Summary
Presentert her er protokoller for etablering av peptid-baserte små unilamellære blemmer i stand til vekst. For å lette i vesiculo produksjon av membranen peptid, disse blemmer er utstyrt med en transkripsjon-oversettelse system og peptid-koding plasmider.
Abstract
Compartmentalization av biokjemiske reaksjoner er et sentralt aspekt av syntetiske celler. For dette formålet, peptid-baserte reaksjons rom fungerer som et attraktivt alternativ til liposomer eller fatty acid-baserte blemmer. Eksternt eller innenfor blemmer, kan peptider enkelt uttrykkes og forenkle syntesen av membran forløpere. Forutsatt her er en protokoll for etablering av blemmer med diametere på ~ 200 nm basert på amfifile elastin-lignende polypeptider (ELP) utnytte dehydrering-rehydrering fra glassperler. Også presentert er protokoller for bakteriell ELP uttrykk og rensing via inverse temperatur sykling, samt deres kovalente funksjonalisering med fluorescerende fargestoffer. Videre beskriver denne rapporten en protokoll for å muliggjøre transkripsjon av RNA aptamer dBroccoli innsiden ELP blemmer som et mindre komplekst eksempel for en biokjemiske reaksjon. Til slutt, en protokoll er gitt, som tillater i vesiculo uttrykk for fluorescerende proteiner og membranen peptid, mens syntese av sistnevnte resulterer i vesicle vekst.
Introduction
Opprettelsen av syntetiske levende cellulære systemer er vanligvis nærmet seg fra to forskjellige retninger. I top-down metoden, er det Genova av en bakterie redusert til sine essensielle komponenter, til slutt fører til en minimal celle. I nedenfra og opp tilnærming, er kunstige celler montert de Novo fra molekylære komponenter eller cellulære delsystemer, som må være funksjonelt integrert i en konsistent celle-lignende system.
I de Novo tilnærming, compartmentalization av de nødvendige biokjemiske komponentene er vanligvis oppnås ved hjelp av membraner laget av fosfolipider eller fettsyrer1,2,3,4. Dette er fordi "moderne" cellemembraner hovedsakelig består av fosfolipider, mens fettsyrer anses sannsynlig kandidater av prebiotiske membran vedlegg5,6. For dannelsen av nye membraner eller for å lette membran vekst, amfifile byggesteinene må gis fra utsiden7 eller ideelt gjennom produksjon i en membranous kupé med tilsvarende anabole prosesser4 ,8.
Mens lipid syntese er en relativt komplisert metabolske prosessen, kan peptider produseres ganske lett ved hjelp av Cell-Free genuttrykk reaksjoner9,10. Derav, peptid membraner dannet av amfifile peptider representerer et interessant alternativ til lipid membraner som kabinetter for kunstig celle etterligner som er i stand til å vokse11.
Amfifile elastin-lignende di-Block kopolymerer (ELPs) er en attraktiv klasse av peptider, som kan tjene som byggekloss for slike membraner12. Den grunnleggende aminosyren sekvens motiv av ELPs er (GaGVP)n, der "a" kan være noen aminosyre unntatt proline og "n" er antall motiv gjentar13,14, 15,16,17 . ELPs har blitt opprettet med en hydrofobe blokk som inneholder hovedsakelig fenylalanin for en og en hydrofile blokk hovedsakelig sammensatt av Glutaminsyre acid11. Avhengig av en og løsnings parametere, for eksempel pH-og saltkonsentrasjon, viser ELPs en såkalt invers temperatur overgang ved temperatur Tt, der peptider gjennomgår en fullstendig reversibel faseovergang fra en hydrofile til hydrofobe Staten. Syntesen av peptider kan enkelt implementeres inne blemmer ved hjelp av "TX-TL" bakteriell Cell Extract11,18, 19,20,21, som gir alle nødvendige komponenter for kombinert transkripsjon og oversettelse reaksjoner.
TX-TL-systemet ble innkapslet sammen, med DNA-mal kodingen ELPs i ELP blemmer utnytte dehydrering-rehydrering fra glassperler som en solid støtte. Dannelsen av blemmer oppstår gjennom rehydrering av tørkede peptider fra perle overflaten11. Andre metoder22 for vesicle formasjon kan brukes, som potensielt viser lavere polydispersitet og større vesicle størrelser (for eksempel elektro-formasjon, emulsjon faseoverføring, eller materialer-baserte metoder). For å teste levedyktigheten til innkapsling metoden, transkripsjon av fluorogenic aptamer dBroccoli23 kan alternativt brukes11, som er mindre komplisert enn genuttrykk med TX-TL-systemet.
På grunn av uttrykket av membranen byggesteinene i vesiculo og deres påfølgende innlemmelse i membranen, begynner blemmer å vokse11. Membran innlemmelse av ELPs kan påvises gjennom et bånd analysen. For dette formål, ELPs brukes til dannelsen av den opprinnelige vesicle befolkningen blir bøyd med fluorescerende fargestoffer i like deler utgjør et bånd par. Ved uttrykk for ikke-merket ELPs i vesiculo og deres innlemmelse i membranen, er merket ELPs i membranen fortynnet og følgelig bånd signalet synker11. Som en allsidig og vanlig metode for Bøyning, brukes kobber katalysert Natriumazid-alkyne sykloaddisjonsreaksjoner. Med bruk av en stabiliserende ligand som Tris (benzyltriazolylmethyl)-Amin, kan reaksjonen utføres i en vandig løsning på en fysiologisk pH uten hydrolyse av reaktantene11, som er hensiktsmessig for Bøyning reaksjoner som involverer peptider.
Følgende protokoll presenterer en detaljert beskrivelse av forberedelsene til voksende ELP-baserte peptidosomes. Uttrykket av peptider og vesicle formasjon ved hjelp av glassperler metoden er beskrevet. Videre er det beskrevet hvordan du implementerer transkripsjon av fluorogenic dBroccoli aptamer og transkripsjon-oversettelse reaksjon for protein uttrykk inne i ELP blemmer. Til slutt, forutsatt er en prosedyre for Bøyning av ELPs med fluorophores, som kan brukes til å bevise vesicle vekst gjennom et bånd analysen11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. uttrykk for elastin-lignende Polypeptider
- Dag 1: utarbeidelse av en for rett kultur og forsyninger for peptid uttrykk
- Forbered og autoklav uttrykk kultur flasker (4 x 2,5 L) og 3 L av LB medium. For 1 L av LB medium, tilsett 25 g LB pulver til 1 L av ultrarent vann.
- Forbered en startkultur med 100 mL LB medium, 50 μL av steril-filtrert (0,22 μm filter) kloramfenikol oppløsning (25 mg/mL i EtOH), og 50 μL av steril-filtrert (0,22 μm filter) carbenicillin oppløsning (100 mg/mL i 50% EtOH og 50% ultrarent vann).
- Legg til en liten strek fra en pre-laget bakteriell lager inneholder E. coli stamme BL21 (DE3) PLysS med pET20b (+) uttrykk vektor koding av POLYPEPTID sekvensen MGHGVGVP ((GEGVP)4(GVGVP))4((GFGVP)4(GVGVP))3 (GFGVP)4GWP (forkortet til EF) til en pre-varmet 100 ml starter kultur og ruge ved 37 ° c i 16 timer med 250 RPM i en risting inkubator (E. coli stammer og vektorer er tilgjengelig på forespørsel).
- Pre-Warm uttrykket kultur kanner og LB Media på 37 ° c over natten slik at de er forberedt på neste dag.
- Dag 2: protein uttrykk
- Tilsett 750 mL LB medium til hvert uttrykk kultur kolbe, 375 μL av steril-filtrert (0,22 μm filter) kloramfenikol lager (25 mg/mL i EtOH), og 375 μL av steril-filtrert (0,22 μm filter) carbenicillin lager (100 mg/mL i 50% EtOH og 50% ultrarent vann).
- Etter omrøring for å distribuere antibiotika, ta 2 mL av Media som en referanse prøve for den optiske tettheten måling ved 600 NM (OD600).
- Tilsett 7,5 mL av Start kulturen til uttrykket kolbe og ruge for 1 time ved 37 ° c med 250 RPM.
- Etter dette trinnet vil OD600 av hver kolbe kontrolleres hver 20 min.
- Når den optiske tettheten når ca. 0,8, reduserer du temperaturen til 16 ° c og induserer peptid uttrykk ved å tilsette 750 μL av 1 M steril-filtrert β-isopropylalkohol thiogalactoside (IPTH) i ultrarent vann i hver uttrykks kolbe.
- Ruge uttrykket kolbe med indusert bakterier ved 16 ° c for 16 t med 250 RPM.
- Dag 3: ekstraksjon av den uttrykte polypeptid
- Pre-veie sentrifugering kolbe for å muliggjøre bestemmelse av massen av cellen pellet etter høsting.
- Høste alle bakteriene fra uttrykket flasker av sentrifugering i 20 min ved hjelp av en pre-avkjølt sentrifuge ved 4 000 x g og 4 ° c.
- Hell ut supernatanten og tørk av sentrifuge flaskene på et sterilt papir håndkle.
- Veie sentrifugering flasker og beregne cellen pellet massen.
- Resuspend cellene, som er pelleted ned fra 750 mL av original cellekultur, i 15 mL fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7,4) ved pipettering, og sentrifuge ved 4 000 x g i 20 min ved 4 ° c. Hell ut supernatanten og tørk av sentrifuge flaskene på et sterilt papir håndkle.
- Resuspend celle pellet for lyse Rings trinnet i 2 mL buffer per 1 gram celle pellets bruker PBS (pH 7,4) supplert med lysozyme (1 mg/mL), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF), 1 mM benzamidine, og 0,5 U av DNase I.
- Sonikere cellene for ytterligere lyse på isen med en sonicator på 8 W i 9 min med vekslende 10 s sonikering og 20 s pause trinn, etterfulgt av en 9 min pause der prøven skal kjøles på isen. Gjenta 9 min sonikering trinn en gang til.
- Tilsett 2 mL 10% (w/v) polyethyleneimine (PEI) per 1 L av original cellekultur for nukleinsyre yre nedbør.
- Fordel prøven i 2 mL sentrifugerør og ruge ved 60 ° c i 10 min, etterfulgt av en inkubasjons i 10 min ved 4 ° c.
- Sentrifuger oppløsningen ved 16 000 x g i 10 min ved 4 ° c og samle inn supernatanten som inneholder ELP.
- Protein rensing via inverse temperatur sykling:
- Juster supernatanten til en pH på 2 for å bytte den hydrofile delen av peptid til hydrofobe og indusere aggregering. For å justere pH, fosfors syre og natriumhydroksid brukes. pH-striper er tilstrekkelige til å bestemme pH-nivået.
- For å øke utbyttet av rensing prøven, varme prøven til 60 ° c og tilsett natriumklorid opp til 2 M.
- Deretter sentrifuger prøven ved 16 000 x g i 10 min ved romtemperatur (RT).
- Kast supernatanten og re-oppløse pellet i PBS (men bare halvparten av det opprinnelige volumet brukes i forhold til forrige trinn).
- Juster pH til 7 med fosfors syre og natriumhydroksid. pH-striper er tilstrekkelig nøyaktige til å bestemme pH.
- Sentrifuger prøven senere ved 16 000 x g i 10 min ved 4 ° c.
- Samle supernatanten og gjenta trinn 1.4.1-1.4.6 opptil 3x totalt, bortsett fra at i den siste repetisjon av trinn 1.4.4, bare vann er lagt i stedet for PBS.
- Mål konsentrasjonen av peptider med en absorpsjon spektrometer. Bruk en utryddelse koeffisient på 5500/M/cm ved 280 NM.
- Juster konsentrasjonen av ELP til 700 μM.
2. vesicle produksjon bruke glass perler metode
- Konsentrer ELP løsningen til 1,1 mM ved hjelp av en sentrifugal vakuum konsentrat.
- Bland 200 μL av den konsentrerte ELP-oppløsningen med 1 250 μL av en 2:1 kloroform/metanol-blanding etterfulgt av virvlingen.
- Tilsett 1,5 g av sfæriske glassperler (212-300 μm i størrelse) til en 10 mL rund bunn kolbe.
- Legg løsningen som inneholder ELP og kloroform/metanol blandingen til den runde bunnen kolbe og bland ved mild risting.
- Koble flasken til en roterende fordamper. Juster hastigheten til 150 RPM og regulere trykket til-0,2 x 105 PA (-200 mbar) i ca. 4 minutter til væsken er fordampet ved romtemperatur.
- Plasser den runde bunnen kolbe i en desikator i minst 1 time for å sikre at resterende kloroform og metanol er fordampet. For å unngå tap av glassperler, løst festet aluminiumsfolie bør pakkes rundt den runde bunnen kolbe åpning.
- For et enkelt eksperiment, bland 100 mg av peptid dekket glassperler med 60 μL av hevelse løsning, for eksempel PBS. Ruge denne prøven ved 25 ° c i 5 min.
- Sentrifuger prøven raskt med et bord-topp sentrifuger til sediment glasset perler.
- Bruk en pipette for å samle inn supernatanten som inneholder blemmer.
3. transkripsjon av RNA Aptamer dBroccoli Inside den blemmer
- Rengjør laboratoriebenken med kluter som inneholder RNase rense løsning for å skape et RNase fritt arbeidsmiljø.
- Bland ssDNA (5 μM) bestående av T7-Promotor og dBroccoli-sekvensen (GAGACGGTCGGGTCCATCTGAGACGGTCGGGTCCAGATATTCGTATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCAGATGTCGAGTAGAGTGTGGGCTC), i tillegg til Noncoding strand (5 μM) i nuklease vann supplert med RNAPol reaksjonsbuffer [40 mM Tris-HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mm DITHIOTREITOL (DTT), og 2 mm spermidin], for å forberede DNA malen for transkripsjon reaksjon.
- Ruge løsningen ved 90 ° c i 5 min, etterfulgt av en langsom Temperaturreduksjon til 20 ° c i 30 min.
- Forbered en 1 mM (5Z)-5-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2, 3-dimethyl-3, 5-dihydro-4H-imidazol-4-One (DFHBI) løsning ved oppløsning 1,26 mg DFHBI i 5 mL av DMSO.
- Forbered transkripsjon reaksjonen ved å blande RNAPol reaksjonsbuffer [40 mM Tris-HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mm DITHIOTREITOL (DTT), og 2 mm spermidin] med 125 mm KCl, 15 mm MgCl2, 4 mm RNTP, 10 ΜM DFHBI, 200 nM DNA mal, 0,5 U/μL RNase hemmer murine og vann.
- Rett før reaksjonen starter, tilsett 4 U/μL T7 polymerase.
- Bruk denne reaksjonsblandingen som hevelse løsning i trinn 2,7 og ruge ved 37 ° c for varigheten av eksperimentet, som vanligvis er 1 t.
4. transkripsjon-oversettelse (TX-TL) reaksjon
Merk: For transkripsjon-oversettelse reaksjon, er et grovt celle ekstrakt som kreves, samt reaksjonsbuffer og DNA. Den råolje celle ekstrakt er utarbeidet som beskrevet i Sun et al.18. For en TX-TL-reaksjon, bruk følgende: 33% (v/v) av råoljen E. coli extract, 42% (v/v) reaksjonsbuffer, og 25% (v/v) fenol-KLOROFORM renset DNA pluss tilsetningsstoffer. De endelige konsentrasjonene er omtrent 9 mg/mL protein, 50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM koenzym A, 0,33 mM NAD, 0,75 mM leir, 68 mM folinsyretilskudd yre, 1 mM spermidin , 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, 13,3 mM maltose, 1 U fra T7 RNA-polymerase, og 50 nM plasmider DNA i ultrarent vann.
-
Fenol-kloroform rensing av DNA-malen
- Forbered seks over natten kulturer med 5 mL LB medium og 5 μL av steril-filtrert (0,22 μm filter) carbenicillin løsning (100 mg/mL i 50% EtOH og 50% ultrarent vann).
- Legg til en liten strek fra en pre-laget bakteriell lager inneholder DH5α E. coli med pET20b (+) uttrykket vektor til hver forvarmet 5 ml over natten kultur og ruge ved 37 ° c for 16 timer med 250 RPM. Avhengig av hvilken peptid (EF) eller protein (YPet eller mVenus) skal uttrykkes, brukes en bestemt kodings plasmider.
- Pakk ut plasmider med et mini prep-sett som beskrevet i bruksanvisningen eller ved å følge protokollen fra Zhang et al.24.
- Forbered 100 μL av pre-renset plasmider DNA (konsentrasjon kan variere fra 200 – 600 ng/μL) og bland med 100 μL av Roti-fenol/kloroform/isoamylacetat Alcohol (pH = 7.5 – 8.0) i et mikrosentrifugen rør for å muliggjøre bedre fase separasjon.
- Vend røret forsiktig opp til 6 ganger og sentrifuge i 5 minutter ved 16 000 x g ved RT.
- Tilsett 200 μL av kloroform i den øvre fasen av røret og Vend slangen opp til 6 ganger.
- Sentrifuger prøven ved 16 000 x g i 5 min ved RT.
- Pipet supernatanten til et eget rør og tilsett 10 μL av 3 M natrium acetate for etanol nedbør.
- Tilsett 1 mL-80 ° c kaldt etanol og oppbevar prøven ved-80 ° c i 1 time.
- Sentrifuger prøven ved 16 000 x g i 15 min ved 4 ° c.
- Dekanter supernatanten og tilsett 1 mL av-20 ° c kaldt 70% (v/v) etanol.
- Sentrifuger ved 16 000 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Fjern væsken ved pipettering. Vær forsiktig med å ikke forstyrre DNA pellet.
- Oppbevar prøven på RT i ca. 15 minutter for å fordampe resten av etanol.
- Legg ultrarent vann til prøven for å justere prøve konsentrasjonen til ca. 300 nM, som måles ved absorpsjon ved 260 nM.
-
Utarbeidelse av TX-TL-reaksjonen
- Tin forberedt råolje celle ekstrakt og reaksjonsbuffer på isen.
- For en 60 μL reaksjons miks, tilsett plasmider DNA (fenol-kloroform renset) til 37,5 μL av reaksjons bufferen [50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM koenzym A, 0,33 mM NAD , 0,75 mM cAMP, 68 mM folinsyretilskudd yre, 1 mM spermidin, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, og 13,3 mM maltose), etterfulgt av en tilsetning av 28,7 μL av råolje celle ekstrakt. Fyll på et endelig volum med ultrarent vann til 58,8 μL.
- Rett før reaksjonen starter, tilsett 1,2 μL av T7 RNA polymerase-løsningen og bland prøven ved å pipettering opp og ned.
- Bruk denne reaksjonsblandingen som en hevelse løsning i trinn 2,7 og ruge ved 29 ° c i løpet av eksperimentet, som vanligvis er 4 – 8 timer.
5. Bøyning av elastin-lignende Polypeptider med Fluorophores via kobber katalysert Natriumazid-alkyne Huisgen sykloaddisjonsreaksjoner
- Forbered en 20 mM NHS-Natriumazid linker (γ-azidobutyric acid N-hydroxysuccinimide Ester) løsning i DMSO.
- Bland 250 μL av ELP-oppløsningen (600 μM) med PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L na2HPO4, 0,27 g/l K2HPO4, pH = 7,2) og NHS-Natriumazid (1,2 mm) og ruge for 12 h ved RT.
- Legg prøven i en 10 dialyse-kassett fra kDa og oppbevar den ved 4 ° c i 12 timer i 1 L ultrarent vann for å fjerne salter og gjenværende NHS-Natriumazid.
- Bland den aktiverte ELP (500 μM) med det alkyne fargestoffet (500 μM), Cy5-alkyne eller Cy3-alkyne.
- Bland dette eksempelet med 1 mM TBTA (Tris (benzyltriazolylmethyl) Amin), 10 mM TCEP (Tris (2-carboxyethyl)-fosfin hydrochloride) og 10 mM CuSO4 og ruge ved 4 ° c for 12 h.
- Legg prøven inn i en 10-liters dialyse kassett og oppbevar den ved 4 ° c i 12 timer i 1 L ultrarent vann, for å fjerne salter og rester alkyne fargestoffer.
- Disse Dye-modifisert ELPs brukes i en 1:1 blanding av Cy3 merket ELPs og Cy5 merket ELPs analoge til peptider i del to.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vesicle produksjon
Figur 1 viser overføring elektron MIKROSKOPI (TEM) bilder av blemmer tilberedt med ulike hevelse løsninger og glassperler metoden (også se Vogele et al.11). For prøven i figur 1a, bare PBS ble brukt som hevelse løsning for å bevise dannelsen av blemmer og å bestemme størrelsen. Når TX-TL ble brukt som hevelse løsning (figur 1B), den blemmer også dannet. Dynamisk lysspredning (DLS) målinger ble utført for å vise at glasset perler metoden har en effekt på vesicle formasjon. Figur 2 viser de målte intensitet autokorrelasjon kurvene i et EF-utvalg forberedt uten glassperler i PBS (blå) og et EF-utvalg tilberedt med glass perlene metoden med PBS som hevelse løsning (rød). Størrelsene ble beregnet fra en cumulant Fit25 og resulterte i en diameter på 134 NM med en polydispersitet på 25% når blemmer var forberedt uten glassperler metoden. Når glasset perler ble brukt, cumulant passer resulterte i en diameter på 168 NM med en polydispersitet på 21%.
I vesiculo transkripsjon 11 flere
Figur 3 viser profilen for fluorescens intensitet over tid for transkripsjon av dBroccoli aptamer inne i EF blemmer (grønn). Som en negativ kontroll, DNase jeg ble lagt til hevelse løsning og dermed også innarbeidet under vesicle dannelse (blå). Målingene ble utført i fluorescens plate leser med eksitasjon ved 480 NM og utslipp på 520 NM.
I vesiculo protein uttrykk 11 flere
Figur 4 viser fluorescens intensitet av to fluorescerende proteiner som ble uttrykt inne i ELP blemmer ved hjelp av en fluorescens plate leser. Eksitasjon ble gjennomført 500 NM og utslipp ved 520 NM. Transkripsjon-oversettelse av mVenus (figur 4a) ble utført for å undersøke uttrykket dynamikk og uttrykk nivå av PROTEINER i ELP vesicle. Det er viktig å merke seg at etter vesicle formasjon, er innholdet av blemmer og ytre løsning de samme. Derfor, for å undertrykke protein uttrykk utenfor vesicle, ble antibiotika kanamycin tilsatt til utvendig løsning. Som en kontroll ble kanamycin også tilsatt til hevelse løsningen, i så fall protein uttrykk i vesicle ble undertrykt. Dette indikerer videre at det lille molekylet kanamycin forblir inne i vesicle og antyder at membranen ikke er gjennomtrengelig for dette molekylet over tidsskalaen for disse eksperimentene. Hvis kanamycin diffust gjennom membranen, ville mVenus uttrykket ikke har blitt undertrykt og på 5 h, ville fluorescens være høyere. I det andre eksperimentet ble uttrykket for YPet (figur 4b) utført. Begge proteinene ble valgt fordi de viser en raskere modningstid enn for eksempel GFP. Videre T7 promoter ble brukt for mVenus transkripsjon og en konstituerende promoter brukes for YPet transkripsjon å vise at både induserbart og kontinuerlig uttrykk er mulig.
Bånd analysen 11 flere
Figur 5a viser resultatene av bånd analysen som er utført for å demonstrere ELP i membranen. Derfor ble blemmer produsert ved hjelp av en blanding av to like konsentrert fluoroforen-peptid konstruksjoner. Disse var Cy3-EF (donor) og Cy5-EF (Acceptor). På tid t = 0, start bånd nivået ble målt. Signalene av donor og bånd signalet avhenger av gjennomsnittlig avstand mellom fargestoffer i membranen. Ved uttrykk for membranen ELPs, ekstra peptider innlemme i membranen, noe som øker den gjennomsnittlige avstanden mellom bånd parene. Sistnevnte ble målt gjennom økningen i donor fluorescens og en reduksjon av bånd signalet på tid t = 2,5 h. figure 5B viser den negative kontrollen. Her ble kanamycin tilsatt til den hevelse løsning før vesicle formasjon. Kanamycin undertrykker protein uttrykk; derfor ingen endring i bånd var synlig. Det er viktig å merke seg at denne analysen bare viser EF-innlemmelse.
Figur 1: REPRESENTATIVE tem-bilder. (A) EF blemmer dannet i HEVELSE løsning PBS. (B) EF blemmer dannet i HEVELSE løsning TX-TL. Skala bars = 200 NM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: REPRESENTATIVE DLS-data. Intensitet autokorrelasjon kurver målt ved DLS. Den blå kurven skildrer EF peptider i PBS forberedt uten glassperler metoden. Den røde kurven viser en EF løsning produsert med glassperler metoden og PBS som hevelse løsning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: dBroccoli transkripsjon. Representative data for transkripsjon av dBroccoli aptamer innsiden EF blemmer. Den grønne kurven viser fluorescens signalet og den blå kurven kontroll målingen med innkapslet DNase I. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: protein uttrykk inne peptid blemmer. (A) en plasmider koding MVENUS og TX-TL uttrykket Mix var INNKAPSLET i ELP blemmer. Etter ca 5 h, fluorescens mettet. Når antibiotika kanamycin var innkapslet også, ingen fluorescens ble observert. (B) lignende resultater ble innhentet ved innkapsling av en YPet-plasmider. Feilfelt representerer standardavviket for de målte verdiene på det angitte tidspunktet i en tidsramme på 15 min. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: bånd analysen. (A) starter fluorescens nivåer på tid t = 0 for donor utslipp og bånd signal (Acceptor utslipp). Ved t = 2,5 h, viste giveren økt utslipp, og bånd signalet redusert. (B) når bare hydrofile ELP ble uttrykt inne i blemmer, ble bånd signal og donor utslipp oppholdt konstant. Feilfelt representerer standardavviket for de målte verdiene på det angitte tidspunktet i en tidsramme på 15 min. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil: Inneholder alle plasmider sekvenser. gen sekvenser. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Film rehydrering er en vanlig prosedyre for etablering av små unilamellære blemmer. Den viktigste kilden til svikt er feil håndtering av materialene som brukes i prosedyren.
I utgangspunktet er ELPs produsert av E. coli celler. Avkastningen etter at ELP rensing kan variere betydelig avhengig av hvor nøye protokollen er gjennomført i løpet av sin avgjørende trinn. Dette er den inverse temperatur sykling (ITC) trinn og blanding av ELPs etter nedbør. For rensing, utløste vi hydrofobe sammenbruddet av peptid gjennom tilsetning av fosfors syre, som endrer pH til surt og fører til protonation av Glutaminsyre syre side kjedene i hydrofile blokken. Etter dette trinnet, begge blokkene er hydrofobe på RT. Det er å foretrekke å bruke en syre som salt er allerede i løsningen for å holde ioniske styrke konstant, men andre syrer som saltsyre kan brukes, også. For å øke utbyttet av ELP produksjon, kan ytterligere salter tilsettes for å forbedre coacervation prosessen, fordi salt reduserer overgangen temperatur Tt og gjør ELP mer hydrofobe. Vanligvis brukes natriumklorid, men kosmotropic salter som natriumsulfat er langt bedre, mens salt konsentrasjonen kan være i nærheten av løsnings grensen. Ytterligere oppvarming ved hjelp av et vannbad kan øke avkastningen ytterligere.
Et annet kritisk trinn er redissolution av ELP pellet. Hvis du vil ha maksimal løselighet, bør oppløsningen være forhånds kjølt, og en rask pH-justering kan bidra til å oppløse pellet raskere. PH-verdien må kanskje justeres i løpet av denne prosessen flere ganger. For ytterligere forbedring, kan prøven lagres i kjøleskapet ved 4 ° c og risting av prøven bør unngås. Å utveksle salter, de beskrevne dialyse trinn på slutten av rensing protokollen bør foretrekkes. I prinsippet kan ITC brukes til å skille peptider fra salt-inneholdende supernatanten. Men avhengig av forrige saltkonsentrasjon, kan rester av salt fortsatt finnes i denne pellet. Videre kan dialyse brukes til å konsentrere peptider som trengs for eksperimentene uten tap som nevnt tidligere.
Det neste avgjørende skritt er fordampning av kloroform/metanol blanding. Under fordampning ved redusert trykk kan en forsinkelse i koking forårsake Splatters eller turbulenser, noe som kan føre til store tap av glassperler. Dette kan forebygges ved hjelp av enten filtre eller vev. Det samme problemet oppstår når desikator brukes, men aluminiumsfolie ved åpningen av den runde bunnen kolbe kan brukes til å forhindre dette. For håndtering av ELP-belagte glassperler, anbefales det å bruke en gangs antistatisk mikro-spatel, som også reduserer tap og forenkler prosedyren.
Den hevelse av blemmer ved hjelp av ulike hevelse løsninger som PBS og transkripsjon Mix er grei og mindre feil utsatt. For TX-TL-systemet kan imidlertid variasjoner fra satsvis til bunke på opptil 10% forekomme. Å minimere denne problem, alle eksperimenter burde være utført med ettall bakst av cellen-ledig ekstra bare, hvilke kan brukes for til 3 000 reaksjonene. Etter rehydrering, det vesicle innhold og ytre løsning er det hevelse løsning. En rensing av utsiden løsningen bør ikke utføres, fordi dette kan endre osmotisk trykkforskjellen mellom vesicle inne og ute. Resultatet vil være en ukontrollert endring i størrelse eller til og med sprengning av blemmer. Derfor bør mulige reaksjoner på utsiden bare undertrykkes. Avhengig av reaksjonen, kan dette gjøres, for eksempel ved tilsetning DNase jeg å fordøye presentere DNA eller ved å legge til antibiotika som kanamycin, som hemmer oversettelsen.
Film rehydrering fra glassperler har flere fordeler sammenlignet med andre Forberedelses metoder. I motsetning til løsemiddel injeksjon, er emulsjon faseoverføring eller materialer forskyvning av løsemiddel ikke nødvendig, siden det første løsemiddel er fullstendig fordampet, og peptider er rehydrert i vandig oppløsning. Derfor er glass perlene metoden spesielt egnet for følsomme prøver som TX-TL, som kan bli betydelig påvirket eller ødelagt av rester organiske løsemidler som brukes i andre metoder. Videre er protokollen grei, mindre feil utsatt, og i stand til å være lett skaleres opp. På grunn av den store overflate til volumforhold bare små mengder glassperler er nødvendig og tillate en høy grad av parallelisering med høy gjennomstrømning.
Som den viktigste ulempen, er glasset perler metoden bare nyttig for etablering av små unilamellære blemmer, som ikke kan observeres via fluorescens mikroskopi. Den beskrevne metoden er noe begrenset når mikroskopisk observasjon av dynamikken i enkelt blemmer er ønsket, som er noen ganger nødvendig (f. eks, når observere potensielle vesicle divisjon prosesser). Videre begrenser den lille størrelsen på SUV-er innkapsling av lav konsentrerte komponenter som peptid-koding plasmider, noe som forklarer det relativt lave uttrykket av peptider. Den underliggende innkapsling prosessen er en Poisson-prosess, og dermed konsentrasjonen av en bestemt komponent må være minst 150 nM for å garantere en innkapsling sannsynlighet på 95%. Derfor er det ganske bemerkelsesverdig at det er mulig å observere en så stor økning i vesicle størrelse i disse eksperimentene.
Protokollen som presenteres her vil gjøre det mulig for forskere å lage peptid-baserte blemmer fra elastin-lignende polypeptider. Det åpner også opp muligheter til å produsere kunstige celle-lignende strukturer innkapslet av peptid membraner, som representerer attraktive alternativer til klassiske rom laget av fettsyrer eller fosfolipider. Peptider er fordelaktig i at de lett kan uttrykkes i en celle-fritt miljø (for eksempel i TX-TL-systemet som brukes her), som tillater kopling av membran vekst direkte til en transkripsjon-Oversettelses prosess inne i vesicle. Videre kan ELPs utformes og justeres til spesifikke fysikalsk parametre som kontur lengde, hydrofobisiteten/hydrofiliteten av den brukte DeBlock, og følsomhet for stimuli som pH eller ioniske styrke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker takknemlig finansiell støtte gjennom DFG TRR 235 (fremveksten av Life, prosjekt P15), European Research Council (Grant avtalen nr. 694410 AEDNA), og TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (prosjekt nr. 9,05) . Vi takker E. Falgenhauer for hennes hjelp med prøven forberedelse. Vi takker A. Dupin og M. Schwarz-Schilling for deres hjelp med TX-TL-systemet og nyttige diskusjoner. Vi takker N. B. Holland for nyttige diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT | MP biomedicals | 3012-032 | |
| 3-PGA | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| 5PRIME Phase Lock GelTM tube | VWR | 733-2478 | |
| alkine-conjugated Cy3 | Sigma-Aldrich | 777331 | |
| alkine-conjugated Cy5 | Sigma-Aldrich | 777358 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Benzamidin | Carl Roth | CN38.2 | |
| BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Novagen | 71402 | |
| Bradford BSA Protein Assay Kit | Bio-rad | 500-0201 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Carbenicillin | Carl Roth | 6344.2 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Chloramphenicol | Carl Roth | 3886.3 | |
| Chloroform | Carl Roth | 4432.1 | |
| CoA | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| CTP | USB | 14121 | |
| CuSO4 | Carl Roth | P024.1 | |
| DFHBI | Lucerna Technologies | 410 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.1 | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.2 | |
| Folinic acid | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| Glass beads, acid-washed | Sigma-Aldrich | G1277 | |
| GTP | USB | 16800 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| IPTG (β-isopropyl thiogalactoside ) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149 | |
| LB Broth | Carl Roth | X968.2 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Methanol | Carl Roth | 82.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | KK36.3 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 732-6204 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester) | Baseclick | BCL-033-5 | |
| PEG-8000 | Carl Roth | 263.2 | |
| pH stripes | Carl Roth | 549.2 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Carl Roth | 6367.2 | |
| Phosphate-buffered saline | VWR | 76180-684 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Polyethyleneimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich | P8584 | |
| Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich | P8709 | |
| Qiagen Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| RNAPol reaction buffer | NEB | B9012 | |
| RNase inhibitor murine | NEB | M0314S | |
| RNaseZap Wipes | ThermoFisher | AM9788 | |
| rNTP | NEB | N0466S | |
| Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carlroth | A156.1 | |
| RTS Amino Acid Sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo-Scientific | 66382 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | 8655.1 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile-filtered (0.22 µm filter) | Carl Roth | XH76.1 | |
| T7 polymerase | NEB | M0251S | |
| TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine) | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Tris base | Fischer | BP1521 | |
| tRNA (from E. coli) | Roche Applied Science | MRE600 | |
| UTP | USB | 23160 |
References
- Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
- Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
- Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
- Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058 (2016).
- Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
- Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
- Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
- Chu, H. -S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
- Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
- Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
- Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
