Summary
Цель этого метода состоит в том, чтобы создать модель in vivo опухолевого ангиогенеза путем ксенотрансплантации опухолевых клеток млекопитающих в эмбрион зебры, который имеет флуоресцентно обозначенные кровеносные сосуды. С помощью изображения ксенотранспланта и связанных с ним сосудов можно получить количественное измерение ангиогенной реакции.
Abstract
Опухолевой ангиогенез является ключевой целью противораковой терапии, и этот метод был разработан, чтобы обеспечить новую модель для изучения этого процесса in vivo. Ксенотрансплантат зебры создается путем имплантации опухолевых клеток млекопитающих в перивительное пространство двухдневных эмбрионов зебры, а затем измерения степени ангиогенной реакции, наблюдаемой в экспериментальной точке конца до двух дней после имплантации. Ключевым преимуществом этого метода является способность точно квантитаризировать ангиогенную реакцию зебры-хозяина на трансплантат. Это позволяет детально изучить молекулярные механизмы, а также вклад хозяина против опухоли в ангиогенный ответ. Ксенотрансвированные эмбрионы могут подвергаться различным методам лечения, таким как инкубация с потенциальными антиангиогенезными препаратами, для того, чтобы исследовать стратегии по ингибированию опухолевого ангиогенеза. Ангиогенный ответ также может быть живым изображением для того, чтобы изучить более динамичные клеточные процессы. Относительно нетребовательная экспериментальная техника, дешевые затраты на техническое обслуживание зебры и короткие экспериментальные сроки делают эту модель особенно полезной для разработки стратегий по манипулированию опухолевым ангиогенезом.
Introduction
Ангиогенез является одним из классических признаков рака и представляет собой цель противораковой терапии1,2. Для изучения этого процесса, ксенотрансплантат модели рака были созданы путем имплантации опухолевых клеток млекопитающих в животных, таких как мыши3. Модель ксенотранспланта зебры также была разработана, которая включает в себя имплантацию опухолевых клеток в 2 дня после оплодотворения (dpi) зебры, что приводит к быстрому росту кровеносных сосудов зебры в ксенотрансвграф4.
Этот протокол описывает in vivo зебрафиш эмбриона опухоли ксенотрансплантат модели, в которой ангиогенный ответ может быть точно количественно по всему ксенотрансвграф. Этот метод позволяет исследователю изучить, in vivo, молекулярные механизмы, которые лежат в основе опухоли ангиогенной реакции. Генетическая tractability зебры позволяет хозяину вклад быть допрошен, в то время как выбор различных опухолевых клеток линий позволяет вклад опухоли ангиогенез также будет рассмотрен5,6,7. Кроме того, как личинки зебры проницаемы для малых молекул, конкретные ингибиторы пути могут быть использованы или библиотеки наркотиков могут быть проверены для выявления новых ингибиторов опухолевого ангиогенеза8,9,10, 11.
Модель ксенотранспланта эмбриона зебры представляет уникальные преимущества по сравнению с другими моделями ксенотранспланта млекопитающих. Зебрафиш ксенотранспланты дешевле и проще в исполнении, большое количество животных могут быть рассмотрены и живой клеток изображения позволяет детальное изучение поведения клеток4. В отличие от других моделей in vivo, для наблюдения которых требуется до нескольких недель, ангиогенез у ксенотрансплантатов зебры можно наблюдать в пределах 24 ч после имплантации3,4. Однако, отсутствие адаптивной иммунной системы у эмбриональных зебры, в то время как полезно для поддержания ксенотрансплантата, означает, что адаптивный иммунный ответ и его вклад в ангиогенез опухоли не могут быть рассмотрены. Кроме того, отсутствие опухолевых стромальных клеток, неспособность к ортотопически имплантации опухоли и разница в температуре обслуживания между зебрафиши и клетки млекопитающих являются потенциальными недостатками этого метода. Тем не менее, удобство этой модели для живой визуализации и способность точно количественно ангиогенный ответ делает его однозначно полезным для изучения клеточных процессов, которые регулируют ангиогенез опухоли in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка игл микроинъекций
- Включите выдвижной микропипетец и установите следующие параметры (откалиброванные для модели вытягивателя micropipette, перечисленные в таблицематериалов): Тепло, 680; Потяните, 75; Скорость, 40; Время, 55; Давление: 530.
- Закрепите боросиликатный стеклянный капилляр в выдвижной микропипетик и потяните капилляр, чтобы сделать две иглы. Повторите столько игл, сколько пожелает.
2. Клеточная культура для имплантации
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании этого протокола, любая линия раковых клеток млекопитающих может быть использована для имплантации в эмбрионы зебры в качестве ксенотрансплантатов. Тем не менее, существует много изменений в ангиогенной реакции индуцированных между различными линиями клеток5,11,12. Было показано, что клетки меланомы b16-F1 вызывают сильную ангиогенную реакцию в эмбрионах зебры11 и поэтому подходят для использования в этом протоколе.
- Выращивайте клетки B16-F1 при 37 градусах Цельсия в колбе номиналы мем-2 с использованием медиа MEM-q, дополненных сывороткой плода крупного рогатого скота (FBS) до конечной концентрации 10% (v/v) и пенициллина /стрептомицина, каждый при конечной концентрации 100 мкг/мл.
- Удалите носители из 95-100% сопливой 75 см2 колбы из клеток B16-F1 и промойте клетки в 5 мл фосфатно-буферного соливого раствора комнатной температуры (PBS).
- Удалить 5 мл PBS, добавить 2 мл комнатной температуры 0,25% Трипсин / этиленденедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА) и инкубировать при температуре 37 градусов по Цельсию в течение 60 с.
- Нажмите на сторону колбы, чтобы определить, начинают ли клетки терять свою привязанность к нижней части колбы.
- Добавьте 8 мл комнатной температуры MEM-я с 10% FBS в колбу, пипетку против внутренней части колбы, чтобы принести любые клетки, которые остаются прилипания к нижней части колбы в подвеску и пипетка подвески клетки в 15 мл трубки.
- Centrifuge клеточной суспензии на 800 х г, 4-8 кв в течение 5 минут, аспирировать средства массовой информации и приступить к маркировке клеток с красителем.
3. Маркировка B16-F1 Клетки с флуоресцентным красителем
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы различать имплантированные опухолевые клетки и другие клетки эмбриона, опухолевые клетки должны быть помечены соответствующим флуоресцентным красителем перед имплантацией. Этот шаг можно пропустить, если клетки уже выражают флуоресцентные репортеры.
- Инкубировать 2 мл безсыворотки MEM-- медиа при 37 градусах Цельсия.
- Подготовьте стоковый раствор выбранного красителя и разбавьте его в предварительно инкубированных 2 мл безсыворотки MEM-медиа, чтобы сделать работоспособную концентрацию (примеры красителей и концентраций, подходящих для клеток B16 F1, приведены в таблицематериалов).
- Пипетка 1 мл раствора красителя в клеточный гранулы (от шага 2.6), тщательно перемешать путем пипетки, затем добавить другие 1 мл раствора красителя и перемешать.
- Инкубировать клетки и краситель смесь при 37 градусов по Цельсию в течение 40 минут, смешивая нежной тряски на 20 мин.
- Центрифуги ядолок подвески на 800 х г, 4-8 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
- Призадыхать супернатант и мыть помеченные клетки путем pipetting с 5 мл PBS.
- Centrifuge клеточной подвески снова на 800 х г, 4-8 кв в течение 5 минут, аспирировать супернатант и поместить клетки на лед, пока не готов к имплантации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный пузало опухолевых клеток должен иметь объем 20-40 Л.
4. Подготовка эмбрионов для имплантации
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите трансгенную линию зебры, которая имеет флуоресцентно маркированные кровеносные сосуды (например, kdrl:RFP, fli1a:EGFP и т.д.) 13 Год , 14.
- За два дня до имплантации, нереста зебры, как описано ранее и собирать эмбрионы15.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку мы не инъекционных этих рыб на ранней стадии, они не должны быть собраны в течение 20 минут нереста, как описано Розен и др.15, но могут быть собраны после нескольких часов спаривания. - Поместите эмбрионы в 100 мм культурные блюда при плотности около 100 эмбрионов/блюдо.
- Добавьте 50 мл E316 (дополнено 5 qL из 1% w/v aqueous stock solution из метилена синего для предотвращения загрязнения) к каждому блюду, очищайте любые мертвые эмбрионы или мусор и держите блюдо в темном инкубаторе при 28 градусах Цельсия до готовности к инъекциям.
- На 1 день после оплодотворения (dpf), добавить 1-фенил-2-тиура (PTU) к каждому блюду для получения окончательной концентрации 30 мг/ l PTU в E3. ПТУ предотвращает пигментацию, которая может помешать способности просматривать опухолевые клетки и кровеносные сосуды.
- На 2 dpf, используйте иглы или пинцет вручную dechorionate любые эмбрионы, которые не вылупляются. Используя флуоресцентный микроскоп, выберите столько трансгенных эмбрионов, как это требуется для ксенотрансвации (50-200).
- Перед имплантацией анестезируйте выбранные эмбрионы в растворе 300 мкг/мл трикаина в E3, чтобы предотвратить движение во время процедуры инъекции.
- Заполните 35-мм блюдо с 2% метилцеллюлозы в E3 раствора до четверти объема блюда.
- Используйте пересадочную пипетку для размещения примерно 50 эмбрионов (минимизация объема раствора E3 также перенесена) на метилцеллюлозу.
- Используйте наконечник пипетки Microloader, чтобы организовать эмбрионы так, чтобы все они были ориентированы вертикально, с головами вверх и с левой стороны вверх.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.7-4.9 также могут быть выполнены путем организации эмбрионов на блоке агарозы, как ранее описано17, но по нашему опыту, эмбрионы легче организовать, когда массивные в метилцеллюлозе.
5. Перивителлин инъекций клеток рака млекопитающих в 2 dpf эмбрионов
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения того, чтобы клетки слипались в качестве трансплантата при имплантации, клетки должны быть смешаны вместе с внеклеточной матричной смесью (ECM). Мы описали шаги создания такой смеси ячейки/ECM при использовании смеси ECM, на которую ссылаются в таблицематериалов. Если используется альтернативная матрица, шаги должны быть соответствующим образом скорректированы.
- Разделите запас ECM на 100 аликотов в 500 трубках и храните при -20 градусов по Цельсию до необходимости.
- Оттепель из aliquot ECM и добавить 100 л PbS разбавить смесь до 50% (v/v).
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавленный 50% ECM может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение 1 месяца. - Смешайте 50% ECM хорошо с B16-F1 клеток гранулы (от шага 3.7) путем pipetting и перемешивания, чтобы произвести смесь клеток / ECM в соотношении 2:1 и хранить смесь на льду.
- Используя микрокапиллярную пипетку, возьмите 3-10 кл клеток.
- Аккуратно вставьте кончик пипетки в иглу и выбрасывайте смесь B16-F1/matrix в конец иглы.
- Вставьте иглу в держатель иглы и наклонитесь под углом 45 градусов к блюду.
- Разбейте кончик иглы с помощью пинцета, чтобы сделать отверстие достаточно большим для клеток, которые будут извлечены из иглы без сжатия клеток.
- Включите перфоцилиндр под давлением, прикрепленный к аппарату впрыска, и включите инжектор в «непрерывном» режиме на мгновение, чтобы подтолкнуть клетки к кончику иглы.
- Выньте иглу из тарелки и замените блюдо гемоситометром.
- Поместите каплю масла на гемоцитометр и введите иглу один раз на эту каплю.
- Подсчитайте количество клеток, выбрасываемых с помощью одного импульса с помощью гемоситометра и калибруйте иглу, чтобы извлечь около 150 клеток на пульс, регулируя продолжительность пульса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выброс этого количества клеток на пульс потребует нескольких импульсов для того, чтобы имплантировать успешный ксенотрансплантат. Это даст исследователю больше контроля над окончательным размером опухоли ксенотрансплантата, позволяя им умеренно регулировать число / расположение импульсов, чтобы сделать каждый ксенотрансвант больше или меньше, как они считают нужным. - Направьте иглу к желтоковому мешку эмбриона и протолкните его через желточный мешок в брюшном направлении, пока кончик иглы не вышел из желточного мешка и не толкает эмбриональный эпидермис на брюшной стороне эмбриона просто задний к сердцу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Расположите иглу так, чтобы она вошла в переднюю часть эмбрионального желткового мешка до конечного места, где клетки будут выброшены. Это гарантирует, что клетки будут выброшены в направлении от сердца, уменьшая вероятность введения клеток в общую кардинальную вену. - Тщательно нажмите кончик иглы вперед немного, пока он не создал пространство (перивителина) между эпидермис и желтка мешок мембраны, а затем импульс инжектор, чтобы извлечь некоторые из клеточной смеси в пространстве перивителина.
- Повторите импульсы до 500-800 клеток были введены в пространство перивителина, создавая видимый выпуклость, которая простирается по крайней мере половину пути вдоль нижней части желточного мешка, а затем удалить иглу из эмбриона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки блокируют иглу или повреждены во время инъекции, очистите иглу, на мгновение переключившись на "непрерывный" режим, а затем обратно в "пульс". Это должно разблокировать иглу и позволить клеткам быть извлеченным свободно и undamaged. - Продолжайте делать то же самое для всех эмбрионов в блюде, загрузка новой иглы с опухолевыми клетками, когда это необходимо.
- После введения всех эмбрионов, удалить иглу и нажмите все эмбрионы вместе с помощью микрокапиллярных пипетки отзыв, так что они могут быть пипетка с как можно меньше метилцеллюлозы, как это возможно.
- Перенесите эмбрионы в блюдо восстановления, содержащее E3 (с PTU и метиленовым синим) и промойте их, аккуратно промывe E3 вокруг эмбрионов.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, ксенопригированных эмбрионов можно лечить с помощью наркотиков, разделяя их на различные блюда и добавив препарат решение одного блюда и контрольный раствор (например, наркотиков транспортного средства) к другому блюду. - Инкубировать эмбрионы при 34 градусах Цельсия и выполнять два раза в день проверки, чтобы удалить мертвые или отеки эмбрионов из блюда.
ПРИМЕЧАНИЕ: 34 КК было установлено, что оптимальная температура для ксенотрансплантата васкуляризации, а также используется в других исследованиях, использующих зебрафиш эмбриональной ксенотрансплантат ангиогенез модели18. Ксенотранспланты могут быть изображены в любое время до 48 hpi (часы после имплантации).
6. Live Imaging
- На 48 hpi, определить 3-5 здоровых эмбрионов без отеков. Анестезируйте их в 150 мкг/мл трикаина и смонтировать их боковой в 1% Низкий плавильный пункт (LMP) агарозы, как ранее описано19.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как агарозы затвердевает, используйте микрокапиллярный пипетка отзыв держать эмбрионы расположены боковой. - Включите конфокальный микроскоп, контроллер микроскопа, лазеры и компьютерное программное обеспечение для управления микроскопом.
- Поместите блюдо на конфокальный микроскоп. Используя 20-x увеличение, вода погружения объектив объектив, положение ксенотрансплантата в центре поля с помощью яркого поля изображения.
- Выберите возбуждающие лазеры, которые подходят для обнаружения красителя, используемого для обозначения опухолевых клеток и фторфора, используемого для обозначения кровеносных сосудов зебры.
- Отрегулируйте выигрыш для каждого лазера до уровня, который позволяет обнаружить как опухолевые клетки, так и кровеносные сосуды.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как конфокальные настройки были установлены, убедитесь, что они остаются неизменными на протяжении всего эксперимента, так что сравнение может быть сделано между ксенотрансвграфами. - Используя лазерный канал, подходящий для опухолевых клеток, определите объем, который будет изображен, который включает в себя весь объем ксенотрансплантата, что позволяет, по крайней мере, один или два оптических секций по обе стороны от трансплантата. Используйте интервалы раздела, которые находятся на части примерно на 5 мкм друг от друга, чтобы создать z-стек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы z-стек содержал весь объем ксенотрансплантата. - Используя двухканальный образизображения, изображение как опухоли ксенотрансвтат и кровеносные сосуды. Повторите шаги 6.6-6.7 для каждой личинки, чтобы быть изображены.
7. Время Lapse изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта модель очень подходит для визуализации динамических клеточных процессов из-за его прозрачности и наличия трансгений зебры, которые флуоресцентно маркировать различные типы клеток. Это делает визуализацию замедленной помощью ключевым применением этой модели.
- Включите экологическую камеру и установите до 34 градусов по Цельсию, по крайней мере 2 ч до изображения. Если камера не увлажняется, добавьте блюда из воды.
- Анестезия 3-5 эмбрионов (с использованием 120 мкг/мл трикаина на 2 dpf и 100 мкг/мл трикаин на 3 dpf) и смонтировать их боково в 0,8% LMP агароуз для покадровой визуализации в соответствии с ранее описанным протоколом19.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как агарозы затвердевает, используйте микрокапиллярный пипетка отзыв держать эмбрионы расположены боковой. - Настройка оборудования и изображения ксенотрансплантата, как описано в шагах 6.2-6.7, приобретая z-stackts ксенотрансплантата с интервалом 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрион должен поддерживаться при 34 градусах Цельсия, как это изображение и E3 на вершине личинок в агаре должны быть проверены и дополнены время от времени, чтобы убедиться, что он не высохнет.
8. Количественная оценка ангиогенного ответа на ксенотрансплант зебрафиш
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги используют программное обеспечение для анализа 3D изображений. Конкретные шаги будут варьироваться в зависимости от используемого программного обеспечения.
- Перенесите файлы изображения конфокального изображения опухоли в новую папку на программном обеспечении для анализа 3D изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы количественно уровни васокляризации опухоли, Протоколы измерения должны быть созданы с настройками откалиброваны так, что они могут быть использованы для измерения либо объем опухоли или объем судна для всех ксенотрансплантатов. - Чтобы создать протокол "Tumor Volume" для измерения объема опухолевых ксенотрансплантатов, перейдите на вкладку "Измерение" в верхнем меню, а затем перетащите протоколы под названием "Найти объекты" из списка протоколов, который появляется на левой стороне окна в пространство который называется "Перетащите задачи здесь, чтобы сделать измерения".
- Убедитесь, что этот протокол установлен для измерения объектов в опухолевом канале, а затем перетащите протоколы под названием "Клип на ROIs" и "Сделать рентабельность от населения" из списка протоколов в "Перетащите задачи здесь, чтобы сделать измерения" пространство. Убедитесь, что эти две команды применяются к объектам, идентифицированным "Найти объекты".
- Перед калибровкой настроек этого протокола перейдите в меню выпадения над меткой "Mode" в левом верхнем левом окне и выберите представление "Расширенный фокус".
- Отберите неопухолевые каналы в стеле справа, нажав на черный круг под каждым заголовком канала, так что можно увидеть только опухолевый канал. Используйте инструмент "Freehand" в верхней части окна, чтобы нарисовать "регион интереса" (ROI) вокруг всего объема опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь, чтобы убедиться, что ни одна из опухоли не остается вне рентабельности инвестиций. Это обеспечит область, на которой выполняется протокол при калибровке настроек. - Выберите метку "Резюме" на панели под изображением и установите опцию "Дисплей", чтобы показать "Население 2". Для калибровки нажмите на звездочку на задаче «Найти объекты», которая откроет окно настроек. Отрегулируйте "Порог" с помощью "Интенсивность" и определения "нижнего" порога до тех пор, пока не будут выбраны только опухолевые клетки, а не фоновая флуоресценция.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это важно для того, чтобы только флуоресценция из опухолевых клеток в выбранной рентабельности инвестиций (нарисованная в 8,5) обнаружена и ни один из фоновой флуоресценции не измеряется. - Определить "Минимальный размер объекта", так что только нетронутые клетки измеряются в отличие от мелких элементов клеточного мусора (например, путем установки "Минимальный размер объекта" как 100 мкм3). Сохранить этот протокол как "Tumor Volume", нажав на вкладку Измерения в верхнем меню и нажав кнопку "Сохранить протокол", и использовать те же настройки для измерения всех ксенотрансветтов.
- Для измерения объема ксенотрансплантата связанных кровеносных сосудов, вам нужно будет сделать новый протокол. Перейти к верхней меню, нажмите на вкладку измерения и нажмите "Чистый протокол". Перетащите задачи "Найти объекты" и "Clip to ROIs" в пространство, озаглавленное "Перетащите задачи здесь, чтобы сделать измерения" для этого протокола.
- Убедитесь, что первая команда настроена на измерение объектов в канале кровеносных сосудов и что следующая команда настроена на объекты, идентифицированные первой командой. Затем отображайте несосудные каналы в крайнем правом стене, чтобы можно было увидеть только кровеносные сосуды.
- Определите настройки для "Объема судов" аналогичным образом, как и для протокола "Tumor Volume" и сохраните этот протокол как "Объем судов" (см. 8.6-8.7).
- Очистить протокол и нарисовать рентабельность инвестиций вокруг ксенотрансплантата, заботясь, чтобы не включать какой-либо неопухолевой автофлюоресценции. Измерьте сумму объема объектов в опухолевом канале внутри этой окупаемости, нажав на вкладку Измерения, выбрав команду «Протокол восстановления» и выбрав протокол «Опухолевый объем».
- Используя новую рентабельность инвестиций, составленную протоколом "Tumor Volume", используйте протокол "Объем судов" для измерения общего объема объектов в канале судна внутри этой рентабельности, нажав на вкладку Измерения, выбрав команду "Восстановить протокол" и выбрав "Vessel Объем" протокол.
- Разделите объем сосуда на объем опухоли и умножьте ответ на 100, чтобы получить процентное значение трансврант-васкуляризации.
- Повторите шаги от 8.11 до 8.13 для всех остальных ксенотрансплантов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью изображения индивидуального ксенотрансплантата на 6, 24 и 48 hpi, ангиогенный ответ в разных точках времени может быть рассчитан, как показано на рисунке 1A-C. Самый большой ангиогенный ответ наблюдается между 24-48 ч после имплантации, с максимальными уровнями трансплантата васкуляризации видели около 2 dpi(Рисунок 1A-C). Покадровой фильм типичный ангиогенный ответ на B16-F1 ксенотрансплантат от 20,75 hpi до 46 hpi рассматривается в дополнительномфильме 1 . Этот фильм был создан путем визуализации ксенотрансплантата, имплантированного после этого протокола в эмбрион 2 dpf kdrl:EGFP. Сосуды, которые растут через ксенотрансплантат образуют извилистые сети с сосудами нерегулярных размеров и морфологии, что характерно для аномальной сосудистой сети видели в опухолях млекопитающих20. Ангиогенный ответ в нашей модели является результатом сосудов, которые прорастают из общей кардинальной вены в ксенотрансплантат, в отличие от предыдущих исследований, которые сообщили суб-кишечных вен в качестве источника сосудов, которые растут в ксенотрансплантат4. Разница в происхождении сосуда связана с тем, что мы имплантировали наши ксенотрансплантаты в более брюшном месте в пространстве перивителина, так как это облегчает визуализацию формы и размера ксенотрансплантата при инъекциях и изображении20.
Рисунок 1D -F показывает репрезентативные результаты B16-F1 ксенотрансплантатов и связанных с ними сосудпослеа после лечения либо DMSO (контроль) или 50 нм ингибитора VEGFR (Tivozanib)21,22. Сразу же после имплантации ксенопригированные эмбрионы были разделены на две группы, и к каждой группе было применено либо 50 нМ Тивозаниба, либо ДМСО (0,5% v/v). Они были сохранены в этих препаратах до изображения на 2 dpi. Эти результаты показывают, что сосуды, связанные с ксенотрансплантами, инкубированными в ингибиторе VEGFR(рисунок 1E) гораздо менее многочисленны, чем сосуды, связанные с ксенотрансплантами, инкубированными в DMSO (рисунок 1D). В контролируемых эмбрионах существует экспансивная сосудистая сеть, которая простирается по всей области ксенотрансплантата(рисунок 1D),что является типичным ангиогенным ответом, наблюдаемым после имплантации клеток B16-F1. На рисунке 1F, ангиогенный ответ был количественно, следуя этому протоколу, и это показывает явное снижение в трансплантации васкуляризации в VEGFR ингибитор обработанных ксенотрансплантатов по сравнению с контролем. Несмотря на нормализацию уровня трансплантатной васкуляризации при объеме трансплантата, сохраняется большая вариация уровня всудности трансплантата на уровне 48 л.с. (коэффициент вариации 54,2%). Это связано с изменением общего объема опухолевых сосудов (коэффициент вариации 73,3%); мы заметили, что даже аналогичные по размеру трансплантаты имели большие различия в уровне васкуляризации. Из-за этого, рекомендуется, что около 20 ксенотрансплантатов используются в группе лечения.
Меры, предпринятые для количественной оценки судов, связанных с ксенотранспланта минотрансплантатом с рисунка 1D, показаны на рисунке 2. Опухолевой канал показан только на рисунке 2A, где масса клеток B16-F1 флуоресцентно обозначены (ложного цвета зеленый) можно увидеть ниже желтка мешок, который отображает автофлюоресценции. ROI должны быть тщательно обращается вокруг ксенотрансплантата(Рисунок 2A'), заботясь, чтобы не включать любой из автофлюоресценции от желток мешка, как протокол объем опухоли может затем определить это автофлюоресценции как часть опухоли. Выполнение протокола объем опухоли определяет все b16-F1 клеток в рентабельности инвестиций, измеряет их объем и клипы рентабельности инвестиций в их объем(рисунок 2A''). Выполнение протокола объем опухолевых судов в этой новой обрезанной рентабельности инвестиций позволяет идентифицировать все сосуды, связанные с массой клеток B16-F1, и измеряет их объем(рисунок 2A''). Значения из протоколов объем опухолевых и опухолевых сосудов могут быть использованы для измерения трансплантата васкуляризации, которая затем построена на графике, как видно на рисунке 1F.
Рисунок 1: Васкуляризация опухоли зебры ксенотрансвант ингибируется ингибитором сигнального сигнала VEGFR. (A-C) Конфокальные изображения живого эмбрионана 6 hpi (A ), 24 hpi (B) и 48 hpi (C ), с GFP-маркированных кровеносных сосудов (магента). Процент наятерной васкуляризации был рассчитан и включен в соответствующую панель. (D-E) Конфокальные изображения живых личинок зебры, показанные на 48 л.с. с флуоресцентно-маркированными X16-F1 ксенотрансплантатами (зелеными) и gFP-маркированными кровеносными сосудами (magenta), которые лечились сразу после имплантации либо 0,5% (v/v) DMSO в E3 (D) или 50 нм Ингибитор VEGFR (Тивозаниб)в E3 (E ). Каналы судов для D и E отображаются в изоляции в D' и E', соответственно. (F) График отображения данных от количественной оценки% трансплантата васкуляризации на 48 hpi в этих ксенотрансплантатов, n No 42 (DMSO), n No 20 (ингибитор VEGFR). «P»gt;0.01 по тесту Манн-Уитни, бары ошибок представляют s.d. Шкала бар 50 мкм. Данные, содержащиеся на рисунке 1F воспроизводится11.
Рисунок 2: Количественная трансплантация васкуляризации. Конфокальный образ живых 2 dpi личинки зебры с флуоресцентно-маркированных B16-F1 ксенотрансплантатов (зеленый) и GFP-маркированных кровеносных сосудов (magenta). (A) Опухолевый канал до рисования рентабельности инвестиций. (A') Рентабельность инвестиций нарисована вокруг области ксенотрансплантата, гарантируя, что аутофлуоресценция в желток не включена. (A'') ) Протокол "Tumor Volume" выполняется для определения объема ксенотрансплантата внутри рентабельности инвестиций, а также создает новую рентабельность инвестиций. (A'')) Протокол "Объем опухолевых судов" используется для определения объема судов внутри новой рентабельности инвестиций. Шкала бар 50 мкм.
Дополнительный фильм 1: Опухоль ксенотрансплантат ангиогенез. Конфокальная покадровая визуализация xenograft B16-F1 имплантирована в эмбрион зебры dpf с помеченными GFP кровеносными сосудами(kdrl:EGFP). Фильм взят от 20,75 л.с. до 46 л.с. Time-lapse изображение z-stacks было собрано 10 минут друг от друга; фильм был сделан на 7 кадров в секунду. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Первым важным шагом в протоколе является имплантация опухолевых клеток. Очень важно, чтобы клетки вводились в место, которое позволит ксенотрансплантатуспешно успешно имплантировать в эмбрион, не делая эмбрион отек. Инъекция, которая является слишком передней может позволить клеткам двигаться к сердцу, блокируя кровоток и приводит к отеку, в то время как инъекция, которая является слишком задней приведет к плохо имплантированных ксенотрансплантата. Передняя инъекция лучше избегать путем вставки иглы через желтковый мешок в передней в задней направлении, так что он указывает от сердца, как он вводит. Задняя инъекция лучше избегать путем введения клеток в месте в передней половине круглой части желтокого мешка. Кроме того, клетки должны быть введены брюшной к желток мешок, а не боковой к нему, как боковое расположение труднее для просмотра и впоследствии изображение. После того, как исследователь достаточно искусен в этом процессе, примерно 200-300 эмбрионов могут быть имплантированы с ксенотрансплантатов каждый день. Изображение ангиогенной реакции займет больше времени из-за времени, затраченного на монтаж и изображение ксенотранспланта; это занимает около одного часа, чтобы изображение 15-20 xenografts с помощью стандартного лазерного сканирования конфокальный микроскоп.
Вторым важным шагом является измерение трансплантата васкуляризации с использованием программного обеспечения для анализа 3D-изображений. Требуется количеств опухоли, так как через микроинъекцию трудно получить ксенотранспланты последовательного размера. Необходимо тщательно откалибровать настройки программных протоколов и использовать их последовательно для получения точных и объективных количественных измерений для всех экспериментов. Установка минимального порога интенсивности (как для опухолевого объема, так и для опухолевых сосудов) является важной частью этого шага, поскольку он позволяет протоколу правильно различать флуоресценцию, которая является частью опухоли/сосудов и фоновой флуоресценции. Рисунок рентабельности инвестиций вокруг опухоли ксенотрансплантат атакжем только опухоли ксенотрансплантата, а не каких-либо ярких аутофлюоресцентных частей эмбриона (таких как желточный мешок) также имеет важное значение; случайное включение любых неопухолевых аутофлюореционных областей или неопухолевых кровеносных сосудов в окупаемую инвестицию приведет к тому, что эти части будут измерены как часть "Объем опухоли" или "Объем опухолевого сосуда", создавая значительные неточности в окончательном расчете. Существует всегда большие различия в ангиогенной реакции (см. Рисунок 1F), однако, вместо того, чтобы ограничение модели, это может просто отражать естественную дисперсию в плотности опухоли наблюдается как у пациентов и murine xenografts 23 , 24. Количественная оценка трансплантата васкуляризации в 60 ксенотрансплантатов займет около 1 ч.
Тщательный отбор линии опухолевых клеток также имеет важное значение, поскольку существует широкое изменение в ангиогенной реакции, индуцированной между различными линиями клеток млекопитающих, которые могут относиться к различным уровням проангиогенных молекул, производимых этими клетками4 , 11. В наших руках, B16-F1 клетки меланомы мыши дают надежный ангиогенный ответ, возможно, из-за высокого уровня секреции VEGFA из этих клеток11. Возможные изменения в этом протоколе будет использование клеток меланомы зебры, что позволит температуре ассеа, чтобы быть снижена до 28 "и, следовательно, быть оптимальным как для хозяина и опухоли25 или использование раковых клеток, которые переэкспресс проангиогенные факторы роста, такие как FGF4,7,20.
Некоторые из преимуществ этой модели заключаются в ее короткий промежуток времени, низкая стоимость, и относительная легкость, с которой процедура ксенотрансплантации может быть проведена по сравнению с другими моделями in vivo, такими как murine xenografts, все из которых делают его высоко поддается быть использованы для крупномасштабных исследований (т.е. химических экранов для противоангиогенных соединений26). Способность жить изображение модели и наличие трансгенных рыб с флуоресцентно помечены кровеносные сосуды и другие типы клеток позволяет исследователям изучить детали процесса ангиогенеза (например, прорастание сосудов), а также клеток-клеток взаимодействия (такие как макрофаг-эндотелиальные взаимодействия), которые происходят во время ангиогенеза в этой модели11,20,27. Поскольку нормализация сосудов также является ключевой целью антиангиогенной терапии, живое изображение сосудистой сети в ксенотрансвантах с высоким разрешением означает, что эта модель имеет потенциал для определения методов лечения, направленных на эту цель. Сетуальная тортуозность может быть изучена путем подсчета количества ветвей сосудов, в то время как морфология сосудов может быть изучена путем измерения вариаций ширины сосуда, что позволит протестировать и оценить в этой модели28. Кроме того, микроангиография флуоресценции может быть использована для определения холиции и целостности опухолевых сосудов29. Генетическая уtractability зебры также означает, что она может быть генетически модифицирована для изучения роли различных путей сигнального хозяина в опухолевых ангиогенеза6. Эта модель может быть использована для выявления новых антиангиогенных соединений, которые активны в опухоли настройки, а также изучение клеточных и молекулярных взаимодействий, которые регулируют ангиогенез опухоли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим г-на Алхада Махагаонкара за управление учреждением по производству зебры ВОклендского университета и Исследовательским отделом биомедицинских изображений, Школой медицинских наук, Оклендским университетом, за помощь в замедленной конфокальной микроскопии. Эта работа была поддержана Советом по исследованиям в области здравоохранения Новой Зеландии грант (14/105), Королевское общество Новой Зеландии Марсден фонд проекта Грант (UOA1602) и Окленд медицинских исследований Фонд проекта Грант (1116012) присуждается JWA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, Length = 10 cm Cell injection |
| Cell culture dish 35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish 100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1,000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) - alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 G | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25%) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).
- Ribatti, D. Tumor Angiogenesis Assays. , 1st. edn, Humana Press. (2016).
- Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
- Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).
- Zhang, S., et al. SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).
- Muthukumarasamy, K. M., et al. Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).
- Britto, D. D., et al. Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish. BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Eng, T. C. Y., Astin, J. W.
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Nakamura, K., et al. KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties. Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).
- Okuda, K. S., et al. A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis. Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).
- Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).
- Vermeulen, P. B., et al. Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study. British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).
- Heilmann, S., et al. A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish. Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).
- Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges. Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).
- Zhao, C., et al. Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism. Scientific Reports. 6, 19404 (2016).
- Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).
- Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography. Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).
