Summary
Bu yöntemin amacı, memeli tümör hücrelerini floresan etiketli kan damarlarıolan zebra balığı embriyosuna xenografting ederek tümör anjiyogenezinin in vivo modelini oluşturmaktır. Ksenogreft ve ilişkili damarların görüntülenmesiyle anjiyojenik yanıtın kantitatif ölçümü elde edilebilir.
Abstract
Tümör anjiyogenez anti-kanser tedavisinin önemli bir hedefi dir ve bu yöntem in vivo bu süreci incelemek için yeni bir model sağlamak için geliştirilmiştir. Bir zebrabalığı ksenograft iki gün-post-fertilizasyon zebrabalığı embriyolarının perivitellin uzayına memeli tümör hücreleri implante tarafından oluşturulur, iki güne kadar deneysel bir bitiş noktasında gözlenen anjiyojenik yanıtın derecesini ölçme takip implantasyon sonrası. Bu yöntemin en önemli avantajı, zebra balığının grefte anjiyojenik yanıtı doğru bir şekilde belirleyebilme yeteneğidir. Bu, moleküler mekanizmaların ayrıntılı olarak incelenmesini ve anjiyojenik yanıta konak vs tümör katkısının incelenmesini sağlar. Ksenogreftli embriyolar, tümör anjiyogenezi inhibe etme stratejilerini araştırmak için potansiyel anti-anjiyogenez ilaçları ile kuluçka gibi çeşitli tedavilere tabi tutulabilir. Anjiyojenik yanıt da daha dinamik hücresel süreçleri incelemek için canlı görüntülenebilir. Nispeten talepsiz deneysel teknik, zebra balığının ucuz bakım maliyetleri ve kısa deneysel zaman çizelgesi bu modeli tümör anjiyogenezi manipüle etme stratejilerinin geliştirilmesi için özellikle yararlı hale getirmektedir.
Introduction
Anjiyogenez kanserin klasik özelliklerinden biridir ve anti-kanser tedavisinin bir hedef temsil eder1,2. Bu süreci incelemek için, kanser ksenogreft modelleri fareler gibi hayvanlara memeli tümör hücreleri implante tarafından oluşturulmuştur3. Bir zebrabalığı ksenogreft modeli de geliştirilmiştir, hangi içine tümör hücrelerinin implantasyonu içerir 2 gün sonrası döllenme (dpi) zebra balığı içine zebrabalığı kan damarlarının hızlı büyüme ile sonuçlanır4.
Bu protokol, anjiyojenik yanıtın tüm ksenogreft boyunca doğru bir şekilde ölçülebileceği in vivo zebrabalığı embriyo tümör ksenogreft modelini tanımlar. Bu yöntem araştırmacı, in vivo, tümör anjiyojenik yanıtı destekleyen moleküler mekanizmaları incelemek için izin verir. Zebra balığının genetik sistemlenebilirliği konak katkısının sorgulanmasını sağlarken, farklı tümör hücre hatlarının seçilmesi tümör katkısının anjiyogeneze katkısının da incelenmesini sağlar5,6,7. Buna ek olarak, zebra balığı larvaları küçük moleküllere geçirgen olduğundan, spesifik yol inhibitörleri kullanılabilir veya ilaç kütüphaneleri tümör anjiyogenezinin yeni inhibitörlerini belirlemek için taranabilir8,9,10, 11. Yıl.
Zebrabalığı embriyo ksenograft modeli diğer memeli ksenogreft modellerine göre benzersiz avantajlar sunar. Zebrabalığı ksenogreftleri daha ucuz ve daha kolay yapılır, çok sayıda hayvan incelenebilirve canlı hücre görüntüleme hücre davranışının detaylı incelenmesine olanak sağlar 4. Önemli damar büyümesini gözlemlemek için birkaç haftaya kadar gerektiren diğer in vivo modellerinaksine, zebrabalığı ksenogreftlerinde anjiyogenez implantasyon dan sonra 24 saat içinde görülebilir3,4. Ancak, embriyonik zebra balığında adaptif bir bağışıklık sisteminin olmaması, ksenogreftin sürdürülmesinde yararlı olmakla birlikte, adaptif immün yanıtın ve tümör anjiyogenezine olan katkısının incelenemeyeceği anlamına gelir. Buna ek olarak, tümör stromal hücrelerinin eksikliği, ortokik olarak tümörün implante edilememesi ve zebra balığı ile memeli hücreleri arasındaki bakım sıcaklığı farkı bu yöntemin potansiyel zayıflıklarıdır. Bununla birlikte, canlı görüntüleme için bu modelin amenability ve doğru anjiyojenik yanıtı quantitate yeteneği in vivo tümör anjiyogenezdüzenleyen hücresel süreçleri incelemek için benzersiz yararlı hale getirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikroenjeksiyon İğnelerinin Hazırlanması
- Bir mikropipet çekmecesini açın ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın (Malzeme Tablosu'nda listelenen mikropipet çekmece modeli için kalibre edilmiş): Isı, 680; Çekme, 75; Hız, 40; Zaman, 55; Basınç: 530.
- Mikropipet çekmecesine borosilikat cam kılcal bir kılcal güvenli ve iki iğne yapmak için kılcal çekin. İstenildiği kadar iğne için tekrarlayın.
2. İmplantasyon için Hücre Kültürü
NOT: Bu protokolü kullanırken, herhangi bir memeli kanser hücre hattı ksenogreft olarak zebra balığı embriyoları içine implantasyon için kullanılabilir. Ancak, farklı hücre hatları arasında indüklenen anjiyojenik yanıt çok varyasyon var5,11,12. B16-F1 murine melanom hücrelerinin zebra balığı embriyolarında güçlü bir anjiyojenik yanıt adüktörü gösterilmiştir11 ve bu nedenle bu protokolde kullanıma uygundur.
- Fetal Sığır Serumu (FBS) ile desteklenen MEM-α media kullanarak 37 °C'de 37 °C'de B16-F1 hücrelerini %10 'luk (v/v) ve Penisilin /Streptomisin'e son konsantrasyonda 100 μg/mL'lik son konsantrasyonda yetiştirin.
- Ortamı %95-100'lük bir kabartma 75 cm2 şişe B16-F1 hücresinden çıkarın ve hücreleri oda sıcaklığında 5 mL'lik fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
- 5 mL PBS'yi çıkarın, 2 mL oda sıcaklığında %0,25 Tripsin/ etilenediamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve 37 °C'de 60 s'de kuluçkaya yatırın.
- Hücrelerin şişenin altına olan bağlılıklarını kaybetmeye başlayıp başlamadığını belirlemek için şişenin yan tarafına dokunun.
- Şişeye %10 FBS ile 8 mL oda sıcaklığında MEM-α, şişenin altına yapışan hücreleri süspansiyona getirmek için şişenin içine pipet ve hücre süspansiyonuna 15 mL'lik bir tüpe pipet ekleyin.
- Hücre süspansiyonuna 800 x g, 4-8 °C'de 5 dakika aralayın, ortama aspire edin ve hücreleri boyayla etiketlemeye devam edin.
3. Floresan Boya ile B16-F1 Hücrelerinin Etiketlenmesi
NOT: İmplante edilen tümör hücreleri ile embriyodaki diğer hücreler arasında ayrım yapabilmek için, tümör hücrelerinin implantasyondan önce uygun bir floresan boya ile etiketlenmesi gerekir. Hücreler zaten floresan muhabirleri ifade varsa bu adım atlanabilir.
- 37 °C'de serumsuz MEM-α ortam2 mL inkübat.
- Seçilen boyanın stok çözeltisini hazırlayın ve uygulanabilir bir konsantrasyon sağlamak için önceden inkübe edilmiş 2 mL serumsuz MEM-α ortamla seyreltin (B16 F1 hücrelerine uygun boya ve konsantrasyon örnekleri MalzemeTablosu'nda verilmiştir).
- Pipet 1 mL boya çözeltisi hücre pelet içine (adım 2.6), iyice pipetleme ile karıştırın, sonra boya çözeltisi diğer 1 mL ekleyin ve karıştırın.
- Hücreleri kuluçkaya yatırın ve boya karışımını 37 °C'de 40 dk boyunca, 20 dk.'da hafifçe sallayarak karıştırın.
- Hücre süspansiyonuna 800 x g, 4-8 °C'de 5 dk santrifüj edin.
- Supernatant aspire ve PBS 5 mL ile boru lama tarafından etiketli hücreleri yıkayın.
- Hücre süspansiyonunu tekrar 800 x g, 4-8 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatantı aspire edin ve implantasyona hazır olana kadar hücreleri buza yerleştirin.
NOT: Son tümör hücreli pelet 20-40 μL hacimli olmalıdır.
4. İmplantasyon için Embriyoların Hazırlanması
NOT: Floresan olarak etiketlenmiş kan damarlarıolan transgenik zebra balığı serisini seçin (örn. kdrl:RFP, fli1a:EGFP, vb.) 13.000 , 14.
- İmplantasyondan iki gün önce, daha önce açıklandığı gibi zebra balığı yumurtlayın ve embriyoları15toplayın.
NOT: Biz erken bir aşamada bu balık enjekte değil gibi, onlar Rosen ve ark.15tarafından açıklandığı gibi yumurtlama 20 dakika içinde toplanması gerekmez , ancak birkaç saatlik bir süre sonra mısradan sonra toplanabilir. - Embriyoları 100 mm kültür yemeğine yaklaşık 100 embriyo/çanak yoğunluğuna yerleştirin.
- Her çanağa 50 mL E316 (kontaminasyonu önlemek için %1 w/v sulu stok çözeltisi 5 μL ile desteklenir) ekleyin, ölü embriyoları veya döküntüleri temizleyin ve enjeksiyona hazır olana kadar 28 °C'de koyu bir kuvözde saklayın.
- 1 gün sonrası döllenme (dpf), 1-fenil-2-thiourea ekleyin (PTU) E3 30 mg / L PTU son konsantrasyonu üretmek için her çanağa. PTU pigmentasyon önler, hangi tümör hücreleri ve kan damarları görüntülemek için yeteneğini engelleyebilir.
- 2 dpf'de, yumurtadan çıkmamış embriyoları elle dechorionate için iğne veya cımbız kullanın. Floresan mikroskop kullanarak, ksenogreftleme için gerekli olan transgenik embriyoları seçin (50-200).
- İmplantasyondan önce, enjeksiyon işlemi sırasında hareketi önlemek için seçilen embriyoları E3'te 300 μg/mL Tricaine çözeltisinde uyuşturur.
- 35 mm'lik bir kabı E3 çözeltisinde %2'lik metilselülozla yemeğin hacminin dörtte biri kadar doldurun.
- Metilselüloz üzerine yaklaşık 50 embriyo (e3 çözeltisi hacmini en aza indirmek) yerleştirmek için bir transfer pipet kullanın.
- Embriyoları dikey olarak yönlendirecek şekilde düzenlemek için microloader pipet ucu kullanın, başları üstte ve sol tarafı yukarı bakacak şekilde.
NOT: Adımlar 4.7-4.9 da daha önce açıklandığı gibi bir agarose blok üzerinde embriyolar düzenlenmesi ile yapılabilir17, ama bizim deneyim, embriyolar daha kolay metilselüloz dizilmiş düzenlenir.
5. 2 dpf Embriyoiçine Memeli Kanser Hücrelerinin Perivitellinenjeksiyon
NOT: İmplantedildiğinde hücrelerin greft olarak bir araya toplandığından emin olmak için, hücreler hücre dışı matriks karışımı (ECM) ile karıştırılmalıdır. MalzemelerTablosunda atıfta bulunulan bir ECM karışımı nı kullanırken böyle bir hücre/ECM karışımı yapmanın adımlarını anlattık. Alternatif bir matris kullanılırsa, adımlar buna göre ayarlanmalıdır.
- ECM stoğunu 500°L tüplerde 100 μL'lik aliquotlara bölün ve -20 °C'de ihtiyaç duyulana kadar saklayın.
- Karışımı %50'ye (v/v) seyreltmek için Bir ECM aliquot'u eritin ve 100 μL PBS ekleyin.
NOT: Seyreltilmiş %50 ECM 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir. - %50 ECM'yi Pipetleme ve karıştırarak B16-F1 hücreli peletle (adım 3.7)'den karıştırın, 2:1 oranında hücre/ECM karışımı nı üretin ve karışımı buzüzerinde saklayın.
- Mikrocapiller pipet kullanarak 3-10 μL hücre alın.
- Pipet ucunu dikkatlice bir iğneye takın ve B16-F1/matrix karışımını iğnenin ucuna fırlatın.
- İğneyi iğne tutucuya takın ve tabağa 45° açıyla yatırın.
- Hücreleri sıkmadan iğneden dışarı atılması için hücrelerin yeterince büyük bir delik açmak için cımbız kullanarak iğneucu kırın.
- Enjeksiyon cihazına bağlı basınçlı hava silindirini açın ve hücreleri iğnenin ucuna itmek için enjektörü "sürekli" modda anında açın.
- İğneyi tabaktan çıkarın ve hemositometre ile değiştirin.
- Hemositometre üzerine bir damla yağ yerleştirin ve bir kez bu damla üzerine iğne enjekte.
- Hemositometrekullanarak tek bir darbe ile çıkarılan hücrelerin sayısını sayın ve darbe süresini ayarlayarak darbe başına yaklaşık 150 hücre çıkarmak için iğnekalibre.
NOT: Nabız başına bu miktarda hücrenin atılması, başarılı bir ksenogreft yerleştirmek için birkaç darbe gerektirecektir. Bu, araştırmacıya tümör ksenogreftinin son boyutu üzerinde daha fazla kontrol sağlayarak, her ksenogrefti uygun gördükleri şekilde daha büyük veya daha küçük hale getirmek için bakliyat sayısını/yerlerini orta düzeyde ayarlamalarına izin verir. - İğneyi bir embriyonun yumurta kesesi doğru doğru doğru nokta ve iğne ucu yumurta kesesi ortaya çıkmıştır ve embriyonik epidermis embriyonik epidermis sadece kalbe posterior iterek kadar bir ventral yönde yolk kese yoluyla itin.
NOT: İğneyi embriyonik yolk kesesi anterior'una hücrelerin atacağı son yere girecek şekilde yerleştirin. Bu hücrelerin kalpten uzak bir yönde atılır sağlayacak, ortak kardinal ven içine hücreleri enjekte olasılığını azaltarak. - İğnenin ucunu epidermis ve yolk kese zarı arasında bir boşluk (perivitelline) yaratana kadar dikkatlice ileri doğru itin ve ardından enjektörü nabız içine geçirerek hücre karışımının bir kısmını perivitellin uzaya fırlatın.
- 500-800 hücreleri perivitelline uzaya enjekte edilmiş kadar bakliyat tekrarlayın, sarısı kese sinin alt boyunca yolun en az yarısını genişleten görünür bir şişkinlik oluşturarak, sonra embriyo dan iğne kaldırın.
NOT: Hücreler iğneyi bloke ederse veya enjeksiyon sırasında hasar görürse, bir an için "sürekli" moduna geçerek iğneyi temizleyin ve ardından "nabız"a geri döner. Bu, iğnenin engelini kaldırmalı ve hücrelerin serbestçe ve hasarsız olarak dışarı atılmasına izin vermelidir. - Çanak tüm embriyolar için aynı şeyi yapmaya devam, gerektiğinde tümör hücreleri ile yeni bir iğne yükleme.
- Tüm embriyolar enjekte ettikten sonra, iğne yi çıkarın ve mümkün olduğunca az metilselüloz ile dışarı pipetli böylece bir mikrokapiller pipet ucu kullanarak birlikte tüm embriyolar itin.
- Embriyoları E3 içeren bir kurtarma kabına (PTU ve metilen mavisi ile) aktarın ve embriyoların etrafına E3'ü yavaşça borulayarak yıkayın.
NOT: Bu noktada, ksenogreftli embriyolar farklı yemeklere ayırarak ve bir çanak ve bir kontrol çözeltisi (ilaç aracı gibi) diğer çanak için bir ilaç çözeltisi ekleyerek ilaçlar la tedavi edilebilir. - Embriyoları 34 °C'de kuluçkaya yatırın ve ölü veya ödemli embriyoları yemekten çıkarmak için günde iki kez kontrol yapın.
NOT: 34 °C ksenogreft vaskülarizasyon için en uygun sıcaklık olarak bulunmuştur ve zebrabalığı embriyonik ksenogreft anjiyogenez modeli18kullanan diğer çalışmalar da kullanılmıştır. Ksenogreftler 48 hpi'ye (implantasyon sonrası saatler) kadar her zaman görüntülenebilir.
6. Canlı Görüntüleme
- At 48 hpi, ödem olmadan 3-5 sağlıklı embriyolar tanımlayın. 150 μg/mL Tricaine onları anestezik ve yanal olarak monte 1% Düşük Erime Noktası (LMP) agarose daha önce açıklandığı gibi19.
NOT: Agarose katılaşma olduğundan, embriyoları yanal olarak konumlandırmak için mikrokapiller pipet ucu kullanın. - Konfokal mikroskobu, mikroskop denetleyicisini, lazerleri ve mikroskobu kontrol etmek için bilgisayar yazılımını açın.
- Bir konfokal mikroskop üzerine çanak yerleştirin. 20x büyütme kullanarak, su daldırma objektif lens, brightfield görüntüleme kullanarak alanın merkezinde ksenogreft konumlandırmak.
- Tümör hücrelerini ve zebrabalığı kan damarlarını etiketlemek için kullanılan floroforu etiketlemek için kullanılan boyayı tespit etmek için uygun uyarma lazerlerini seçin.
- Her lazer için kazanç hem tümör hücrelerinin ve kan damarlarının tespiti sağlayan bir seviyeye ayarlayın.
NOT: Konfokal ayarlar oluşturulduktan sonra, ksenogreftler arasında karşılaştırmalar yapilebilmesi için bunların deney boyunca değişmeden tutulduğundan emin olun. - Tümör hücreleri için uygun lazer kanal ını kullanarak, greftin her iki tarafında en az bir veya iki optik bölüm için izin, ksenogreft tüm hacmi içeren görüntülenecek bir hacim belirlemek. Z-yığını oluşturmak için yaklaşık 5 μm arayla kesit aralıkları kullanın.
NOT: Z-yığınının ksenogreftin tüm hacmini içermesi esastır. - İki kanallı görüntüleme kullanarak, görüntü hem tümör ksenogreft ve kan damarları. Her larva nın görüntülensin için 6.6-6.7 adımlarını tekrarlayın.
7. Zaman Atlamalı Görüntüleme
NOT: Bu model, şeffaflığı ve farklı hücre tiplerini floresan olarak etiketleyen zebra balığı transjeniküllerinin kullanılabilirliği nedeniyle dinamik hücresel süreçlerin görüntülenmesi için son derece uygundur. Bu, hızlandırılmış görüntülemeyi bu modelin önemli bir uygulaması haline getirir.
- Çevre odasını açın ve görüntülemeden önce en az 2 saat 34 °C'ye ayarlayın. Oda nemlendirilmezse, su tabakları ekleyin.
- Anestezi 3-5 embriyo (2 dpf'de 120 μg/mL Tricaine ve 3 dpf'de 100 μg/mL Tricaine kullanılarak) ve daha önce açıklanan protokol 19'agöre zaman atlamalı görüntüleme için %0,8 LMP agarose yanal olarak monte edin.
NOT: Agarose katılaşma olduğundan, embriyoları yanal olarak konumlandırmak için mikrokapiller pipet ucu kullanın. - 6.2-6.7 adımlarında açıklandığı gibi ksenogrefti ayarlayın ve 10 dk aralıklarla ksenogreftin z-yığınlarını satın alın.
NOT: Embriyo görüntülendirildiği için 34 °C'de muhafaza edilmeli ve agardaki larvaların üstündeki E3 kontrol edilmeli ve kurumaması için ara sıra takviye edilmelidir.
8. Zebrabalığı Xenograft'a Anjiyojenik Yanıtın Niceliği
NOT: Aşağıdaki adımlarda 3B görüntü analizi yazılımı kullanılır. Belirli adımlar kullanılan yazılıma bağlı olarak değişir.
- Tümör ksenogreftinin z-stack konfokal görüntü dosyalarını 3D Görüntü Analizi yazılımındaki yeni bir klasöre aktarın.
NOT: Tümör vaskülarizasyon düzeylerini ölçebilmek için, tüm ksenogreftler için Tümör Hacmi veya Damar Hacmini ölçmek için kullanılabilecek şekilde kalibre edilmiş ayarlarla Ölçüm Protokolleri oluşturulmalıdır. - Tümör ksenogreftlerinin hacmini ölçmek için "Tümör Hacmi" protokolünü oluşturmak için, üst menüdeki "Ölçüm" sekmesine gidin ve ardından pencerenin sol tarafında görünen protokoller listesinden "Nesneleri Bul" adlı protokolleri sürükleyin. "Ölçü yapmak için görevleri buraya sürükleyin" başlıklı.
- Bu protokolün tümör kanalındaki nesneleri ölçmek için ayarlandığından emin olun ve ardından "Clip to ROI" ve "Make ROI from Population" adlı protokolleri protokoller listesinden "Ölçüm yapmak için buradaki görevleri buraya sürükleyin" alanına sürükleyin. Bu iki komutun "Nesneleri Bul" tarafından tanımlanan nesnelere uygulandığından emin olun.
- Bu protokolün ayarlarını ayarlamadan önce, pencerenin sol üst kısmındaki "Mode" etiketinin üzerindeki açılır menüye gidin ve "Genişletilmiş Odak" görünümünü seçin.
- Her kanal başlığıaltında siyah daire tıklayarak en sağdaki bölmede non-tümör kanalları deselect, böylece sadece tümör kanalı görülebilir. Tüm tümör hacmi etrafında bir "ilgi bölgesi" (ROI) çizmek için pencerenin üst kısmındaki "Freehand" aracını kullanın.
NOT: Tümörün hiçbirinin Yatırım Getirisi'nin dışında bırakılmadığından emin olmaya özen. Bu, ayarları kalibre ederken protokolü gerçekleştireceğiniz bir bölge sağlar. - Resmin altındaki panelde "Özet" etiketini seçin ve "Popülasyon 2"yi göstermek için "Görüntüle" seçeneğini ayarlayın. Kalibre etmek için, ayarlar penceresini açacak Nesneleri Bul görevindeyıldız işaretine tıklayın. "Yoğunluk" kullanarak "Eşik"i ayarlayın ve arka plan floresanını değil, yalnızca tümör hücreleri seçilene kadar "Alt" eşiğini belirleyin.
NOT: Bu, seçilen Yatırım Getirisi 'ndeki (8.5'te çekilen) tümör hücrelerinden gelen floresan tespit edilebilmektedir ve arka plan floresanlarının hiçbiri ölçülmez. - "Minimum nesne boyutunu" belirleyin, böylece yalnızca bozulmamış hücreler hücre enkazının daha küçük öğelerinin aksine ölçülür (örneğin, "Minimum nesne boyutu" 100 μm3olarak ayarlanır). Üst menüdeki Ölçümler sekmesine tıklayarak ve "Protokolü Kaydet"i tıklatarak bu protokolü "Tümör Hacmi" olarak kaydedin ve tüm ksenogreftleri ölçmek için aynı ayarları kullanın.
- Ksenogreft ilişkili kan damarlarının hacmini ölçmek için, yeni bir protokol yapmanız gerekir. Üst menüye gidin, Ölçümler sekmesine tıklayın ve "Protokolü Temizle"yi tıklatın. "Nesneleri Bul" ve "RoI'lara Klip" görevlerini bu protokol için "Ölçüyapmak için görevleri buraya sürükleyin" başlıklı alana sürükleyin.
- İlk komutun kan damarı kanalındaki nesneleri ölçmek için ayarlandığından ve aşağıdaki komutun ilk komuttarafından tanımlanan nesnelere uygulanacak şekilde ayarlandığından emin olun. Sonra sadece kan damarları görülebilir, böylece aşırı sağ bölmede olmayan damar kanalları seçin.
- "Damar Hacmi" ayarlarını "Tümör Hacmi" protokolüne benzer şekilde belirleyin ve bu protokolü "Damar Hacmi" olarak kaydedin (bakınız 8.6-8.7).
- Protokolü temizleyin ve ksenogreft in etrafına bir yatırım getirisi çizin, tümör dışı otofloresan içermemeye özen. Ölçümler sekmesini tıklayarak, "Protokol Geri Yükle" komutunu seçerek ve "Tümör Hacmi" protokolünü seçerek bu YG'deki tümör kanalındaki nesnelerin hacminin toplamını ölçün.
- "Tümör Hacmi" protokolü tarafından yapılan yeni YG'yi kullanarak, Ölçümler sekmesini tıklayarak, "Geri Yükleme Protokolü" komutunu seçerek ve "Gemi" komutunu seçerek bu YG'deki damar kanalındaki nesnelerin toplam hacmini ölçmek için "Damar Hacmi" protokolünü kullanın Hacim" protokolü.
- Damar hacmini tümör hacmine bölün ve yanıtı 100 ile çarpın ve greft vaskülarizasyonunun yüzde değerini elde edin.
- Diğer tüm ksenogreftler için 8.11-8.13 adımlarını tekrarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
6, 24 ve 48 hpi'de tek bir ksenograft görüntülenerek, farklı zaman noktalarındaki anjiyojenik yanıt Şekil 1A-C'degösterildiği gibi hesaplanabilir. En büyük anjiyojenik yanıt 24-48 h sonrası implantasyon arasında gözlenirken, en fazla greft vaskülarizasyonu 2 dpi civarında görülür (Şekil1A-C). Bir B16-F1 ksenogreft tipik bir anjiyojenik yanıt bir zaman atlamalı film 20.75 hpi kadar 46 hpi Ek Film 1görülür . Bu film, bu protokolden sonra yerleştirilen bir ksenogreftin 2 dpf kdrl:EGFP embriyosuna görüntülenmesiyle oluşturulmuştur. Ksenogreft yoluyla yetişen damarlar düzensiz boyut ve morfoloji damarları ile dolambaçlı bir ağ oluşturur,hangi memeli tümörlerde görülen anormal vasküler ağ tipik 20 . Bizim modelde anjiyojenik yanıt ksenogreft içine ortak kardinal ven filiz damarların bir sonucudur ksenogreft içine önceki çalışmalara karşı, hangi xenograft içine büyümek damarların kaynağı olarak alt bağırsak damarları bildirdin4. Damar kökenindeki fark, ksenogreftlerimizi perivitellin etabında daha ventral bir konuma yerleştirmiş olmamızdan kaynaklanmaktadır, çünkü bu, ksenogreftin şeklini ve boyutunu görselleştirmeyi kolaylaştırdığı için20.
Şekil 1D -F, DMSO (kontrol) veya 50 nM ve GFR inhibitörü (Tivozanib)21,22ile tedavi sonrası B16-F1 ksenogreftlerinin ve bunların ilişkili vaskülatürlerinin temsili sonuçlarını gösterir. İmplantasyondan hemen sonra ksenogreftli embriyolar iki gruba ayrıldı ve her gruba 50 nM Tivozanib veya DMSO (%0.5 v/v) uygulandı. Bu ilaçlardan önce 2 dpi'de tutuldular. Bu sonuçlar, VEGFR inhibitöründe inkülatif ksenogreftlerle ilişkili damarların (Şekil 1E)DMSO'da inküp ksenogreftlerle ilişkili damarlardan çok daha az olduğunu göstermektedir (Şekil 1D). Kontrol embriyolarında, B16-F1 hücrelerinin implantasyonu ndan sonra gözlenen tipik anjiyojenik yanıt olan tüm ksenogreft bölgesine (Şekil1D)yayılan geniş bir vasküler ağ vardır. Şekil1F'de anjiyojenik yanıt bu protokole göre ölçüldü ve kontrollere kıyasla VEGFR inhibitörü ile tedavi edilen ksenogreftlerde greft vaskülarizasyonunda belirgin bir azalma göstermektedir. Greft hacmine karşı greft vaskülarizasyon düzeyleri normalleştirilmesine rağmen, 48 hpi (54.2 varyasyon katsayısı) greft vaskülarizasyon düzeylerinde büyük bir varyasyon vardır. Bunun nedeni tümör damarlarının toplam hacmindeki değişimdir (varyasyon katsayısı %73.3); benzer büyüklükteki greftlerin bile vaskülarizasyon düzeyinde büyük farklılıklar olduğunu gözlemledik. Bu nedenle tedavi grubu başına yaklaşık 20 ksenogreft kullanılması önerilir.
Şekil 1D'den ksenogreftle ilişkili damarları quantif etmek için atılan adımlar Şekil2'de gösterilmiştir. Tümör kanalı Şekil 2Atek başına gösterilir , B16-F1 hücreleri floresan etiketli bir kitle (yanlış renkli yeşil) otofloresan görüntüler sarısı kese altında görülebilir. Bir Yatırım Getirisi dikkatle ksenogreft etrafında çizilmelidir (Şekil2A'), Tümör Hacim protokolü daha sonra tümörün bir parçası olarak bu otofloresans belirleyebilir gibi yolk kesesinden herhangi bir otofloresan dahil değil dikkat. Tümör Hacmi protokolünün uygulanması, Yatırım Getirisi'ndeki tüm B16-F1 hücrelerini tanımlar, hacimlerini ölçer ve Yatırım Getirisini hacimlerine bağlar (Şekil2A''). Bu yeni kırpılmış Yatırım Getirisi'nde Tümör Damar Hacmi protokolünün gerçekleştirilmesi, B16-F1 hücrelerinin kütlesi ile ilişkili tüm damarların tanımlanmasını sağlar ve hacimlerini ölçer (Şekil2A''). Tümör Hacmi ve Tümör Damar Hacmi protokollerinden alınan değerler, şekil 1F'degörüldüğü gibi bir grafikte çizilen greft vaskülarizasyonunun bir ölçüsünü vermek için kullanılabilir.
Şekil 1: Zebrabalığı tümörü ksenogreft vaskülarizasyonu VEGFR sinyal inhibitörü ile inhibe edilir. (A-C) GFP etiketli kan damarları (macenta) ile 6 hpi (A), 24 hpi (B) ve 48 hpi (C) canlı embriyokonfokal görüntüleri. % greft vaskülarizasyonu hesaplandı ve ilgili panele dahil edildi. (D-E) 48 hpi'de floresan etiketli B16-F1 ksenogreftli (yeşil) ve GFP etiketli kan damarlarının (macenta) konfokal görüntüleri implantasyondan hemen sonra E3 'de %0,5 (v/v) DMSO (D) veya 50 nm VEGFR inhibitörü (Tivozanib) E3 (E). D ve E için gemi kanalları sırasıyla D' ve E' olarak izole olarak gösterilir. (F) Bu ksenogreftlerde % greft vaskülarizasyonunun 48 hpi, n = 42 (DMSO), n = 20 (VEGFR inhibitörü) olarak ölçülmesinden elde edilen verileri gösteren grafik. **p>0.01 Mann-Whitney testi ile, hata çubukları s.d. Ölçek çubuğu = 50 μm'yi temsil eder. Şekil 1F'de yer alan veriler11'deçoğaltılır.
Şekil 2: Greft vaskülarizasyonunun ölçülmesi. Floresan etiketli B16-F1 ksenogreftli canlı 2 dpi zebra balığı larvalarının konfokal görüntüsü (yeşil) ve GFP etiketli kan damarları (macenta). (A) Bir Yatırım Getirisi çiziminden önce tümör kanalı. (A') Ksenogreft bölgesinin etrafına bir Yatırım Getirisi çizilir ve sarısıdaki otofloresansdahil edilmeyin. (A''( "Tümör Hacmi" protokolü YG içinde ksenogreft hacmini belirlemek için yapılır ve aynı zamanda yeni bir Yatırım Getirisi oluşturur. (Bir''') "Tümör Damar Hacmi" protokolü yeni Yatırım Getirisi içindeki damarların hacmini belirlemek için kullanılır. Ölçek çubuğu = 50 μm.
Ek Film 1: Tümör ksenogreft anjiyogenezi. GFP etiketli kan damarları ile 2 dpf zebra balığı embriyosuna yerleştirilen Bir B16-F1 ksenogreftin konfokal zaman atlamalı görüntülemesi(kdrl:EGFP). Film 20,75 hpi 46 hpi alınır. Zaman atlamalı görüntü z-yığınları 10 dakika arayla toplandı; film saniyede 7 kare yapıldı. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokoldeki ilk kritik adım tümör hücrelerinin implantasyonudur. Hücrelerin, ksenogreftin embriyo ödem yapmadan embriyoya başarılı bir şekilde implant atmasını sağlayacak bir yere enjekte edilmesi esastır. Çok anterior bir enjeksiyon hücrelerin kalbe doğru hareket izin verebilir, kan dolaşımını engelleyen ve ödem yol açan, çok posterior bir enjeksiyon kötü implante ksenogreft neden olurken. Bir anterior enjeksiyon en iyi o enjekte olarak kalpten uzağa işaret ediyor, böylece arka yönde bir ön sarısı kese yoluyla iğne takarak kaçınılır. Bir posterior enjeksiyon en iyi sarısı kesesinin yuvarlak kısmının ön yarısında bir yerde hücreleri enjekte ederek kaçınılır. Buna ek olarak, hücreler yumurta kesesi için ventral enjekte edilmelidir ve yanal değil, yanal konumu görüntülemek ve daha sonra görüntü daha zordur. Araştırmacı bu süreçte makul bir usta olduğunda, yaklaşık 200-300 embriyolar her gün ksenogreftler ile implante edilebilir. Anjiyojenik yanıtın görüntülenmesi, ksenogreftlerin monte edilmesi ve görüntülenmesi için verilen süre nedeniyle daha uzun sürecektir; standart lazer taramalı konfokal mikroskop kullanarak 15-20 ksenogreftin görüntülemi yaklaşık bir saat sürer.
İkinci kritik adım ise 3Boyutlu görüntü analiz yazılımı kullanılarak greft vaskülarizasyonunun ölçülmesidir. Mikroenjeksiyon yoluyla sürekli boyutlu ksenogreftler elde etmek zor olduğundan tümör hacmine göre nicelik gereklidir. Tüm deneyler için doğru ve tarafsız nicel ölçümler elde etmek için yazılım protokollerinin ayarlarını dikkatle kalibre etmek ve sürekli olarak kullanmak gerekir. Minimum yoğunluk eşiğinin belirlenmesi (hem Tümör Hacmi hem de Tümör Damar Hacmi için) protokolün tümör/damarve arka plan floresanının bir parçası olan floresan arasında doğru bir şekilde ayrım yapmasına olanak sağladığından bu adımın önemli bir parçasıdır. Sadece tümör ksenogreftve embriyoherhangi bir parlak otofloresan parçaları (sarısı kese gibi) içerecek şekilde tümör ksenogreft etrafında RoI çizim de önemlidir; herhangi bir tümör dışı otofloresan bölgelerin veya tümör dışı kan damarlarının YG'ye kazara dahil edilmesi, bu parçaların "Tümör hacmi" veya "Tümör Damar hacmi" kapsamında ölçülmesine neden olacak ve son hesaplamada önemli yanlışlıklar yaratacaktır. Anjiyojenik yanıtta her zaman büyük bir varyasyon vardır (Bkz. Şekil 1F),ancak, modelin bir sınırlaması olmaktan ziyade, bu sadece hem insan hastalarında hem de murine ksenogreftlerde gözlenen tümör damar yoğunluğundaki doğal varyansı yansıtabilir. 23.000 , 24- 60 ksenogreftte greft vaskülarizasyonunun niceliği yaklaşık 1 saat sürer.
Farklı memeli hücre hatları arasında indüklenen anjiyojenik yanıtta geniş bir varyasyon olduğu için tümör hücre hattının dikkatli bir şekilde seçilmesi de önemlidir, bu da bu hücreler tarafından üretilen pro-anjiyojenik moleküllerin farklı düzeyleri ile ilgili olabilir4 , 11. Elimizde, B16-F1 fare melanom hücreleri sağlam bir anjiyojenik yanıt vermek, muhtemelen bu hücrelerden VEGFA salgısının yüksek düzeyde nedeniyle11. Bu protokolde yapılacak olası değişiklikler zebra balığı melanom hücrelerinin kullanımı olacaktır, bu da test sıcaklığının 28°'ye düşürülmesini ve bu nedenle hem konak hem de tümör25 veya aşırı ekspres kanser hücrelerinin kullanımı için en uygun uyguluyor. FGF 4,7,20gibi pro-anjiyojenik büyüme faktörleri .
Bu modelin avantajlarından bazıları kısa zaman aralığında, düşük maliyetli ve ksenotransplantasyon işleminin murine ksenogreftler gibi diğer in vivo modellerle karşılaştırıldığında uygulanabileceği göreceli kolaylığında yatmaktadır. büyük ölçekli çalışmalar (yani, anti-anjiyojenik bileşikler için kimyasal ekranlar26). Modeli ve floresan etiketli kan damarları ve diğer hücre tipleri ile transgenik balık ların kullanılabilirliği görüntü canlı yeteneği araştırmacılar anjiyogenez sürecinin ayrıntıları (damar filizlenmesi gibi) yanı sıra hücre hücresi çalışma sağlar bu modelde anjiyogenez sırasında gerçekleşen etkileşimler (makrofaj-endotel etkileşimleri gibi)11,20,27. Damar normalizasyonu da antianjiogenik tedavinin temel amacı olduğundan, ksenogreftlerde vasküler ağın yüksek çözünürlüklü canlı görüntülemesi, bu modelin bu amaca yönelik tedavileri belirleme potansiyeline sahip olduğu anlamına gelir. Ağ tortuosity damar şube sayısı sayılarak incelenebilir, damar morfolojisi damar genişliği varyasyonu ölçülerek incelenebilir, pro-normalizasyon tedavileri test ve bu modelde değerlendirilecektir izin28. Buna ek olarak, floresan mikroanjiyografi tümör damarlarının açıklık ve bütünlüğünü belirlemek için kullanılabilir29. Zebra balığının genetik sistemlenebilirliği de genetik olarak tümör anjiyogenez6 çeşitli konak sinyal yollarının rolünü incelemek için değiştirilebilir anlamına gelir 6. Bu nedenle bu model, tümör ortamında aktif olan yeni anti-anjiyojenik bileşikleri tanımlamak ve tümör anjiyogenezi düzenleyen hücresel ve moleküler etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Auckland Üniversitesi zebra balığı tesisini ve Auckland Tıp Bilimleri Fakültesi Biyomedikal Görüntüleme Araştırma Birimi'ni yönettiği için Bay Alhad Mahagaonkar'a zaman atlamalı konfokal mikroskopi konusunda yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Yeni Zelanda Sağlık Araştırma Konseyi proje hibesi (14/105), Yeni Zelanda Kraliyet Derneği Marsden Fonu Proje Hibesi (UOA1602) ve J.W.A.'ya verilen Auckland Medical Research Foundation Project Grant (1116012) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, Length = 10 cm Cell injection |
| Cell culture dish 35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish 100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1,000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) - alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 G | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25%) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).
- Ribatti, D. Tumor Angiogenesis Assays. , 1st. edn, Humana Press. (2016).
- Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
- Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).
- Zhang, S., et al. SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).
- Muthukumarasamy, K. M., et al. Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).
- Britto, D. D., et al. Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish. BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Eng, T. C. Y., Astin, J. W.
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Nakamura, K., et al. KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties. Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).
- Okuda, K. S., et al. A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis. Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).
- Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).
- Vermeulen, P. B., et al. Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study. British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).
- Heilmann, S., et al. A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish. Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).
- Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges. Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).
- Zhao, C., et al. Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism. Scientific Reports. 6, 19404 (2016).
- Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).
- Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography. Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).
