaktioner. Efter rehydrering är vesikelhalten och den yttre lösningen den svullna lösningen. En rening av utomhuslösningen bör inte utföras, eftersom detta kan förändra den osmotiska tryckskillnaden mellan vesikel inuti och utanför. Resultatet skulle bli en okontrollerad storleksändring eller till och med sprängning av vesiklarna. Därför bör möjliga reaktioner på utsidan endast dämpas. Beroende på reaktionen, detta kan göras, till exempel, genom tillsats DNase I att smälta nuvarande DNA eller genom att lägga till antibiotika såsom kanamycin, som hämmar översättningen.
Film rehydrering från glaspärlor har flera fördelar jämfört med andra beredningsmetoder. I motsats till lösningsmedels injektion, är Emulsionsfas överföring eller mikrofluidik förskjutning av lösningsmedel inte krävs, eftersom det initiala lösningsmedlet är helt avdunsta, och Peptiderna är rehydrerade i vattenlösning. Därför är glaspärlor metoden särskilt lämplig för känsliga prover såsom TX-TL, som kan påverkas avsevärt eller till och med förstöras av kvarvarande organiska lösningsmedel som används i andra metoder. Dessutom är protokollet enkelt, mindre felbenägna, och kan lätt skalas upp. På grund av den stora ytan till volymförhållandet endast små mängder av glaspärlor behövs och möjliggöra en hög grad av parallellitet med högt genomströmning.
Som huvud nackdel är metoden med glaspärlor endast användbar för skapandet av små små blåsor, som inte kan observeras via fluorescensmikroskopi. Den beskrivna metoden är något begränsad när mikroskopisk observation av dynamiken i enstaka blåsor önskas, vilket ibland är nödvändigt (t. ex. när man observerar potentiella vesikler Division processer). Dessutom, den lilla storleken på stadsjeepar begränsar inkapsling av lågkoncentrerade komponenter såsom peptid-kodning plasmid, vilket förklarar det relativt låga uttrycket av peptiderna. Den underliggande inkapslingsprocessen är en Poissonprocess, och därför måste koncentrationen av en viss komponent vara minst 150 nM för att garantera en inkapslingsannolikhet på 95%. Därför är det ganska anmärkningsvärt att det är möjligt att iaktta en så stor ökning av vesikelstorlek i dessa experiment.
Det protokoll som presenteras här kommer att göra det möjligt för forskare att skapa peptid-baserade blåsor från elastin-liknande polypeptider. Det öppnar också möjligheter att producera konstgjorda cell-liknande strukturer inkapslade av peptid membran, som representerar attraktiva alternativ till klassiska fack tillverkade av fettsyror eller fosfolipider. Peptider är fördelaktiga eftersom de lätt kan uttryckas i en cellfri miljö (till exempel i TX-TL-systemet som används här), vilket möjliggör koppling av membran tillväxt direkt till en transkription-översättningsprocess inne i vesikeln. Dessutom kan ELPs utformas och anpassas till specifika fysikalisk-kemiska parametrar såsom kontur längd, hydrofobicitet/hydrofilicitet av den använda DeBlock, och känslighet för stimuli som pH eller jonisk styrka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt finansiellt stöd genom DFG TRR 235 (livets uppkomst, Project p15), Europeiska forskningsrådet (Grant Agreement nr 694410 AEDNA), och TUM internationella forskarskolan för vetenskap och teknik IGSSE (projekt nr 9,05) . Vi tackar E. Falgenhauer för hennes hjälp med provberedning. Vi tackar A. Dupin och M. Schwarz-Schilling för deras hjälp med TX-TL-systemet och nyttiga diskussioner. Vi tackar N. B. Holland för nyttiga diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| Chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| Phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
References
- Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
- Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
- Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).
- Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
- Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
- Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
- Chu, H. -S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
- Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
- Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
- Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
