Summary
Ziel dieser Methode ist es, ein In-vivo-Modell der Tumorangiogenese zu generieren, indem Säugetiertumorzellen in einen Zebrafisch-Embryo mit fluoreszierend gekennzeichneten Blutgefäßen gexlüftet werden. Durch die Abbildung des Xenografts und der zugehörigen Gefäße kann eine quantitative Messung der angiogenen Reaktion erreicht werden.
Abstract
Tumorangiogenese ist ein wichtiges Ziel der Anti-Krebs-Therapie und diese Methode wurde entwickelt, um ein neues Modell zur Untersuchung dieses Prozesses in vivo zur Verfügung zu stellen. Ein Zebrafisch-Xenograft entsteht, indem Säugetiertumorzellen in den Perivitelinraum von zwei Tagen nach der Befruchtung von Zebrafischembryonen implantiert werden, gefolgt von der Messung des Ausmaßes der angiogenen Reaktion, die an einem experimentellen Endpunkt bis zu zwei Tage beobachtet wurde. Nachderimplantation. Der Hauptvorteil dieser Methode ist die Fähigkeit, die Angiogene Reaktion des Zebrafische-Wirts auf das Transplantat genau zu quantifizieren. Dies ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der molekularen Mechanismen sowie des Wirts- vs.-Tumorbeitrags zur angiogenen Reaktion. Die xenografierten Embryonen können einer Vielzahl von Behandlungen unterzogen werden, wie z. B. der Inkubation mit potenziellen Anti-Angiogenese-Medikamenten, um Strategien zur Hemmung der Tumorangiogenese zu untersuchen. Die angiogene Reaktion kann auch live abgebildet werden, um dynamischere zelluläre Prozesse zu untersuchen. Die relativ anspruchslose Versuchstechnik, die günstigen Wartungskosten von Zebrafischen und die kurze experimentelle Zeitleiste machen dieses Modell besonders nützlich für die Entwicklung von Strategien zur Manipulation der Tumorangiogenese.
Introduction
Angiogenese ist eines der klassischen Kennzeichen von Krebs und stellt ein Ziel der Anti-Krebs-Therapie1,2. Um diesen Prozess zu untersuchen, wurden Xenograft-Modelle von Krebs durch implantieren Säugetier Tumorzellen in Tiere wie Mäuse3erstellt. Es wurde auch ein Zebrafisch-Xenograft-Modell entwickelt, das die Implantation von Tumorzellen in 2 Tage nach der Befruchtung (dpi) Zebrafische beinhaltet, was zu einem schnellen Wachstum von Zebrafisch-Blutgefäßen in das Xenograft4führt.
Dieses Protokoll beschreibt ein in vivo Zebrafisch-Embryo-Tumor-Xenograft-Modell, bei dem die angiogene Reaktion über das gesamte Xenograft genau quantifiziert werden kann. Diese Methode ermöglicht es dem Forscher, in vivo die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die angiogene Reaktion des Tumors untermauern. Die genetische Traktionsfähigkeit des Zebrafisches ermöglicht die Vernehmung des Wirtsbeitrags, während die Auswahl verschiedener Tumorzelllinien die Tumorbeteiligung zur Angiogenese ebenfalls untersuchen kann5,6,7. Darüber hinaus können, da Zebrafischlarven für kleine Moleküle durchlässig sind, spezifische Signalweginhibitoren verwendet oder Arzneimittelbibliotheken untersucht werden, um neuartige Inhibitoren der Tumorangiogenese8,9,10, 11.
Das Zebrafisch-Embryo-Xenograft-Modell bietet einzigartige Vorteile im Vergleich zu anderen Säugetier-Xenograft-Modellen. Zebrafisch Xenografts sind billiger und einfacher durchzuführen, eine große Anzahl von Tieren kann untersucht werden und Live-Zell-Bildgebung ermöglicht eine detaillierte Untersuchung des Zellverhaltens4. Im Gegensatz zu anderen In-vivo-Modellen, die bis zu mehreren Wochen benötigen, um ein signifikantes Gefäßwachstum zu beobachten, kann die Angiogenese in Zebrafisch-Xenografts innerhalb von 24 h nach der Implantation3,4beobachtet werden. Das Fehlen eines adaptiven Immunsystems bei embryonalen Zebrafischen ist jedoch vorteilhaft für die Aufrechterhaltung des Xenografts, was jedoch bedeutet, dass die adaptive Immunantwort und ihr Beitrag zur Tumorangiogenese nicht untersucht werden können. Darüber hinaus sind der Mangel an Tumorstromzellen, die Unfähigkeit, den Tumor orthotopisch zu implantieren, und der Unterschied in der Erhaltungstemperatur zwischen Zebrafischen und Säugetierzellen potenzielle Schwächen dieser Methode. Nichtsdestotrotz macht die Amenabilität dieses Modells für Live-Bildgebung und die Fähigkeit, die angiogene Reaktion genau zu quantifizieren, es einzigartig vorteilhaft für die Untersuchung der zellulären Prozesse, die die Tumorangiogenese in vivo regulieren.
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Protocol
1. Herstellung von Mikroinjektionsnadeln
- Schalten Sie einen Micropipette-Puller ein und stellen Sie die folgenden Parameter ein (kalibriert für das in Materialtabelleaufgeführte Micropipette-Puller-Modell): Heat, 680; Ziehen, 75; Geschwindigkeit, 40; Zeit, 55; Druck: 530.
- Befestigen Sie eine Borosilikatglaskapillare in den Mikropipette-Zieher und ziehen Sie die Kapillare, um zwei Nadeln zu bilden. Wiederholen Sie dies für beliebig viele Nadeln.
2. Zellkultur zur Implantation
HINWEIS: Bei Verwendung dieses Protokolls kann jede Säugetier-Krebszelllinie für die Implantation in Zebrafisch-Embryonen als Xenografts verwendet werden. Jedoch, Es gibt viele Variationen in der angiogenen Reaktion induziert zwischen verschiedenen Zelllinien5,11,12. B16-F1 murine Melanomzellen haben gezeigt, dass sie eine starke angiogene Reaktion bei Zebrafischembryonen11 induzieren und sind daher für die Verwendung in diesem Protokoll geeignet.
- Wachsen Sie B16-F1-Zellen bei 37 °C in einem 75 cm 2-Kolben mit MEM-B-Medien, die mit Fetal Bovine Serum (FBS) ergänzt werden, auf eine Endkonzentration von 10% (v/v) und Penicillin/Streptomycin, jeweils mit einer Endkonzentration von 100 g/ml.
- Entfernen Sie das Medium aus einem 95-100% konfluenten 75 cm2 Kolben B16-F1-Zellen und waschen Sie die Zellen in 5 ml Raumtemperatur phosphatgepufferte Kochungskochin (PBS).
- Entfernen Sie die 5 ml PBS, fügen Sie 2 ml Raumtemperatur 0,25% Trypsin/ Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und inkubieren bei 37 °C für 60 s.
- Tippen Sie auf die Seite des Kolbens, um festzustellen, ob die Zellen beginnen, ihre Bindung an der Unterseite des Kolbens zu verlieren.
- Fügen Sie 8 ml Raumtemperatur MEM-B mit 10% FBS in den Kolben, Pipette gegen das Innere des Kolbens, um alle Zellen, die am Boden des Kolbens haften bleiben, in die Suspension zu bringen und die Zellsuspension in ein 15 ml-Rohr zu pipette.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 800 x g, 4-8 °C für 5 min, aspirieren Sie die Medien und fahren Sie mit der Kennzeichnung der Zellen mit Farbstoff fort.
3. Kennzeichnung von B16-F1-Zellen mit fluoreszierendem Farbstoff
HINWEIS: Um zwischen den implantierten Tumorzellen und anderen Zellen im Embryo zu unterscheiden, müssen die Tumorzellen vor der Implantation mit einem geeigneten Fluoreszenzfarbstoff gekennzeichnet werden. Dieser Schritt kann übersprungen werden, wenn die Zellen bereits fluoreszierende Reporter ausdrücken.
- 2 ml serumfreies MEM-A-Medium bei 37 °C inkubieren.
- Bereiten Sie eine Stammlösung des gewählten Farbstoffs vor und verdünnen Sie ihn in vorbebrüteten 2 ml serumfreien MEM-A-Medien, um eine praktikale Konzentration zu erzielen (Beispiele von Farbstoffen und Konzentrationen, die für B16 F1-Zellen geeignet sind, sind in Tabelle der Materialienenthalten).
- 1 ml der Farbstofflösung in das Zellpellet (ab Schritt 2.6) geben, gründlich durch Pipettieren mischen, dann die anderen 1 ml Farbstofflösung hinzufügen und mischen.
- Die Zellen inkubieren und 40 min bei 37 °C färben, durch sanftes Schütteln bei 20 min mischen.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 800 x g, 4-8 °C für 5 min.
- Den Überstand ansaugen und die beschrifteten Zellen durch Pipettieren mit 5 ml PBS waschen.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension wieder bei 800 x g, 4-8 °C für 5 min, aspirieren Sie den Überstand und legen Sie die Zellen auf Eis, bis sie zur Implantation bereit sind.
HINWEIS: Das endgültige Tumorzellpellet sollte ein Volumen von 20-40 l haben.
4. Vorbereitung von Embryonen zur Implantation
HINWEIS: Wählen Sie eine transgene Zebrafischlinie mit fluoreszierend gekennzeichneten Blutgefäßen (z. B. kdrl:RFP, fli1a:EGFP usw.) 13 , 14.
- Zwei Tage vor der Implantation, laichen Sie den Zebrafisch wie zuvor beschrieben und sammeln Sie die Embryonen15.
HINWEIS: Da wir diese Fische nicht in einem frühen Stadium injizieren, müssen sie nicht innerhalb von 20 min nach dem Laichen gesammelt werden, wie von Rosen et al.15beschrieben, sondern können nach einigen Stunden der Paarung gesammelt werden. - Die Embryonen in 100 mm Kulturgerichte mit einer Dichte von ca. 100 Embryonen/Schale legen.
- 50 ml E316 (ergänzt mit 5 l einer 1% w/v wässrigen Lagerlösung von Methylenblau, um eine Kontamination zu verhindern) in jede Schale geben, alle toten Embryonen oder Ablagerungen reinigen und die Schale in einem dunklen Inkubator bei 28 °C bis zur Injektion bereit halten.
- Nach 1 Tag nach der Befruchtung (dpf) 1-Phenyl-2-thiourea (PTU) zu jeder Schale hinzufügen, um eine Endkonzentration von 30 mg/L PTU in E3 zu erzeugen. PTU verhindert Pigmentierung, die die Fähigkeit beeinträchtigen kann, die Tumorzellen und Blutgefäße zu sehen.
- Verwenden Sie bei 2 dpf Nadeln oder Pinzetten, um Embryonen, die ungeschlüpft sind, manuell zu dechorisieren. Wählen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop so viele transgene Embryonen aus, wie für die Xenografting erforderlich sind (50-200).
- Vor der Implantation die ausgewählten Embryonen in einer Lösung von 300 g/ml Tricain in E3 anbeäscheren, um eine Bewegung während des Injektionsvorgangs zu verhindern.
- Füllen Sie eine 35-mm-Schale mit einer 2% Methylcellulose in E3-Lösung auf ein Viertel des Volumens der Schale.
- Verwenden Sie eine Transferpipette, um etwa 50 Embryonen (Minimierung des Volumens der ebenfalls übertragenen E3-Lösung) auf die Methylcellulose zu platzieren.
- Verwenden Sie eine Microloader Pipettenspitze, um die Embryonen so zu ordnen, dass sie alle vertikal ausgerichtet sind, mit den Köpfen nach oben und mit der linken Seite nach oben.
HINWEIS: Die Schritte 4.7-4.9 können auch durchgeführt werden, indem die Embryonen auf einem Agaroseblock angeordnet werden, wie zuvorbeschrieben 17, aber unserer Erfahrung nach sind die Embryonen leichter angeordnet, wenn sie in Methylcellulose angeordnet sind.
5. Perivitelline Injektion von Säugetierkrebszellen in 2 dpf Embryonen
HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Zellen bei der Implantation als Transplantat zusammenklumpen, müssen die Zellen mit einer extrazellulären Matrixmischung (ECM) vermischt werden. Wir haben die Schritte zur Herstellung einer solchen Zelle/ECM-Mischung bei der Verwendung eines ECM-Gemischs beschrieben, auf das in der Tabelle der Materialienverwiesen wird. Wenn eine alternative Matrix verwendet wird, sollten die Schritte entsprechend angepasst werden.
- Teilen Sie einen Vorrat an ECM in 500 L-Rohre in 100 L-Aliquots auf und lagern Sie ihn bei -20 °C, bis er benötigt wird.
- Ein Aliquot von ECM auftauen und 100 l PBS hinzufügen, um das Gemisch auf 50% (v/v) zu verdünnen.
HINWEIS: Verdünntes 50% ECM kann bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden. - Mischen Sie das 50% ECM gut mit dem B16-F1 Zellpellet (ab Schritt 3.7) durch Pipetieren und Rühren, um eine Mischung von Zellen/ECM im Verhältnis 2:1 zu produzieren und das Gemisch auf Eis zu lagern.
- Mit einer mikrokapillaren Pipette nehmen Sie 3-10 L Zellen auf.
- Setzen Sie die Pipettenspitze vorsichtig in eine Nadel ein und werfen Sie die B16-F1/Matrix-Mischung in das Ende der Nadel aus.
- Setzen Sie die Nadel in den Nadelhalter ein und neigen Sie in einem 45°-Winkel zur Schale.
- Brechen Sie die Spitze der Nadel mit einer Pinzette, um ein Loch groß genug zu machen, damit die Zellen aus der Nadel ausgeworfen werden können, ohne die Zellen zu drücken.
- Schalten Sie den am Injektionsapparat befestigten Druckluftzylinder ein und schalten Sie den Injektor kurzzeitig in den "kontinuierlichen" Modus, um die Zellen an die Spitze der Nadel zu drücken.
- Entfernen Sie die Nadel aus der Schale und ersetzen Sie die Schale durch ein Hämozytometer.
- Legen Sie einen Tropfen Öl auf das Hämozytometer und injizieren Sie die Nadel einmal auf diesen Tropfen.
- Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die mit einem einzigen Impuls mit dem Hämozytometer ausgeworfen werden, und kalibrieren Sie die Nadel, um etwa 150 Zellen pro Puls auszuwerfen, indem Sie die Pulsdauer anpassen.
HINWEIS: Das Auswerfen dieser Menge von Zellen pro Puls erfordert mehrere Impulse, um ein erfolgreiches Xenograft zu implantieren. Dies wird dem Forscher mehr Kontrolle über die endgültige Größe des Tumorxenografts geben, indem er es ihnen ermöglicht, die Anzahl/Position der Impulse moderat anzupassen, um jedes Xenograft größer oder kleiner zu machen, wie sie es für richtig halten. - Richten Sie die Nadel auf den Eigelbsack eines Embryos und schieben Sie sie durch den Eigelbsack in ventraler Richtung, bis die Spitze der Nadel aus dem Eigelbsack hervorgegangen ist und die embryonale Epidermis auf der ventralen Seite des Embryos nur hinter dem Herzen drückt.
HINWEIS: Positionieren Sie die Nadel so, dass sie in den embryonalen Dottersack vor dem letzten Ort eindringt, an dem die Zellen ausgestoßen werden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Zellen in eine Richtung weg vom Herzen ausgestoßen werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit verringert wird, die Zellen in die gemeinsame Kardinalvene zu injizieren. - Schieben Sie die Spitze der Nadel vorsichtig ein wenig nach vorne, bis sie einen Raum (Perivitelline-Raum) zwischen der Epidermis und der Dottersackmembran geschaffen hat, und pulsieren Sie dann den Injektor, um einen Teil der Zellmischung in den Perivitellineraum auszustoßen.
- Wiederholen Sie die Impulse, bis 500-800 Zellen in den Perivitelinraum injiziert wurden, wodurch eine sichtbare Wölbung entsteht, die sich mindestens die Hälfte des Weges entlang der Unterseite des Dottersacks erstreckt, und entfernen Sie dann die Nadel aus dem Embryo.
HINWEIS: Wenn die Zellen die Nadel blockieren oder während der Injektion beschädigt sind, spülen Sie die Nadel, indem Sie vorübergehend in den "kontinuierlichen" Modus wechseln und dann wieder in den "Puls" zurückkehren. Dadurch sollte die Nadel entsperrt und die Zellen frei und unbeschädigt ausgestoßen werden können. - Machen Sie das gleiche für alle Embryonen in der Schale, laden Sie eine neue Nadel mit Tumorzellen, wenn erforderlich.
- Nach der Injektion aller Embryonen entfernen Sie die Nadel und schieben Sie alle Embryonen mit einer mikrokapillaren Pipettenspitze zusammen, so dass sie mit so wenig Methylcellulose wie möglich herausgepfetet werden können.
- Übertragen Sie die Embryonen in eine E3-haltige Verwertungsschale (mit PTU und Methylenblau) und waschen Sie sie, indem Sie E3 sanft um die Embryonen herum pipetieren.
HINWEIS: An dieser Stelle können die xenografted Embryonen mit Medikamenten behandelt werden, indem sie in verschiedene Gerichte getrennt werden und eine Medikamentenlösung zu einer Schale und eine Kontrolllösung (wie das Drogenfahrzeug) auf die andere Schale. - Die Embryonen bei 34 °C bebrüten und zweimal täglich kontrollen durchführen, um tote oder ödematige Embryonen aus der Schale zu entfernen.
HINWEIS: 34 °C wurde als die optimale Temperatur für xenograft Vaskularisation gefunden und wurde auch von anderen Studien verwendet, die die Zebrafisch embryonale Xenograft Angiogenese Modell18verwenden. Die Xenografts können jederzeit bis zu 48 PSi (Stunden nach der Implantation) abgebildet werden.
6. Live Imaging
- Bei 48 PSi, identifizieren 3-5 gesunde Embryonen ohne Ödem. Anästhetisieren Sie sie in 150 g/ml Tricain und montieren Sie sie seitlich in 1% Low Melting Point (LMP) Agarose wie zuvor beschrieben19.
HINWEIS: Wenn die Agarose erstarrt, verwenden Sie eine mikrokapillare Pipettenspitze, um die Embryonen seitlich positioniert zu halten. - Schalten Sie das konfokale Mikroskop, den Mikroskop-Controller, die Laser und die Computersoftware zur Steuerung des Mikroskops ein.
- Legen Sie die Schale auf ein konfokales Mikroskop. Positionieren Sie das Xenograft mit Hilfe einer 20-fachen Vergrößerung, einer Wassertauchobjektivlinse in der Mitte des Feldes mithilfe von Hellfeld-Bildgebung.
- Wählen Sie Anregungslaser aus, die geeignet sind, den Farbstoff zu erkennen, der zur Kennzeichnung der Tumorzellen verwendet wird, und des Fluorophors, das zur Kennzeichnung der Zebrafisch-Blutgefäße verwendet wird.
- Passen Sie die Verstärkung für jeden Laser auf ein Niveau an, das den Nachweis sowohl der Tumorzellen als auch der Blutgefäße ermöglicht.
HINWEIS: Sobald konfokale Einstellungen festgelegt wurden, stellen Sie sicher, dass diese während des gesamten Experiments unverändert bleiben, sodass Vergleiche zwischen Xenografts durchgeführt werden können. - Bestimmen Sie mithilfe des für die Tumorzellen geeigneten Laserkanals ein bildliches Volumen, das das gesamte Volumen des Xenografts enthält, sodass mindestens ein oder zwei optische Abschnitte auf beiden Seiten des Transplantats möglich sind. Verwenden Sie Schnittintervalle, die etwa 5 m voneinander entfernt sind, um einen Z-Stack zu erstellen.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass der Z-Stack das gesamte Volumen des Xenografts enthält. - Mit Hilfe von Zweikanal-Bildgebung, Bild sowohl der Tumor Xenograft und die Blutgefäße. Wiederholen Sie die Schritte 6.6-6.7 für jede zu bebilderte Larve.
7. Zeitraffer-Bildgebung
HINWEIS: Dieses Modell eignet sich aufgrund seiner Transparenz und der Verfügbarkeit von Zebrafischtransgenen, die verschiedene Zelltypen fluoreszierend kennzeichnen, hervorragend für die Abbildung dynamischer zellulärer Prozesse. Dies macht die Zeitraffer-Bildgebung zu einer Schlüsselanwendung dieses Modells.
- Schalten Sie die Umweltkammer ein und stellen Sie vor der Bildgebung mindestens 2 h auf 34 °C ein. Wenn die Kammer nicht befeuchtet ist, fügen Sie Gerichte von Wasser.
- 3-5-Embryonen anästheisieren (mit 120 g/ml Tricain bei 2 dpf und 100 g/ml Tricain bei 3 dpf) und seitlich in 0,8% LMP-Agarose zur Zeitraffer-Bildgebung gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll19einbauen.
HINWEIS: Wenn die Agarose erstarrt, verwenden Sie eine mikrokapillare Pipettenspitze, um die Embryonen seitlich positioniert zu halten. - Richten Sie die Ausrüstung ein und stellen Sie das Xenograft wie in den Schritten 6.2-6.7 beschrieben ab, und erfassen Sie Z-Stacks des Xenografts in 10 min Intervallen.
HINWEIS: Der Embryo muss bei 34 °C gehalten werden, während er abgebildet wird, und das E3 auf der Oberseite der Larven im Agar muss überprüft und gelegentlich ergänzt werden, um sicherzustellen, dass er nicht austrocknet.
8. Quantifizierung der angiogenen Reaktion auf den Zebrafisch Xenograft
HINWEIS: In den folgenden Schritten wird die 3D-Bildanalysesoftware verwendet. Bestimmte Schritte variieren je nach verwendeter Software.
- Übertragen Sie die konfokalen Z-Stack-Bilddateien eines Tumor-Xenografts in einen neuen Ordner auf der 3D-Bildanalyse-Software.
HINWEIS: Um die Höhe der Tumorvaskularisation zu quantifizieren, müssen Messprotokolle mit Kalibrieren erstellt werden, so dass sie verwendet werden können, um entweder Tumorvolumen oder Gefäßvolumen für alle Xenografts zu messen. - Um das Protokoll "Tumor volume" zur Messung des Volumens der Tumor-Xenografts zu erstellen, gehen Sie zur Registerkarte "Messung" im oberen Menü und ziehen Sie dann die Protokolle mit dem Namen "Objekte suchen" aus der Liste der Protokolle, die auf der linken Seite des Fensters angezeigt werden, in den Bereich das trägt den Titel "Aufgaben hier ziehen, um Messungen zu machen".
- Stellen Sie sicher, dass dieses Protokoll so eingestellt ist, dass Objekte im Tumorkanal gemessen werden, und ziehen Sie dann die Protokolle mit den Namen "Clip to ROIs" und "MAKE ROI from Population" aus der Liste der Protokolle in den Bereich "Aufgaben hier ziehen, um Messungen durchzuführen". Stellen Sie sicher, dass diese beiden Befehle auf die Objekte angewendet werden, die von "Objekte suchen" identifiziert werden.
- Bevor Sie die Einstellungen dieses Protokolls kalibrieren, gehen Sie zum Dropdown-Menü über der Bezeichnung "Mode" oben links im Fenster und wählen Sie die Ansicht "Erweiterter Fokus".
- Deaktivieren Sie die Nicht-Tumorkanäle im Bereich ganz rechts, indem Sie auf den schwarzen Kreis unter jeder Kanalüberschrift klicken, sodass nur der Tumorkanal sichtbar ist. Verwenden Sie das Werkzeug "Freihand" oben im Fenster, um eine "Region von Interesse" (ROI) um das gesamte Tumorvolumen zu zeichnen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, dass keiner der Tumore aus dem ROI gelassen wird. Dadurch wird ein Bereich zum Ausführen des Protokolls beim Kalibrieren der Einstellungen angezeigt. - Wählen Sie die Beschriftung "Zusammenfassung" im Bedienfeld unter dem Bild aus, und legen Sie die Option "Anzeige" fest, um "Bevölkerung 2" anzuzeigen. Um zu kalibrieren, klicken Sie auf das Sternchen auf der Aufgabe Objekte suchen, die das Einstellungsfenster öffnet. Passen Sie den "Schwellenwert" mit "Intensität" an und bestimmen Sie den "Unteren" Schwellenwert, bis nur die Tumorzellen ausgewählt sind und nicht die Hintergrundfluoreszenz.
HINWEIS: Dies ist wichtig, damit nur die Fluoreszenz der Tumorzellen im ausgewählten ROI (gezeichnet in 8.5) nachgewiesen wird und keine der Hintergrundfluoreszenz gemessen wird. - Bestimmen Sie die "Minimum Objektgröße", so dass im Gegensatz zu kleineren Zellablagerungen nur intakte Zellen gemessen werden (z. B. durch Festlegen der "Minimum Objektgröße" auf 100 m3). Speichern Sie dieses Protokoll als "Tumorvolume", indem Sie auf die Registerkarte Messungen im oberen Menü klicken und auf "Protokoll speichern" klicken, und verwenden Sie dieselben Einstellungen für die Messung aller Xenografts.
- Um das Volumen der xenograft-assoziierten Blutgefäße zu messen, müssen Sie ein neues Protokoll erstellen. Gehen Sie zum oberen Menü, klicken Sie auf die Registerkarte Messungen und klicken Sie auf "Protokoll löschen". Ziehen Sie die Aufgaben "Objekte suchen" und "Clip to ROIs" in den Bereich mit dem Titel "Ziehen Sie Aufgaben hier, um Messungen zu machen" für dieses Protokoll.
- Stellen Sie sicher, dass der erste Befehl zum Messen von Objekten im Blutgefäßkanal festgelegt ist und dass der folgende Befehl so eingestellt ist, dass er auf die mit dem ersten Befehl identifizierten Objekte angewendet wird. Deaktivieren Sie dann die Nichtgefäßkanäle in der rechtsextremen Scheibe, so dass nur die Blutgefäße sichtbar sind.
- Bestimmen Sie die Einstellungen für das "Vessel Volume" in ähnlicher Weise wie für das Protokoll "Tumor Volume" und speichern Sie dieses Protokoll als "Vessel Volume" (siehe 8.6-8.7).
- Löschen Sie das Protokoll und zeichnen Sie einen ROI um das Xenograft, wobei darauf zu achten ist, dass keine Nicht-Tumor-Autofluoreszenz enthalten ist. Messen Sie die Summe der Volumen der Objekte im Tumorkanal innerhalb dieses ROI, indem Sie auf die Registerkarte Messungen klicken, den Befehl "Protokoll wiederherstellen" auswählen und das Protokoll "Tumorvolume" auswählen.
- Verwenden Sie den neuen ROI des Protokolls "Tumor Volume", um das Gesamtvolumen der Objekte im Behälterkanal innerhalb dieses ROI zu messen, indem Sie auf die Registerkarte Messungen klicken, den Befehl "Protokoll wiederherstellen" auswählen und den Befehl "Vessel" auswählen. Volume"-Protokoll.
- Dividieren Sie das Gefäßvolumen durch das Tumorvolumen und multiplizieren Sie die Antwort mit 100, um einen prozentualen Wert der Transplantat-Vaskularisation zu erhalten.
- Wiederholen Sie die Schritte 8.11 bis 8.13 für alle anderen Xenografts.
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Representative Results
Durch die Abbildung eines einzelnen Xenografts bei 6, 24 und 48 PSi kann das angiogene Ansprechen zu verschiedenen Zeitpunkten berechnet werden, wie in Abbildung 1A-Cdargestellt. Die größte angiogene Reaktion wird zwischen 24-48 h nach der Implantation beobachtet, wobei die maximalen Konzentrationen der Transplantat-Vaskularisation um 2 dpi beobachtet werden (Abbildung 1A-C). Ein Zeitrafferfilm einer typischen angiogenen Reaktion auf ein B16-F1 Xenograft von 20,75 PSi bis 46 PSi ist im Ergänzungsfilm 1zu sehen. Dieser Film wurde durch die Abbildung eines Xenograft implantiert nach diesem Protokoll in einen 2 dpf kdrl:EGFP Embryo. Die Gefäße, die durch das Xenograft wachsen, bilden ein gewundenes Netzwerk mit Gefäßen von unregelmäßiger Größe und Morphologie, die typisch für das abnormale Gefäßnetz in Säugetiertumoren20ist. Die angiogene Reaktion in unserem Modell ist das Ergebnis von Gefäßen, die aus der gemeinsamen Kardinalvene in das Xenograft im Gegensatz zu früheren Studien sprießen, die die sub-intestinalen Venen als Quelle der Gefäße gemeldet haben, die in das Xenograft4hineinwachsen. Der Unterschied in der Gefäßherkunft ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass wir unsere Xenografts an einer ventraleren Stelle im Perivitelline-Raum implantiert haben, da dies es einfacher macht, die Form und Größe des Xenografts während der Injektion und Bildgebung20zu visualisieren.
Abbildung 1D -F zeigt repräsentative Ergebnisse von B16-F1-Xenografts und der damit verbundenen Vaskulatur nach behandlung mit DMSO (Kontrolle) oder 50 nM eines VEGFR-Hemmers (Tivozanib)21,22. Unmittelbar nach der Implantation wurden xenografierte Embryonen in zwei Gruppen aufgeteilt und entweder 50 nM Tivozanib oder DMSO (0,5% v/v) auf jede Gruppe angewendet. Sie wurden in diesen Medikamenten vor der Bildgebung bei 2 dpi beibehalten. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Gefäße, die mit Xenografts im VEGFR-Inhibitor inkubiert werden (Abbildung 1E) sind weit weniger zahlreich als die Gefäße, die mit Xenografts indbiert in DMSO inkubiert sind (Abbildung 1D). Bei Kontrollembryonen gibt es ein ausgedehntes Gefäßnetz, das sich über die gesamte Xenograft-Region erstreckt (Abbildung 1D), was die typische angiogene Reaktion ist, die nach der Implantation von B16-F1-Zellen beobachtet wurde. In Abbildung 1Fwurde die angiogene Reaktion nach diesem Protokoll quantifiziert und zeigt eine deutliche Verringerung der Transplantat-Vaskularisation in den VEGFR-inhibitorbehandelten Xenografts im Vergleich zu Kontrollen. Trotz der Normalisierung der Transplantat-Vaskularisation gegen das Transplantatvolumen bleibt eine große Variation in der Transplantat-Vaskularisation bei 48 PSi (Variationskoeffizient von 54,2%). Dies ist auf die Variation des Gesamtvolumens der Tumorgefäße zurückzuführen (Variationskoeffizient 73,3%); wir beobachteten, dass selbst ähnlich große Transplantate große Variationen im Grad der Vaskularisation aufwiesen. Aus diesem Grund wird empfohlen, dass pro Behandlungsgruppe etwa 20 Xenografts verwendet werden.
Die Schritte zur Quantifizierung der mit dem Xenograft assoziierten Gefäße aus Abbildung 1D sind in Abbildung 2dargestellt. Der Tumorkanal ist allein in Abbildung 2Adargestellt, wo eine Masse von B16-F1-Zellen fluoreszierend (falsch gefärbtes Grün) unter dem Dottersack zu sehen ist, der die Autofluoreszenz anzeigt. Ein ROI muss sorgfältig um das Xenograft gezogen werden (Abbildung 2A'), wobei darauf zu achten ist, dass keine der Autofluoreszenz aus dem Dottersack enthalten ist, da das Tumorvolume-Protokoll dann diese Autofluoreszenz als Teil des Tumors identifizieren kann. Durch ausführen des Tumor volume-Protokolls werden alle B16-F1-Zellen im ROI identifiziert, deren Volumen und die Abzweigung des ROI auf ihr Volumen (Abbildung2A'') abschneidet. Die Durchführung des Tumorvessel Volume Protokolls in diesem neuen abgeschnittenen ROI ermöglicht die Identifizierung aller Gefäße, die mit der Masse von B16-F1-Zellen assoziiert sind, und misst deren Volumen (Abbildung 2A'''). Die Werte aus den Protokollen Tumorvolumen und Tumorgefäßvolumen können verwendet werden, um ein Maß für die Transplantatvularisation zu geben, das dann in einem Diagramm dargestellt wird, wie in Abbildung 1Fdargestellt.
Abbildung 1: Die Vaskularisierung des Zebrafischtumors Xenograft wird durch einen VEGFR-Signalinhibitor gehemmt. (A-C) Konfokale Bilder eines lebenden Embryos mit 6 PSi (A), 24 PSi (B) und 48 PSi (C), mit GFP-markierten Blutgefäßen (Magenta). Die % transplantate Vaskularisation wurde berechnet und in das entsprechende Panel aufgenommen. (D-E) Konfokale Bilder von lebenden Zebrafischlarven mit 48 PSi mit fluoreszierend gekennzeichneten B16-F1 Xenografts (grün) und GFP-markierten Blutgefäßen (Magenta), die unmittelbar nach der Implantation mit entweder 0,5% (v/v) DMSO in E3 (D) oder 50 nm a behandelt wurden VEGFR-Inhibitor (Tivozanib) in E3 (E). Die Gefäßkanäle für D und E werden isoliert in D' bzw. E'dargestellt. (F) Diagramm mit den Daten aus der Quantifizierung der % Transplantat-Vaskularisation bei 48 PSi in diesen Xenografts, n = 42 (DMSO), n = 20 (VEGFR-Hemmer). **p>0.01 von Mann-Whitney test, Fehlerbalken stellen s.d. Scale bar = 50 'm dar. Die in Abbildung 1F enthaltenen Daten werden 11 reproduziert.
Abbildung 2: Quantifizierung der Transplantatvularisation. Konfokales Bild von lebenden 2 dpi Zebrafischlarven mit fluoreszierend gekennzeichneten B16-F1 Xenografts (grün) und GFP-markierten Blutgefäßen (Magenta). (A) Tumorkanal vor dem Zeichnen eines ROI. (A') Ein ROI wird um die Xenograft-Region gezogen, um sicherzustellen, dass die Autofluoreszenz im Dotter nicht enthalten ist. (A'') Das Protokoll "Tumor Volume" wird durchgeführt, um das Xenograftvolumen innerhalb des ROI zu identifizieren und auch einen neuen ROI zu schaffen. (A''') Das Protokoll "Tumor Vessel Volume" wird verwendet, um das Volumen der Gefäße innerhalb des neuen ROI zu identifizieren. Skalenbalken = 50 m.
Ergänzender Film 1: Tumor xenograft angiogenesis. Konfokale Zeitraffer-Bildgebung eines B16-F1-Xenografts, das in einen 2-dpf-Zebrafisch-Embryo mit GFP-markierten Blutgefäßen implantiert wurde (kdrl:EGFP). Film von 20,75 PSi bis 46 PSi. Zeitraffer-Bild-Z-Stacks wurden im Abstand von 10 min gesammelt; Film wurde mit 7 Bildern pro Sekunde gedreht. Skalenbalken = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Der erste kritische Schritt im Protokoll ist die Implantation von Tumorzellen. Es ist wichtig, dass Zellen an einen Ort injiziert werden, der es dem Xenograft ermöglicht, erfolgreich in den Embryo zu implantieren, ohne den Embryo ödematend zu machen. Eine zu vordere Injektion kann es den Zellen ermöglichen, sich in Richtung Herz zu bewegen, die Blutbahn zu blockieren und zu Ödemen zu führen, während eine zu hintere Injektion zu einem schlecht implantierten Xenograft führt. Eine vordere Injektion wird am besten vermieden, indem die Nadel durch den Eigelbsack in vorderer bis hinterer Richtung eingesetzt wird, so dass sie beim Injizieren vom Herzen wegzeigt. Eine hintere Injektion lässt sich am besten vermeiden, indem die Zellen an einer Stelle in der vorderen Hälfte des runden Teils des Eigelbsacks injiziert werden. Darüber hinaus müssen Zellen ventral in den Dottersack injiziert werden und nicht seitlich zu ihm, da die seitliche Position schwieriger zu sehen und anschließend abgebildet ist. Sobald der Forscher einigermaßen versiert in diesem Prozess ist, können etwa 200-300 Embryonen täglich mit Xenografts implantiert werden. Die Bildgebung der angiogenen Reaktion wird aufgrund der Zeit, die für die Montage und Abbildung der Xenografts in Anspruch genommen wird, länger dauern; Es dauert etwa eine Stunde, um 15-20 Xenografts mit einem Standard-Laserscanning-Konfokalmikroskop abzubilden.
Der zweite kritische Schritt ist die Messung der Transplantat-Vaskularisation mit 3D-Bildanalysesoftware. Quantifizierung nach Tumorvolumen ist erforderlich, da es schwierig ist, durch Mikroinjektion gleich große Xenografts zu erhalten. Es ist notwendig, die Einstellungen der Softwareprotokolle sorgfältig zu kalibrieren und konsequent zu verwenden, um genaue und unvoreingenommene quantitative Messungen für alle Experimente zu erhalten. Die Festlegung des Mindestschwellenwerts für die Intensität (sowohl für das Tumorvolumen als auch für das Tumorgefäßvolumen) ist ein wichtiger Teil dieses Schritts, da es dem Protokoll ermöglicht, korrekt zwischen Fluoreszenz, die Teil des Tumors/Gefäße ist, und Der Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden. Es ist ebenfalls wichtig, den ROI um das Tumor-Xenograft zu ziehen, um nur den Tumor Xenograft und keine hellen Autofluoreszenzteile des Embryos (wie den Dottersack) einzubeziehen; die versehentliche Einbeziehung von Nicht-Tumor-Autofluoreszenzregionen oder Nicht-Tumor-Blutgefäßen in den ROI führt dazu, dass diese Teile als Teil des "Tumorvolumens" oder "Tumorgefäßvolumens" gemessen werden, was zu erheblichen Ungenauigkeiten in der endgültigen Berechnung führt. Es gibt immer eine große Variation in der angiogenen Reaktion (siehe Abbildung 1F), jedoch, anstatt eine Einschränkung des Modells zu sein, kann dies nur die natürliche Varianz in der Tumorgefäßdichte widerspiegeln, die sowohl bei menschlichen Patienten als auch bei murinen Xenografts beobachtet wurde. 23 , 24. Die Quantifizierung der Transplantat-Vaskularisation in 60 Xenografts dauert ca. 1 h.
Eine sorgfältige Auswahl der Tumorzelllinie ist ebenfalls wichtig, da es eine große Variation in der angiogenen Reaktion gibt, die zwischen verschiedenen Säugetierzelllinien induziert wird, die sich auf die unterschiedlichen Niveaus der pro-angiogenen Moleküle beziehen können, die von diesen Zellen produziert werden4 , 11. In unseren Händen geben B16-F1-Mausmelanom-Zellen eine robuste angiogene Reaktion, möglicherweise aufgrund des hohen VEGFA-Sekrets aus diesen Zellen11. Mögliche Änderungen an diesem Protokoll wären die Verwendung von Zebrafisch-Melanomzellen, die es ermöglichen würden, die Assay-Temperatur auf 28° zu senken und somit sowohl für den Wirt als auch für den Tumor25 optimal zu sein oder krebszellen zu verwenden, die überausdrücken. pro-angiogene Wachstumsfaktoren wie FGF4,7,20.
Einige der Vorteile dieses Modells liegen in seiner kurzen Zeitspanne, niedrigen Kosten und der relativen Leichtigkeit, mit der das Xenotransplantationsverfahren im Vergleich zu anderen In-vivo-Modellen wie murinen Xenografts durchgeführt werden kann, die es alle sehr freundlich machen, für groß angelegte Studien (d. h. chemische Siebe für antiangiogene Verbindungen26). Die Fähigkeit, das Modell und die Verfügbarkeit von transgenen Fischen mit fluoreszierend markierten Blutgefäßen und anderen Zelltypen abzubilden, ermöglicht es den Forschern, die Details des Angiogenese-Prozesses (wie Gefäßkeimen) sowie der Zellzelle zu untersuchen. Wechselwirkungen (z. B. makrophagen-endotheliale Wechselwirkungen), die während der Angiogenese in diesem Modell stattfinden11,20,27. Da die Gefäßnormalisierung auch ein zentrales Ziel der antiangiogenen Therapie ist, bedeutet eine hochauflösende Live-Bildgebung des Gefäßnetzes in den Xenografts, dass dieses Modell das Potenzial hat, Behandlungen zu identifizieren, die auf dieses Ziel gerichtet sind. Die Netzwerktortuosität könnte durch Zählen der Anzahl der Gefäßverzweigpunkte untersucht werden, während die Gefäßmorphologie durch Messung der Variation der Gefäßbreite untersucht werden könnte, so dass Pro-Normalisierungsbehandlungen in diesem Modell getestet und bewertet werden können28. Darüber hinaus kann die Fluoreszenzmikroangiographie verwendet werden, um die Durchgängigkeit und Integrität von Tumorgefäßen zu bestimmen29. Die genetische Traktionsfähigkeit des Zebrafisches bedeutet auch, dass er genetisch verändert werden kann, um die Rolle verschiedener Wirtsignalwege in der Tumorangiogenese6zu untersuchen. Dieses Modell kann daher verwendet werden, um neuartige antiangiogene Verbindungen zu identifizieren, die in einer Tumoreinstellung aktiv sind, sowie die zellulären und molekularen Wechselwirkungen zu untersuchen, die die Tumorangiogenese regulieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Herrn Alhad Mahagaonkar für die Leitung der Zebrafischanlage der University of Auckland und der Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland, für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie im Zeitraffer. Diese Arbeit wurde durch ein Health Research Council of New Zealand Project Grant (14/105), ein Royal Society of New Zealand Marsden Fund Project Grant (UOA1602) und einen Auckland Medical Research Foundation Project Grant (1116012) unterstützt, der J.W.A. verliehen wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, Length = 10 cm Cell injection |
| Cell culture dish 35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish 100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1,000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) - alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 G | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25%) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
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