Summary
מטרת שיטה זו היא ליצור מודל vivo של אנגיוגנזה הגידול על ידי תאי גידול של השתלת מיונקים לתוך העובר הזרע כי יש מתויג כלים של כלי דם. על ידי הדמיה של השתל מבע כלים משויכים, מדידה כמותית של תגובת האנגיוגנטית ניתן להשיג.
Abstract
אנגיוגנזה הגידול הוא יעד מפתח של טיפול נגד סרטן ושיטה זו פותחה כדי לספק מודל חדש כדי ללמוד את התהליך הזה vivo. דג זברה מבע נוצר על ידי שתילת תאים סרטניים מהיונקים לתוך החלל perivitelline של יומיים-לאחר הפריה דג זברה עוברים, ואחריו על ידי מדידת היקף התגובה אנגיוגנטית נצפתה בנקודת הקצה ניסיוני עד יומיים אחרי ההשתלה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת לכמת במדויק את התגובה אנגיוגנטית מארח של דג את השתל. הדבר מאפשר בדיקה מפורטת של המנגנונים המולקולריים, כמו גם את התרומה המארחת לעומת הגידול לתגובה האנגיוגנטית. העוברים יכולים להיות חשופים למגוון טיפולים, כגון דגירה עם תרופות אנטי-אנגיוגנזה פוטנציאליות, כדי לחקור אסטרטגיות למניעת אנגיוגנזה של הגידול. תגובת האנגיוגנטית יכולה להיות גם בעלת התמונה החיה כדי לבחון תהליכים סלולאריים יותר דינמיים. הטכניקה הניסיונית יחסית בלתי תובענית, עלויות תחזוקה זולות של דג דג זברה וזמן ניסיוני קצר להפוך את המודל הזה שימושי במיוחד לפיתוח אסטרטגיות לתמרן אנגיוגנזה הגידול.
Introduction
אנגיוגנזה הוא אחד הסימנים הקלאסיים של סרטן ומייצג יעד של טיפול נגד סרטן1,2. כדי ללמוד את התהליך הזה, xהשתלת מודלים של סרטן נוצרו על ידי השתלת תאים סרטניים היונקים לתוך בעלי חיים כגון עכברים3. מודל דג זברה מבע יש גם פיתח, אשר כרוך ההשתלה של תאים סרטניים לתוך 2 ימים הפריה לאחר (dpi) דג זברה אשר התוצאה צמיחה מהירה של כלי דם דג זברה לתוך השתל מבע.
פרוטוקול זה מתאר vivo דג זברה העובר גידול מודל מבע שבו התגובה אנגיוגנטית ניתן לכמת במדויק על פני השתל כולו מבע שיטה זו מאפשרת לחוקר לבחון, בvivo, את המנגנונים המולקולריים הממפינים את תגובת הגידול האנטי-אנגיוגנטית. היכולת הגנטית של דג דג זברה מאפשר את התרומה המארחת להיחקר, בעוד הבחירה של קווי הגידול השונים תאים מאפשר את תרומת הגידול לאנגיוגנזה גם להיבדק5,6,7. בנוסף, כמו הזחלים דג זברה חדירות מולקולות קטנות, מעכבי מסלול ספציפי ניתן להשתמש או ספריות התרופות ניתן להקרנה כדי לזהות מעכבי הרומן של אנגיוגנזה הגידול8,9,10, . בסדר, 11
מודל העובר של הדג מציג יתרונות ייחודיים בהשוואה למודלים אחרים של היונקים האחרים. Zebrafish xשתלים הם זולים יותר לבצע, מספר גדול של בעלי חיים ניתן לבחון לחיות הדמיה תא מאפשר בדיקה מפורטת של התנהגות התא4. שלא כמו אחרים vivo מודלים, אשר דורשים עד כמה שבועות כדי להתבונן צמיחה כלי משמעותי, אנגיוגנזה ב-דג זברה xenografts ניתן לראות בתוך 24 h בעקבות השרשה3,4. עם זאת, העדר מערכת חיסונית אדפטיבית מתחלקים, בעוד מועיל לשמור על השתל xenograft פירושו התגובה החיסונית אדפטיבית ותרומתו כלפי אנגיוגנזה הגידול לא ניתן לבחון. בנוסף, העדר של תאים סטרומה הגידול, חוסר היכולת להשתיל למריחה על הגידול ואת ההבדל בטמפרטורת התחזוקה בין התאים המרכיניים ותאי היונקים הם חולשות פוטנציאליות של שיטה זו. למרות זאת, היכולת המועלת של מודל זה להדמיה חיה והיכולת לכמת באופן מדויק את תגובת האנגיוגנטית הופכת אותו למועיל בצורה ייחודית ללימוד התהליכים הסלולאריים המייוסתים את האנגיוגנזה של הגידול בvivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מחטי מיקרוהזרקה
- הפעל מיקרופיפטה והגדר את הפרמטרים הבאים (מכויל למודל פולר המיקרופיפטה המופיע ברשימת החומרים): חום, 680; משיכה, 75; מהירות, 40; זמן, 55; לחץ: 530.
- מאבטח מזכוכית בורוסיליקט לתוך הפולר מיקרופיפטה ומשוך את הנימים כדי ליצור שתי מחטים. חזרו על מחטים רבות ככל הנדרש.
2. תרבית תאים לשרשה
הערה: בעת שימוש בפרוטוקול זה, כל התאים הסרטניים בסרטן יכול לשמש עבור השרשה לתוך עוברי דגים כגון xenografts. עם זאת, יש הרבה וריאציה בתגובה אנגיוגנטית הנגרמת בין קווי תאים שונים5,11,12. B16-F1 מורטין תאים מלנומה הוכחו כדי לגרום תגובה אנגיוגנטית חזקה בעוברי דג בתוך11 ולכן הם מתאימים לשימוש בפרוטוקול זה.
- לגדול B16-F1 תאים ב 37 ° c ב 75 ס מ2 בקבוקון באמצעות מדיה הגברת α בתוספת סרום שור העוברי (fbs) לריכוז הסופי של 10% (v/v) ו פניצילין/Streptomycin, כל אחד בריכוז הסופי של 100 Μg/mL.
- הסר את המדיה מ 95-100% confluent 75 ס מ2 בקבוקון של תאים B16-F1 ולשטוף את התאים ב 5 מ ל של טמפרטורת החדר פוספט מתכלה באגירה (PBS).
- להסיר את 5 מ"ל PBS, להוסיף 2 מ ל של טמפרטורת החדר 0.25% טריפסין/ethilen60 37 amiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiis
- הקש על צד הבקבוקון כדי לקבוע אם התאים מתחילים לאבד את ההחזקה שלהם לתחתית הבקבוקון.
- הוסף 8 מ ל של טמפרטורת החדר הגברת-α עם 10% FBS לתוך הבקבוקון, פיפטה נגד הפנימי של הבקבוקון כדי להביא את כל התאים נשאר דבק לתחתית הבקבוקון לתוך ההשעיה ופיפטה הבולם התא לתוך 15 מ ל צינור.
- צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 800 x g, 4-8 ° צ' עבור 5 דקות, מתיף את התקשורת ולהמשיך לתוויות את התאים עם צבע.
3. התוויות B16-F1 תאים עם צבען פלורסנט
הערה: כדי להבדיל בין תאים סרטניים מושתל ותאים אחרים העובר, את התאים הסרטניים חייב להיות מתויג עם צבע פלורסנט המתאים לפני השרשה. ניתן לדלג על שלב זה אם התאים כבר מביעים כתבים פלואורסצנט.
- דגירה 2 מ ל של מדיה-α ללא סרום ב37 ° c.
- הכנת פתרון מניות של הצבע הנבחר ולדלל אותו בטרום הדגירה 2 מ ל של סרום-α חינם מדיה לבצע ריכוז מעשי (דוגמאות של צבעים וריכוזים מתאים B16 F1 תאים מסופקים בטבלה של חומרים).
- פיפטה 1 מ ל של פתרון הצבע לתוך הגלולה התא (משלב 2.6), מערבבים ביסודיות על ידי ליטוף, ולאחר מכן להוסיף 1 מ ל של פתרון צבע ומערבבים.
- מודיית את התאים ואת התערובת צבע ב 37 ° c עבור 40 דקות, ערבוב על ידי טלטול עדין ב 20 דקות.
- צנטריפוגה את השעיית התא ב 800 x g, 4-8 ° צ' עבור 5 דקות.
- ליטוף הסופר ולשטוף את התאים המסומנת על ידי מלטף עם 5 מ ל של PBS.
- צנטריפוגה את ההשעיה התא שוב ב 800 x g, 4-8 ° צ' עבור 5 דקות, מרוב הסופרנטאנט ומניחים את התאים על הקרח עד מוכן השרשה.
הערה: את הגלולה הסופית תא הגידול צריך נפח של 20-40 μL.
4. הכנת עוברים לשרשה
הערה: לבחור קו הטרנסגניים מלאה כי יש כלים פלואורוסקופים כלי דם (g. kdrl: RFP, fli1a: EGFP, וכו ') מיכל בן 13 , . ארבע עשרה
- יומיים לפני השרשה, משריצים את הדגים כפי שתוארו בעבר ואוספים את העוברים15.
הערה: כפי שאנו לא מזריקים דגים אלה בשלב מוקדם, הם לא צריכים להיות שנאספו בתוך 20 דקות של השאיפה כפי שמתואר על ידי רוזן ואח '15, אבל ניתן לאסוף לאחר כמה שעות של הזדווגות. - מניחים את העוברים במנות התרבות 100 מ"מ בצפיפות של כ 100 עוברים/צלחת.
- הוסף 50 mL של E316 (בתוספת עם 5 μl של 1% w/v פתרון מניות מימית של מתילן כחול כדי למנוע זיהום) לכל מנה, לנקות את כל העוברים או פסולת מת לשמור את המנה בחממה כהה ב 28 ° צ' עד מוכן להזרקה.
- ביום 1 פוסט הפריה (dpf), להוסיף 1-פניקסיל-2-thiourea (PTU) לכל מנה כדי לייצר ריכוז סופי של 30 מ"ג/L PTU ב E3. PTU מונע פיגמנטציה, אשר יכול להפריע את היכולת לראות את תאי הגידול ואת כלי הדם.
- ב-2 dpf, השתמש במחטים או בפינצטה כדי לבטל באופן ידני את כל העוברים שלא בקעו. באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט, בחר כעוברים טרנסגניים רבים ככל הנדרש עבור השתלה (50-200).
- לפני השרשה, הרדים העוברים שנבחרו בפתרון של 300 μg/mL Tricaine ב-E3 כדי למנוע תנועה במהלך הליך ההזרקה.
- מילוי צלחת 35 מ"מ עם 2% מתילתאית בפתרון E3 לרבע הנפח של המנה.
- השתמש בפיפטה העברה למקום כ 50 עוברים (למזער את נפח הפתרון E3 גם הועבר) על מתילתאית.
- השתמש בעצת מיקרוטוען לסדר את העוברים כך שכולם יהיו מכוונים אנכית, עם הראש למעלה ועם הצד השמאלי הפונה כלפי מעלה.
הערה: שלבים 4.7-4.9 יכולים גם להתבצע על ידי הסדרת העוברים על בלוק agarose כפי שתוארה בעבר17, אבל בניסיון שלנו, העוברים מסודרים בקלות רבה יותר כאשר מסודר מתילצלולוזה.
5. הזרקת פריבילין של תאים סרטניים ממאני לתוך 2 dpf עוברים
הערה: כדי להבטיח את התאים הנמצאים יחד כשתל כאשר מושתל, התאים חייבים להיות מעורבים יחד עם תערובת מטריצה מסחטות (ECM). תיארנו את הצעדים לעשיית כזה תא/ECM תערובת כאשר משתמשים בתערובת ECM בטבלת החומרים. אם נעשה שימוש במטריצה חלופית, יש לכוונן את השלבים בהתאם.
- לחלק מלאי של ECM לתוך 100 μL האליבטים ב 500 מנורות μL ולאחסן ב-20 ° c עד הצורך.
- להפשיר את סדרת מחלקים של ecm ולהוסיף 100 μl של PBS כדי לדלל את התערובת ל 50% (v/v).
הערה: מדולל 50% ECM ניתן לאחסן ב 4 ° צ' עבור עד 1 חודש. - לערבב את 50% ECM טוב עם הגלולה B16-F1 (משלב 3.7) על ידי ליטוף וערבוב, כדי לייצר תערובת של תאים/ECM ביחס 2:1 ולאחסן את התערובת על הקרח.
- באמצעות פיפטה מיקרונימי, קחו את 3-10 μL של תאים.
- הכנס בזהירות את קצה הפיפטה למחט והוצא את התערובת B16-F1/מטריצה לסוף המחט.
- הכנס את המחט לתוך המחט מחזיק להטות בזווית 45 ° אל המנה.
- לשבור את קצה המחט באמצעות מלקחיים לעשות חור גדול מספיק עבור התאים להיות נפלט מן המחט מבלי לסחוט את התאים.
- הפעל את גליל אוויר הלחץ מוצמד למנגנון ההזרקה ולהפוך את ההזרקה על "רציף" מצב מיד כדי לדחוף את התאים לקצה המחט.
- להסיר את המחט מתוך המנה ולהחליף את המנה עם הומוציטומטר.
- מניחים טיפה של שמן על ההטאמציטוטומטר ומזריקים את המחט פעם אחת על הירידה הזאת.
- לספור את מספר התאים נפלט עם פעימה בודדת באמצעות הומוציטוטומטר ולכייל את המחט כדי להוציא כ 150 תאים לכל פעימה על ידי התאמת משך פעימה.
הערה: הוצאת כמות זו של תאים לדופק ידרוש מספר פולסים כדי להשתיל השתלת xenograft וצלחת. זה ייתן החוקר יותר שליטה על הגודל הסופי של מבע הגידול על ידי מתן להם בינוני להתאים את מספר/מיקום של פולסים כדי להפוך כל מבע גדול או קטן ככל שהם רואים להתאים. - הצבע את המחט לעבר שק החלמון של העובר ולדחוף אותו דרך שק החלמון בכיוון הגחוני עד קצה המחט הגיח מתוך שק החלמון והוא דוחף את האפידרמיס העובריים על הצד הגחוני של העובר רק אחורי הלב.
הערה: מיקום המחט כך שהוא נכנס שק החלמון עובריים הקדמי למיקום הסופי שבו התאים יוצאו. הדבר יבטיח כי התאים יוצאו בכיוון הרחוק מהלב, והפחתת הסבירות להזרקת התאים לתוך הווריד העיקרי. - בזהירות לדחוף את קצה המחט קדימה קצת עד שהוא יצר מרחב (מרחב perivitelline) בין האפידרמיס ואת קרום שק החלמון ולאחר מכן הדופק מזרק להוציא חלק התערובת התא לחלל perivitelline.
- חזור על הפולסים עד 500-800 תאים הוזרק לחלל perivitelline, יצירת הבליטה גלוי המשתרע לפחות חצי הדרך לאורך החלק התחתון של שק החלמון, ולאחר מכן להסיר את המחט מן העובר.
הערה: אם התאים לחסום את המחט או פגומים במהלך ההזרקה, לטהר את המחט על ידי החלפת רגע למצב "רציף" ולאחר מכן חזרה "פולס". זה צריך לבטל את חסימת המחט ולאפשר לתאים להיות נפלט בחופשיות ולא ניזוק. - להמשיך לעשות את אותו הדבר עבור כל העוברים בצלחת, טעינת מחט חדשה עם תאים סרטניים כאשר נדרש.
- לאחר הזרקת כל העוברים, להסיר את המחט ולדחוף את כל העוברים יחד באמצעות טיפ מיקרונימים מיקרו, כך שהם יכולים להיות מוזרקים עם כמעט מתילתאית ככל האפשר.
- להעביר את העוברים לתוך צלחת התאוששות המכילה E3 (עם PTU ו מתילן blue) ולשטוף אותם על ידי בעדינות ללטף E3 סביב העוברים.
הערה: בשלב זה, ניתן לטפל בעוברים הניתנים לטיפול בסמים על-ידי הפרדתם לכלים שונים והוספת פתרון תרופה למנה אחת ופתרון בקרה (כגון רכב התרופות) למנה השנייה. - מודחת העוברים ב 34 ° c ולבצע פעמיים ביום בדיקות כדי להסיר עוברי מתים או מעוחים ממנה.
הערה: 34 ° c נמצאה להיות הטמפרטורה האופטימלית עבור vascularization השתל והיה גם בשימוש על ידי מחקרים אחרים המעסיקים את הייצור העובזיזציה מתחלקים של מודל18. שתלי xenografts להיות מופיע בכל זמן עד 48 hpi (שעות שלאחר ההשתלה).
6. הדמיה חיה
- ב 48 hpi, לזהות 3-5 עוברים בריאים ללא בצקת. הרדים אותם ב-150 μg/mL Tricaine ו הר אותם מתחת לגיל 1% נמוך התכה נקודה (LMP) agarose כפי שתוארה בעבר19.
הערה: כאשר הצמח ממשיך להיות מיסודו, השתמש בעצת מיקרוקפילר כדי לשמור על העוברים ממוקמים מתחת לקצה. - הפעל את מיקרוסקופ הקונמוקד, בקר המיקרוסקופ, לייזרים ותוכנת המחשב לשליטה על המיקרוסקופ.
- מניחים את המנה על מיקרוסקופ קונפאני. באמצעות הגדלה 20x, המים המטרה לטבול העדשה, מיקום מבע במרכז השדה באמצעות הדמיה ברייטפילד.
- לייזרים עירור לבחור כי הם מתאימים לזיהוי הצבע המשמש תווית התאים הסרטניים ואת fluorophore המשמש לתייג את כלי הדם דג זברה.
- להתאים את הרווח עבור כל לייזר לרמה המאפשרת איתור של תאי הגידול וגם כלי הדם.
הערה: לאחר שנקבעו הגדרות מיקוד, להבטיח אלה נשמרים ללא שינוי במהלך הניסוי, כך השוואות ניתן לעשות בין השתלות xenografts - באמצעות ערוץ הלייזר המתאים לתאי הגידול, לקבוע נפח להיות התמונה הכוללת את כל הנפח של השתל xenograft המאפשר לפחות אחד או שניים מקטעים אופטיים או צד של השתל. השתמש במרווחי מקטע הנמצאים סביב 5 יקרומטר מלבד ליצירת מחסנית z.
הערה: הכרחי כי מחסנית z צריך להכיל את כל הנפח של השתל xenograft - באמצעות שני הדמיה הערוץ, התמונה הן הגידול מבע ואת כלי הדם. חזור על שלבים 6.6-6.7 כדי שניתן יהיה לבצע דימות של כל זחל.
7. פקיעה זמן הדמיה
הערה: מודל זה מתאים מאוד לדימות תהליכים סלולריים דינמיים בשל השקיפות שלה ואת הזמינות של מעבר הדגים דג זברה זה תווית סוגי תאים שונים. זה הופך את מעידה בזמן דימות יישום מפתח של מודל זה.
- הפעל את החדר הסביבתי והגדר עד 34 ° c לפחות 2 שעות לפני ההדמיה. אם החדר אינו מחולל לחות, הוסיפו מנות מים.
- הרדים 3-5 עוברים (באמצעות 120 μg/mL Tricaine ב 2 dpf ו 100 μg/mL Tricaine ב 3 dpf) ו הר אותם באופן משני בשנת 0.8% LMP agarose עבור הדמיה זמן לשגות בהתאם לפרוטוקול המתואר בעבר19.
הערה: כאשר הצמח ממשיך להיות מיסודו, השתמש בעצת מיקרוקפילר כדי לשמור על העוברים ממוקמים מתחת לקצה. - הגדר את הציוד ואת התמונה של מבע כפי שמתואר בשלבים 6.2-6.7, רכישת z-ערימות של השתל מבע מרווחי זמן של 10 דקות.
הערה: העובר חייב להיות מתוחזק ב 34 ° c כפי שהוא להיות בתמונה ואת E3 על גבי הזחלים באגר חייב להיבדק מדי פעם כדי להבטיח כי זה לא להתייבש.
8. כימות המענה האנטי-אנגיוגנטי לדגי הזייברפיש
הערה: השלבים הבאים משתמשים בתוכנת ניתוח תמונה תלת-ממדית. שלבים ספציפיים ישתנו בהתאם לתוכנה שבשימוש.
- העבר את מחסנית z קבצי תמונה מוקד של מבע הגידול לתיקייה חדשה בתוכנת ניתוח תמונה תלת-ממדית.
הערה: על מנת לכמת את רמות הגידול של גידולים, פרוטוקולי מדידה חייב להיווצר עם הגדרות מכויל כך שניתן להשתמש בהם כדי למדוד את נפח הגידול או נפח הספינה עבור כל שתלי xenografts - כדי ליצור את "נפח הגידול" פרוטוקול למדידת נפח של xenografts תלי הגידול, ללכת על הכרטיסייה "מדידה" בתפריט העליון ולאחר מכן לגרור את הפרוטוקולים בשם "מצא אובייקטים" מתוך רשימת הפרוטוקולים המופיעה בצד שמאל של החלון לחלל שכותרתו "גרור משימות כאן כדי לבצע מדידות".
- ודא שפרוטוקול זה מוגדר למדוד אובייקטים בערוץ הגידול, ולאחר מכן גרור את הפרוטוקולים הנקראים "קליפ ל-ROIs" ו-"הפוך את ROI מהאוכלוסייה" מרשימת הפרוטוקולים אל "גרור פעילויות כאן כדי להפוך את המידות" למרחב. ודא ששתי פקודות אלה חלות על האובייקטים שזוהו על-ידי "חיפוש אובייקטים".
- לפני כיול ההגדרות של פרוטוקול זה, עבור אל התפריט הנפתח מעל לתווית "Mode" שמשמאל לקצה החלון ובחר בתצוגה "מוקד מורחב".
- בטל את הבחירה בערוצים שאינם סרטניים בחלונית בקצה הימני על-ידי לחיצה על העיגול השחור שמתחת לכל כותרת הערוץ, כך שרק ערוץ הגידול יכול להיראות. השתמש בכלי "ביד חופשית" בחלק העליון של החלון כדי לצייר "אזור של עניין" (ROI) סביב כל נפח הגידול.
הערה: לדאוג להבטיח כי אף אחד מהגידול לא נשאר מתוך ההחזר. פעולה זו תספק אזור לביצוע הפרוטוקול בעת כיול ההגדרות. - בחרו בתווית ' תקציר ' בחלונית שמתחת לתמונה, וקבעו את האפשרות ' הצג ' כדי להציג ' אוכלוסייה 2 '. כדי לכייל, לחץ על הכוכבית במשימה חפש אובייקטים, שתפתח את חלון ההגדרות. כוונן את "הסף" באמצעות "עוצמה" וקביעת הסף "התחתון" עד שרק תאי הגידול ייבחרו ולא את הזריחה ברקע.
הערה: זה חשוב כך שרק את הזריחה מן התאים הסרטניים ב ROI הנבחר (שצויר ב-8.5) מזוהה ואף אחד לא הזריחה הרקע נמדד. - קבע את "גודל האובייקט המינימלי" כך שרק תאים שלמים נמדדים בניגוד לפריטים קטנים יותר של פסולת תא (לדוגמה, על-ידי הגדרת "גודל האובייקט המינימלי" כ-100 יקרומטר3). שמור פרוטוקול זה כמו "נפח גידול" על-ידי לחיצה על הכרטיסיה מדידות בתפריט העליון ולחיצה על "שמור פרוטוקול", ולהשתמש באותן הגדרות למדידת כל שתלי xenografts
- כדי למדוד את עוצמת הקול של כלי הדם הקשורים xenograft, יהיה עליך ליצור פרוטוקול חדש. עבור אל התפריט העליון, לחץ על הכרטיסיה מדידות ולחץ על "נקה פרוטוקול". גרור את המשימות "חפש אובייקטים" ו-"קליפ אל ROIs" לתוך השטח הנקרא "גרור משימות כאן כדי לבצע מדידות" עבור פרוטוקול זה.
- ודא שהפקודה הראשונה מוגדרת למדידת אובייקטים בערוץ כלי הדם ושהפקודה הבאה מוגדרת להחלה על האובייקטים שזוהו על-ידי הפקודה הראשונה. לאחר מכן בטלו את הבחירה בערוצים שאינם כלי קיבול בחלונית השמאלית הרחוקה, כך שרק כלי הדם יכולים להיראות.
- קבע את ההגדרות עבור "עוצמת הקיבול" באופן דומה לפרוטוקול "עוצמת הגידול" ושמור פרוטוקול זה כ"אמצעי אחסון" (ראה 8.6-8.7).
- נקה את הפרוטוקול וצייר ROI סביב השתל xenograft לוקח לדאוג לא לכלול את כל הגידול האוטומטי שאינם סרטניים. מדוד את סכום הנפח של האובייקטים בערוץ הגידול בתוך ROI זה על ידי לחיצה על הכרטיסיה מדידות, בחירת הפקודה "שחזור פרוטוקול" ובחירה בפרוטוקול "נפח גידול".
- באמצעות התשואה החדשה שבוצעו על-ידי פרוטוקול "נפח גידול", השתמש בפרוטוקול "נפח קיבול" כדי למדוד את הנפח הכולל של אובייקטים בערוץ כלי בתוך ROI זה על ידי לחיצה על הכרטיסיה מדידות, בחירת הפקודה "שחזור פרוטוקול" ובחירה "כלי פרוטוקול.
- לחלק את נפח הספינה על ידי נפח הגידול ולהכפיל את התשובה על ידי 100 כדי לקבל ערך באחוזים של השתל שכפול.
- חזור על שלבים 8.11 כדי 8.13 עבור כל שתלי xenografts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על-ידי הדמיה של השתלת מניות בודדות ב-6, 24 ו-48 hpi, ניתן לחשב את תגובת האנגיוגנטי בנקודות זמן שונות כמוצג באיור 1A-C. התגובה הגדולה ביותר של אנגיוגנטי נצפתה בין 24-48 h השתלת פוסט, עם רמות מקסימלית של השתל vascularization לראות סביב 2 dpi (איור 1A-C). סרט הזמן לפקיעה של תגובת אנגיוגנטית טיפוסית B16-F1 מבע שתל מ 20.75 hpi עד 46 hpi הוא נראה בסרט המשלים 1. הסרט הזה נוצר על ידי הדמיה מבע מושתל בעקבות פרוטוקול זה לתוך 2 dpf kdrl: העובר egfp . כלי הגידול דרך השתל מבע טופס רשת מפותל עם כלי של גודל בלתי סדיר מורפולוגיה, אשר אופייני לרשת כלי הדם נורמלי לראות גידולים יונקים20. התגובה האנגיוגנטית במודל שלנו היא תוצאה של כלי שנבט מן הווריד הקרדינל המשותף לתוך השתל מבע עומת המחקרים הקודמים, אשר דיווחו על ורידים התת מעיים כמקור של כלי הגדלים לתוךהשתל מבע. ההבדל במקור הספינה נובע העובדה שאנחנו יש לנו מושתל שתלי xenografts לנו במיקום יותר ויותר באזור perivitelline, כמו זה עושה את זה קל יותר לדמיין את הצורה ואת הגודל של xenografts תוך הזרקת והדמיה20.
איור 1D -F מציג את התוצאות הייצוגיות של B16-F1 xenografts ושלהם ואצלב המשויכים שלהם בעקבות הטיפול עם dmso (שליטה) או 50 ננומטר של מעכב ווגאן (Tivozanib)21,22. מיד לאחר השרשה, עוברי הקבוצה הפכו לשתי קבוצות ו-50 ננומטר Tivozanib או DMSO (0.5% v/v) הוחל על כל אחת מהקבוצות. הם החזיקו בסמים האלה לפני הדמיה ב-2 dpi. תוצאות אלה מראים כי כלי הקשורים לשתלי xenografts מעכב ב-מעכב ומעכבי (איור 1e) הם הרבה פחות רבים מאשר כלי המשויכים xenografts תלי מודבטים ב dmso (איור 1e). במהלך השליטה, יש רשת כלי דם ולקיבולת המשתרעת על פני האזור השלם של מבע (איור 1d), שהיא תגובה אנגיוגנטית טיפוסית נצפתה בעקבות השרשה של B16-F1 תאים. באיור 1F, התגובה האנגיוגנטית כבר בכמת על ידי ביצוע הפרוטוקול הזה והוא מראה ירידה ברורה השתל vascularization ב-מעכבי מעכב הטיפול של המעכב בהשוואה לפקדים. למרות נרמול רמות השתל vascularization נגד נפח השתל, יש עדיין וריאציה גדולה ברמות של השתל vascularization ב 48 hpi (מקדם של וריאציה של 54.2%). זה נובע הווריאציה בנפח הכולל של כלי הגידול (מקדם של וריאציה 73.3%); הבחנו כי גם שתלי בגודל דומה היה וריאציה גדולה ברמה של vascularization. בגלל זה, מומלץ כי סביב 20 xשתלים משמשים לכל קבוצת טיפול.
השלבים שננקטו כדי לכמת את הכלים המשויכים לשתל מבע איור 1d מוצגים באיור 2. ערוץ הגידול מוצג לבדו באיור 2A, שם מסה של B16-F1 תאים מתויג (ירוק בצבע שווא) ניתן לראות מתחת שק החלמון, אשר מציג פלואורסצנטית אוטומטי. ההחזר חייב בקפידה להיות מצויר סביב מבע (איור 2a),לוקח לדאוג לא לכלול את הקרינה האוטומטית מן שק החלמון כמו פרוטוקול נפח הגידול יכול לזהות את זה בלתי מדומה במסגרת הגידול. ביצוע פרוטוקול נפח הגידול מזהה את כל התאים B16-F1 ב-ROI, מודד את אמצעי האחסון שלהם ומהדקים את התשואה על אמצעי האחסון שלהם (איור 2A). ביצוע הפרוטוקול הגידול כלי נפח התשואה החדשה הזאת מאפשר זיהוי של כל כלי הקשורים המסה של תאים B16-F1 ומודד את העוצמה שלהם (איור 2A''). הערכים של נפח הגידול והפרוטוקולים כלי קיבול הגידול ניתן להשתמש כדי לתת מידה של השתל vascularization אשר מותווים אז בגרף כפי שנראה באיור 1F.
איור 1: zebrafish גידול מבע vascularization הוא מעוכב על ידי מעכבי איתות של ווfr. (א-ג) תמונות קונמוקד של עובר חי ב-6 hpi (א), 24 hpi (ב) ו 48 hpi (ג), עם כלי דם מתויג באמצעות gfp (מגנטה). The% השתל vascularization היה מחושב ונכלל בפאנל המתאים. (D-E) תמונות confocal וקד של הזחלים חי דג זברה הראו ב 48 hpi עם מתויג במהירות B16-F1 xenografts (ירוק) ו-gfp מתויג כלי דם (מגנטה) אשר טופלו מיד לאחר השרשה עם 0.5% (v/v) dmso ב E3 (ד) או 50 nm של מ מעכב מדכא (Tivozanib) ב-E3 (ה). ערוצי כלי עבור D ו- e מוצגים בבידוד D' ו- e,בהתאמה. (ו) גרף הצגת הנתונים מפני ככמת את השתל% vascularization ב 48 hpi ב אלה שתלי xenografts n = 42 (dmso), n = 20 (מעכב מעכבי). * * p > 0.01 על ידי מבחן מאן-ויטני, ברים שגיאה לייצג ש גויטיין Scale בר = 50 μm. הנתונים הנכללים באיור 1F משוחזרים ל-11.
איור 2: השתלת כימות השתל. התמונה הקונקקלית של 2 dpi הזחלים מדגים עם מתויג B16-F1 שתלי (ירוק) ו-GFP מתויג כלי דם (מגנטה). (A) הגידול בערוץ לפני ציור של ROI. (א) ROI מצויר סביב אזור מבע, ומוודא כי הפלואורסצנטית האוטומטי בחלמון אינו כלול. (א') The "נפח גידול" הפרוטוקול מבוצע כדי לזהות את הנפח של מבע בתוך התשואה וגם יוצר ROI חדש. (א') הפרוטוקול "עוצמת הגידול של כלי הדם" משמש כדי לזהות את עוצמת הכלים בתוך התשואה החדשה. סרגל קנה מידה = 50 μm.
סרט משלים 1: אנגיוגנזה הגידול מבע. Confocal וקד זמן הדמיה של B16-F1 מבע מושתל לתוך 2 dpf דג זברה העובר עם כלי דם מתויג gfp (kdrl: egfp). הסרט נלקח מ 20.75 hpi כדי 46 hpi. תמונה בזמן שפקיעה z-ערימות נאספו 10 דקות בנפרד; הסרט נעשה ב -7 מסגרות לשנייה. סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצעד הקריטי הראשון בפרוטוקול הוא השרשה של תאי הגידול. חיוני כי התאים מוזרק לתוך מיקום שיאפשר מבע להשתיל בהצלחה העובר מבלי להפוך את העובר מתרפס. זריקה הקדמי מדי יכול לאפשר לתאים לנוע לעבר הלב, חסימת הדם והמוביל בצקת, בעוד הזרקה כי הוא האחורי יותר מדי יגרום מושתל לקוי xenograft. הזרקה קדמית היא הטובה ביותר להימנע על ידי החדרת המחט דרך שק החלמון בכיוון הקדמי לכיוון אחורי, כך שהוא מצביע הרחק מהלב כפי שהוא מזריק. הזרקה האחורי היא הטובה ביותר להימנע על ידי הזרקת התאים במיקום במחצית הקדמית של החלק העגול של שק החלמון. בנוסף, התאים חייבים להיות מוזרק ומוזרקים אל שק החלמון ולא לרוחב זה, כמו המיקום לרוחב קשה יותר להציג ולאחר מכן תמונה. לאחר החוקר הוא מיומן באופן סביר בתהליך זה, כ 200-300 עוברים ניתן להשתיל עם xenografts תלי בכל יום. הדמיה של התגובה אנגיוגנטית ייקח זמן רב יותר עקב הזמן שנלקח להר והתמונה של xenografts; זה לוקח בערך שעה לתמונה 15-20 xenografts באמצעות תקן לייזר לסרוק מיקרוסקופ קונפוקלית וקד.
הצעד הקריטי השני הוא המדידה של vascularization השתל באמצעות תוכנת ניתוח תמונה תלת-ממדית. כימות על ידי נפח הגידול נדרש כפי שקשה להשיג בעקביות בגודל xenografts דרך מיקרוהזרקה. יש צורך לכייל את ההגדרות של פרוטוקולי התוכנה בקפידה ולהשתמש בהם בעקביות כדי לקבל מדידות כמותית מדויקת ומשוחדת עבור כל הניסויים. הגדרת הסף המינימלי לעוצמה (עבור שניהם נפח גידול ונפח הגידול כלי) הוא חלק חשוב של שלב זה כפי שהוא מאפשר את הפרוטוקול להפלות בצורה נכונה בין הזריחה כי הוא חלק של הגידול/כלי הדם והרקע. ציור הROI סביב מבע הגידול כדי לכלול רק את מבע הגידול לא כל חלקים autofluorescing בהיר של העובר (כגון שק החלמון) חשוב גם; הכללה מקרית של כל האזורים שאינם הגידול autofluorescing או כלי דם שאינם סרטניים לתוך ROI יביא חלקים אלה נמדדת כחלק "נפח הגידול" או "הגידול כלי נפח", יצירת אי-דיוקים משמעותיים בחישוב הסופי. יש תמיד וריאציה גדולה בתגובה אנגיוגנטית (ראה איור 1F), לעומת זאת, במקום להיות מגבלה של המודל, זה עשוי רק לשקף את השונות הטבעית צפיפות כלי הגידול נצפתה בשני חולי האדם מורטין xenografts מיכל בן 23 , 24. כימות של השתל vascularization ב 60 xשתלים ייקח כ 1 h.
בחירה זהירה של קו תא הגידול חשוב גם כאשר יש וריאציה רחבה בתגובה אנגיוגנטית הנגרמת בין קווי היונקים השונים תאים שונים, אשר עשויים להתייחס לרמות שונות של מולקולות pro-אנגיוגנטי המיוצר על ידי תאים אלה4 , 11. בידינו, B16-F1 תאים מלנומה העכבר לתת תגובה אנגיוגנטית חזקה, אולי בשל הרמה הגבוהה של הפרשת והוא מתאים אלה11. שינויים אפשריים בפרוטוקול זה יהיה שימוש בתאי מלנומה דג זברה, אשר תאפשר את טמפרטורת השימוש להיות הוריד 28 ° ולכן להיות אופטימלי הן המארח הגידול25 או השימוש בתאים סרטניים כי overexpress גורמי צמיחה פרו-אנגיוגנטיים כגון fgf4,7,20.
כמה יתרונות של מודל זה שוכב בטווח זמן קצר שלה, עלות נמוכה, ואת הקלות היחסית שבה ההליך xenotransplantation שתלת ניתן לבצע לעומת אחרים במודלים vivo כגון מורטין xenotransplantation, כל מה שעושה את זה מאוד נוח לשמש מחקרים בהיקפים גדולים (כלומר, מסכי כימיות לתרכובות אנטי-אנגיוגנטיים26). היכולת לחיות תמונה של המודל ואת הזמינות של דגים טרנסגניים עם כלי דם מתויג פלואורוסקופים וסוגי תאים אחרים מאפשר לחוקרים ללמוד את הפרטים של תהליך האנגיוגנזה (כגון לבלוב הספינה), כמו גם תא התא אינטראקציות (כגון אינטראקציות מקרופאג-אנדותל) המתרחשים במהלך האנגיוגנזה בדגם11,20,27. כמו נורמליזציה כלי הוא גם מטרה מרכזית של טיפול אנטי-אנגיוגנטי, ברזולוציה גבוהה לחיות הדמיה של הרשת כלי הדם של xenografts פירושו מודל זה יש את הפוטנציאל לזהות טיפולים המכוונים במטרה זו. Tortuosity הרשת יכול להיבדק על ידי ספירת מספר ברנדי הספינה, בעוד המבנה הכלי יכול להיבדק על ידי מדידת וריאציה ברוחב הספינה, המאפשר טיפולי הנורמליזציה פרו להיבדק והעריכו במודל זה28. בנוסף, ניתן להשתמש במיקרואנגיוגרפיה פלואורסצנטית כדי לקבוע את הפטנטיות והשלמות של כלי הגידול29. העקבות הגנטיות של דג דג זברה גם אומר שזה יכול להיות שונה גנטית כדי לבחון את התפקיד של מסלולים שונים איתות מארח באנגיוגנזה הגידול6. מודל זה יכול לשמש כדי לזהות תרכובות אנטי-אנגיוגנטיים הרומן הפעילים במסגרת הגידול, כמו גם לימוד האינטראקציות הסלולר והמולקולרי המסדירים אנגיוגנזה של הגידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים למר אליש מאהגאונקאר לניהול מתקן הבית של אוניברסיטת אוקלנד והיחידה לחקר הדמיה ביו-רפואית, ביה ס למדעי הרפואה, אוניברסיטת אוקלנד, לסיוע במיקרוסקופיה קונפוקלית. עבודה זו נתמכת על ידי מועצת מחקר הבריאות של ניו זילנד מענק הפרויקט (14/105), החברה המלכותית של ניו זילנד מרסדן קרן מUOA1602 פרויקט מענק () ו אוקלנד מחקר רפואי קרן פרויקט גרנט (1116012) הוענק J.W.A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD = 1.00 mm, ID = 0.78 mm, Length = 10 cm Cell injection |
| Cell culture dish 35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish 100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1,000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) - alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 G | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25%) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).
- Ribatti, D. Tumor Angiogenesis Assays. , 1st. edn, Humana Press. (2016).
- Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
- Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).
- Zhang, S., et al. SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).
- Muthukumarasamy, K. M., et al. Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).
- Britto, D. D., et al. Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish. BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Eng, T. C. Y., Astin, J. W.
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Nakamura, K., et al. KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties. Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).
- Okuda, K. S., et al. A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis. Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).
- Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).
- Vermeulen, P. B., et al. Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study. British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).
- Heilmann, S., et al. A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish. Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).
- Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges. Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).
- Zhao, C., et al. Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism. Scientific Reports. 6, 19404 (2016).
- Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).
- Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography. Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).
