Summary

Метод Ex Vivo для оценки спонтанной подвижности репродуктивных путей мыши и алгоритмотслеживания движения uterus на основе MATLAB для анализа данных

Published: September 01, 2019
doi:

Summary

Сокращения матки имеют важное значение для благополучия женщин. Однако, патологически повышенная контрактильность может привести к дисменорея, особенно у молодых женщин. Здесь мы описываем простой препарат ex vivo, позволяющий быстро оценить эффективность гладких миорелаксантов, которые могут быть использованы для лечения дисменореии.

Abstract

Dysmenorrhea, или болезненные судороги, является наиболее распространенным симптомом, связанным с менцами у женщин и его тяжесть может препятствовать повседневной жизни женщин. Здесь мы представляем простой и недорогой метод, который будет играть важную роль для тестирования новых препаратов снижения контрактности матки. Этот метод использует уникальную способность всего репродуктивных путей мыши проявлять спонтанную подвижность при поддержании ex vivo в чашке Петри, содержащей кислородом буфер Кребс. Эта спонтанная подвижность напоминает волноподобную миометрийную активность матки человека, называемую эндометрийными волнами. Чтобы продемонстрировать эффективность метода, мы использовали известный релаксант матки, эпинефрин. Мы демонстрируем, что спонтанная подвижность всего репродуктивных путей мыши может быть быстро и обратимо ингибируется 1 мкм эпинефрина в этой модели блюда Петри. Документирование изменений подвижности матки можно легко сделать с помощью обычного смартфона или сложной цифровой камеры. Мы разработали алгоритм на основе MATLAB, позволяющий отслеживать движение для количественной оценки спонтанных изменений подвижности матки путем измерения скорости движений рогов матки. Основным преимуществом этого подхода ex vivo является то, что репродуктивный тракт остается нетронутым на протяжении всего эксперимента, сохраняя все внутренние внутриутробные клеточные взаимодействия. Основным ограничением этого подхода является то, что до 10-20% матки не может проявлять спонтанной подвижности. До сих пор это первый количественный метод ex vivo для оценки спонтанной подвижности матки в модели блюда Петри.

Introduction

Как основной женский орган, матка имеет решающее значение для размножения и имеет важное значение для питания плода1. Матка состоит из трех слоев: периметрия, миометрия и эндометрия. Миометрий является основным сократительный слой матки и играет ключевую роль в родах. Эндометрий является самым внутренним слоем, выстилающими полость матки, и необходим для имплантации эмбриона. У небеременных женщин репродуктивного возраста, слой эндометрия сбрасывается ежемесячно в начале менструального цикла. Миометрий помогает в этом процессе пролития путем поддержания спонтанных сокращений миометрия, необходимых для очистки ткани некротической эндометрия из матки1.

К сожалению, повышенная контрактильность миометрии может привести к негативным побочным эффектам, таким как дисменорея, или болезненные менструальные спазмы. Это особенно наблюдается у молодых женщин и nulliparous женщин2. Тем не менее, дисменорея отличается для каждой женщины и зависит от силы их миометрических сокращений; более сильные сокращения часто связаны с ощущением тяжелых судорог3. Миометрия контрактильность может быть визуализирована с помощью УЗИ матки и часто признается как эндометрия волн. Повышенное высвобождение простагландинов во время менструации4 в матке, переживающей эдометрия, как полагают, способствует увеличению гиперконтрактильности миометрии, что приводит к ишемии и гипоксии мышц матки и, таким образом, увеличивается боль3.

Тяжелая дисменорея может препятствовать повседневной деятельности некоторых женщин и от 3 до 33% женщин имеют очень сильную боль, которая может привести к женщине быть прикован к постели в течение 1 до 3 дней каждый менструальный цикл5. Дисменорея является основной причиной гинекологической заболеваемости у женщин репродуктивного возраста независимо от возраста, национальности и экономического положения5. По оценкам, распространенность дисменореи является как высокой, так и переменной, в диапазоне от 45% до 93% у женщин репродуктивного возраста5.  Дисменорея связанных боль оказывает влияние на повседневную жизнь женщин и может привести к плохой успеваемости у подростков, более низкое качество сна, ограничение повседневной деятельности, и изменения настроения5.

Многие женщины, которые испытывают серьезные дисменорея прибегают к внебиржевой лекарства, чтобы облегчить их боль. Такие безрецептурные препараты содержат ингибиторы циклооксигеназы (КОКС),которые предотвращают образование простагландинов 6. Тем не менее, ингибиторы COX связаны с неблагоприятными сердечно-сосудистыми событиями, и около 18% женщин с дисменореей не реагируют на эти ингибиторы7. Таким образом, существует необходимость в новых лекарствах для уменьшения менструальных спазмов. В виду того что над contractility uterus способствует к pathogenesis dysmenorrhea, одной по возможности стратегией может быть польза утробных релаксантов.

Полезно количественно овоздействии потенциальных релаксантов в модели естественных спонтанных миометрийных волнообразных сокращений. Однако, до сих пор, не эффективный метод ex vivo для тестирования мышечно-расслабляющие препараты в нетронутой матки не было описано. В настоящее время изометрические измерения напряжения используются для оценки эффектов релаксантных препаратов. Во время таких измерений мышечная полоса матки поддерживается на постоянной длине при предварительной нагрузке в тканевой ванне, в то время как сила сокращения мышц матки регистрируется до и после стимуляции окситоцина в присутствии или отсутствии релаксанта препарата. Хотя этот подход очень полезен, он требует дорогостоящего оборудования. Кроме того, изометрические сокращения не похожи на спонтанные волнообразные сокращения миометрия, которые естественным образом происходят в нетронутой матке. Уникально, маточные волны миометрия у грызунов могут быть визуализированы как подвижность рога матки, когда весь репродуктивный тракт (яичники, яидуки, матка и влагалище) поддерживается в буферном растворе. Здесь мы представляем метод ex vivo для мониторинга спонтанной подвижности нетронутой мышиной матки, помещенной в чашку Петри, содержащую кислородом буфер Кребса. Мы также описываем алгоритм количественной оценки подвижности с использованием трекера движения MATLAB. Этот новый подход обеспечивает легкую и менее дорогую альтернативу для проверки релаксант потенциал естественных средств правовой защиты и синтетических соединений.

Protocol

Все процедуры с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Медицинской школе Университета Индианы (Индианаполис, IN). В исследовании использовались 2-5-месячные F2-129S-C57BL/6 сексуально зрелых самок мышей. ПРЕДЕКТО: Об?…

Representative Results

На рисунке 1 показаны репрезентативные изображения, сделанные в течение всей процедуры изоляции репродуктивного тракта, которые описаны в этом протоколе. Чтобы избежать загрязнения буфера мехом, что уменьшит качество видео, мы увлажнили тело мыши 70% этанола. Основным о?…

Discussion

Здесь мы описали метод оценки спонтанной контрактности всего репродуктивного тракта грызунов, который включает в себя яичники, яидуки, рога матки и влагалище. Мы использовали аналогичный метод, чтобы продемонстрировать релаксант эффект фенилэфрин на спонтанной мотыльки матки<sup class="xr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана внутренними фондами МЕ. AGO задумал исследование. XC и AGO были вовлечены в разработку описанных экспериментов.  FL и AGO проанализировали и интерпретировали данные. KLL, JOB, FL выполнили все эксперименты ex vivo. FL написал сценарий MATLAB. Рукопись написали KLL, JOB и AGO.  Все авторы прочитали и утвердили окончательный вариант рукописи.

Materials

Epinephrine hydrochloride Sigma-Aldrich  E4642 
Dulbecco's PBS Fisher Sceintific  17-512Q
Ethanol 200 PROOF Decon Laboratories 2701
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Glucose Sigma-Aldrich G7528
KCl Sigma-Aldrich P9333
CaCl2 · 2H2O Sigma-Aldrich C5080
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
MgCl2  · 6H2O Sigma-Aldrich M9272
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6297
Isoflurane, USP Patterson Veterinary 07-893-2374
Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps Fisher Sceintific 13-812-42
Curved Hardened Fine Iris Scissors Fine Science Tools 14091-09
Dissection High-performance Modular Stereomicroscope Leica MZ6 
Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system Leica  DFC425 C
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources Fisher Sceintific  12-562-21
Weigh Boat Fisher Sceintific  WB30304
Convertors Astound Standard Surgical Gown  Cardinal Health  9515 Small, Medium or Large
Gloves McKesson Corporation 20-1080 Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves
 Petri Dish Corning Falcon 351029 100 mm
 Petri Dish Corning Falcon 353001 35 mm
95% O2– 5% CO2 gas mixture Praxair  MM OXCD5-K
Ear-loop Masks Valumax International 5430E-PP
DSLR 24.2 MP Camera Canon EOS Rebel T6i
MATLAB MathWorks N/A version 2019 or later

References

  1. Kuijsters, N. P. M., et al. Uterine peristalsis and fertility: current knowledge and future perspectives: a review and meta-analysis. Reproductive BioMedicine Online. 35 (1), 50-71 (2017).
  2. Kural, M., Noor, N. N., Pandit, D., Joshi, T., Patil, A. Menstrual characteristics and prevalence of dysmenorrhea in college going girls. Journal of Family Medicine and Primary Care. 4 (3), 426-431 (2015).
  3. Dehnavi, Z. M., Jafarnejad, F., Kamali, Z. The Effect of aerobic exercise on primary dysmenorrhea: A clinical trial study. Journal of education and health promotion. 7, 3 (2018).
  4. Lindner, H. R., et al. Significance of prostaglandins in the regulation of cyclic events in the ovary and uterus. Advances in prostaglandin and thromboxane research. 8, 1371-1390 (1980).
  5. Bernardi, M., Lazzeri, L., Perelli, F., Reis, F. M., Petraglia, F. Dysmenorrhea and related disorders. F1000 research. 6, 1645 (2017).
  6. Marjoribanks, J., Ayeleke, R. O., Farquhar, C., Proctor, M. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs for dysmenorrhoea. The Cochrane database of systematic reviews. 7, 001751 (2015).
  7. Oladosu, F. A., et al. Abdominal skeletal muscle activity precedes spontaneous menstrual cramping pain in primary dysmenorrhea. American journal of obstetrics and gynecology. 219 (1), 91 (2018).
  8. Lawson, C. C., et al. Occupational exposures among nurses and risk of spontaneous abortion. American journal of obstetrics and gynecology. 206 (4), 327-328 (2012).
  9. Mazze, R. I., Wilson, A. I., Rice, S. A., Baden, J. M. Fetal development in mice exposed to isoflurane. Teratology. 32 (3), 339-345 (1985).
  10. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), 35538 (2012).
  11. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current protocols in neuroscience. , (2009).
  12. Segal, S., Csavoy, A. N., Datta, S. The tocolytic effect of catecholamines in the gravid rat uterus. Anesthesia and analgesia. 87 (4), 864-869 (1998).
  13. Chen, X., et al. Phenylephrine, a common cold remedy active ingredient, suppresses uterine contractions through cAMP signalling. Scientific reports. 8 (1), 11666 (2018).
  14. Domino, M., Pawlinski, B., Gajewski, Z. Biomathematical pattern of EMG signal propagation in smooth muscle of the non-pregnant porcine uterus. PLoS One. 12 (3), 0173452 (2017).
  15. Crane, L. H., Martin, L. Pace-maker activity in the myometrium of the oestrous rat: in vivo studies using video-laparoscopy. Reproduction, fertility, and development. 3 (5), 519-527 (1991).

Play Video

Cite This Article
Liang, K. L., Bursova, J. O., Lam, F., Chen, X., Obukhov, A. G. Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis. J. Vis. Exp. (151), e59848, doi:10.3791/59848 (2019).

View Video