Summary
Биологический мембранный синтез катализируется специализированными белками синтеза. Измерение фусогенных свойств белков может быть достигнуто путем липидных анализов смешивания. Мы представляем метод очистки рекомбинантного дрозофила атластина, белка, который опосредует гомотипическое слияние ER, воссоздавая его до предварительно сформированных липосом и тестируя на способность синтеза.
Abstract
Мембранный синтез является решающим процессом в эукариотической клетке. Специализированные белки необходимы для катализа синтеза. Аластины являются эндоплазмическими белками-резидентами (ER), замешанными в гомотипическом слиянии ER. Мы подробно здесь метод очистки глутатион S-трансферазы (GST) и поли-гистидин помечены Drosophila atlastin двумя раундами сродства хроматографии. Изучение реакции синтеза в пробирке требует очищенных белков синтеза, которые должны быть вставлены в липидный двухслойный. Липосомы являются идеальными модельными мембранами, так как липидный состав и размер могут быть скорректированы. С этой целью мы описываем метод восстановления моющего средства для удаления дрозофилы атластин в предварительно сформированные липосомы. Хотя несколько методов восстановления доступны, восстановление моющих средств удаления имеет ряд преимуществ, которые делают его пригодным для атластинов и других подобных белков. Преимуществом этого метода является высокая урожайность восстановления и правильная ориентация восстановленного белка. Этот метод может быть распространен на другие мембранные белки и для других применений, которые требуют протеолипомы. Кроме того, мы описываем FRET основе липидных смешивания ассси протеолипомы, используемые в качестве измерения мембранного синтеза.
Introduction
Мембранный синтез является критическим процессом во многих биологических реакциях. При биологических условиях слияние мембран не является спонтанным и требует специализированных синтеза белков для катализировать такие реакции1. ER гомотипический мембранный синтез опосредования у животных динамина связанных GTPase атластина2. Роль Аластина в гомотипическом синтезе имеет основополагающее значение для трехсторонних узлов в периферийных ER, который представляет собой большую взаимосвязанную сеть труб, которые простираются по всей клетке. Аластины имеют сохраненную морфологию домена, состоящую из большого GTPase, три спирали расслоение среднего домена, гидрофобный якорь мембраны, и короткий цитоплазмический C-терминал хвост3. Исследования в пробирке с рекомбинантным дрозофила атластина показали, что при восстановлении липосомы, он сохраняет свои фузогенные свойства. Другие аластины, в том числе человеческие омологи, не смогли резюмировать синтез в пробирке. Мы описываем здесь методологию для очищения GST и поли-гистидина помечены рекомбинантных Drosophila atlastin, восстановление его липосомы, и отслеживание слияния.
Изучение мембранного синтеза в пробирке представляет собой проблему, как фусогенные белки, как правило, мембраны якорь. Для того, чтобы изучить их, необходимо воссоздать их в модель липидных двухслойных. Большие униламеллярные пузырьки (LUV) являются полезным инструментом для изучения взаимодействия липидных белков. Мы представляем здесь систему, чтобы сделать LUVs различных липидных композиций для восстановления белка и синтеза анализов. Восстановление интегральных белков в LUVs может быть достигнуто с помощью различных методов, включая, органический растворитель опосредоченной реконституции, механические механизмы, или моющее средство при содействии восстановления4. Мы представляем здесь метод для воссоздания Drosophila атластина в предварительно сформированные липосомы путем удаления моющего средства. Преимущества этого метода восстановления включают высокие урожаи восстановления и правильную ориентацию атласина в липидном двухслойном. Кроме того, с помощью этого метода, белок не высушивается или подвергается воздействию органических растворителей, тем самым сохраняя структуру и функцию. Среди его недостатков, наличие моющих средств не может быть идеальным для всех белков и окончательные протеолипосомы могут иметь некоторые включены моющего средства в липидный двуслой. Дальнейший диализ может быть использован для устранения большего количества моющего средства. Тем не менее, диализ может занять много времени и, следовательно, может привести к потере белковой активности.
Оценка синтеза активности атластин может быть определена липидных смешивания анализы, как ранее описано2. Здесь мы разграничив метод измерения атластина опосредованного синтеза через N-(7-нитробенц-2-окса-1,3-диазол-4-ил (NBD)/Лиссамин родамин-B сульфонил (родамин) помечены липидов. Этот ассеид требует слияния доноров (помеченных) протеолипосом и приемотеля (немаркированных) протеолипосом. Освобождение FRET может быть измерено во время реакции как разбавление пары донора-приемника от "помеченных" липосом до "немаркированных" липосом в результате перемешивания липидов во время мембранного синтеза (Рисунок 1)5. Хотя этот показатель служит прокси для мембранного синтеза, он ограничен в различении мембранного синтеза и гемифузии, состояние, в котором смешиваются только внешние листовки. Для решения этой проблемы, альтернативой является внешняя листовка закалки NBD dithionite. Следуя той же методологии, как NBD / родамин липидных анализов, при закалке внешней листовки любой релиз NBD FRET путем слияния будет связано с внутренней листовки смешивания8.
Альтернативные анализы синтеза внутренним ваквистым содержанием смешивания адрес полного слияния только5. Примерами этого являются анализы тербия (Тб)/дипиколининовой кислоты (DPA) и анализы аминонафталенной трисульфонной кислоты (ANTS)/p-xylene bis (pyridinium) бромид (DPX). В Тб/ДПА анализы, пул липосом с инкапсулированным Тб смешиваются и сливается с липосомы с инкапсулированными DPA; при слиянии, флуоресценция увеличивается за счет внутренней передачи энергии от DPA к ТБ в рамках «Tb (DPA)3»3- хелатоэнсивный комплекс6. В отличие от этого, для ANTS / DPX анализы, ANTS флуоресценция угасает DPX7. В то время как эти системы решают проблему внутреннего смешивания содержимого, для удаления неинкапсулированных реагентов требуется более углубленное приготовление липосом, а также непреднамеренное взаимодействие флюорофоров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Очистка GST-DAtl-His8
-
Выражение белка и препарат лицизм
- Преобразуйте BL21 (DE3) E. coli с конструкцией GST-DAtl-His8 в pGEX4-T32 и выберите на пластине ампициллина.
- Выберите один трансформировать и привить 5 мл LB и ампициллин (5 л 100 мг/мл ампициллин) в 14 мл культуры трубки и инкубировать при 25 градусов с тряской при 200 об/мин для 6-8 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за протекающей экспрессии не рекомендуется инкубировать при более высоких температурах. Рост на 25 градусов по Цельсию снижает агрегацию белка в этот период роста. - Прививать 200 мл ЛБ и ампициллин с 1 мл культуры 5 мл и инкубировать ночь (15-18 л) при 25 градусах Цельсия.
- На следующее утро, урожай клеток центрифугации (2000 х г в течение 10 минут) и повторно в 5 мл LB.
- Прививать 4 l LB и ампициллина и измерять OD600 (0.05-0.15). Инкубировать при 25 градусах Цельсия с встряхиванием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зарезервируйте некоторые носители, чтобы служить пустым для измерений OD600 перед добавлением бактерий. - Измерьте OD600 каждый час, пока он не достигнет ОД между 0,4-0,5. В этот момент, снизить температуру до 16 градусов по Цельсию.
- Побудить с 0,2 мМ IPTG (800 л из 1 M запаса), 10 мин после инкубатордостигает 16 градусов по Цельсию. Инкубировать на ночь (15-18 ч) при 16 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более низкая температура повышает урожайность функционального белка за счет уменьшения агрегации атластина. - На следующее утро, урожай клеток центрифуги на 7500 х г при 4 градусах Цельсия.
- Приостанавливай теклетки в 200 мл А200 (25 мМ HEPES (pH 7.4) и 200 мМ KCl).
- Центрифуги клетки на 11000 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
- Приостановите гранулы в 40 мл ломая буфера (A200 плюс 10% глицерол, 2 мМ 2-mercaptoethanol, 4% Тритон X-100 (TX100), 40mM имидазол, и один EDTA-бесплатный протеазы ингибитор коктейль таблетки).
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить TX-100 после повторной приостановки, чтобы избежать генерации пузырьков и пены. - Пройдите через иглу 18 G и запустить клетки через ячейку разрушитель три раза на 10000 пси.
- Центрифуга экстракт на 125000 х г на 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно растворить гранулы 1:2 (w:v) в 8 M urea и nutate при комнатной температуре на ночь. Мочевина в качестве денатуранта будет медленно растворять любой нерастворимый пеллетный белок для анализа SDS-PAGE. Сохранить 1 Зл для SDS-PAGE и Coomassie анализ пятен. - Фильтр экстракт апробировать через 0,45 мкм целлюлозы нитрата стерильной мембраны фильтр для удаления бактерий и крупных бактериальных мусора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно, сохранить 1 Зл для SDS PAGE и Coomassie анализ пятен.
-
Очистка белка по хроматографии сродства
- Загрузите фильтрованный лисат на обездвиженную металлическую хроматографию сродства (IMAC) колонку с госизменой, заряженную Ni2,предварительно уравновешенный с низким буфером имидазола (A100 плюс 10% глицерол, 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 1% TX-100, 40 мМ imidazole) мин при 4 градусах по Цельсию.
- Вымойте колонку с 25 мл A100 плюс 10% глицерола, 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1% Анапо X-100, 40 мМ имидазол а скорость 1 мл/мин при 4"C. Вылейте белок с линейным градиентом 30 мл имидазола от 40 мМ до 500 мМ и окончательной 5 мл мыть на 500 мМ.
- Бассейн вместе пик фракций и инкубировать в течение 1 ч при 4 КС с опухшими GSH-Agarose бусы, ранее опухшие в воде и уравновешенный в A100 с 10% глицерола, 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1% Anapoe X-100, и 1 мМ EDTA.
ПРИМЕЧАНИЕ: ГШ-Агарозе бусы могут быть опухшие в 50 мл воды накануне и инкубировать на ночь при 4 кв С, или для 1 ч на RT. Чтобы удалить воду и уравновешиваете буфер, центрифуга в размахивая ротор ведро на 500 х г в течение 1 мин без тормоза. Аспирируй супернатант с помощью иглы 26 G. - ПеллетG-Agarose бусы центрифугирование в размахивая ротор ведро на 500 х г без тормоза и удалить лизат супернатант устремлением с 26 G иглы.
- Перенесите бусины в полипрепную колонку 10 мл и промойте пять раз 5 мл буфера равновесия (A100 с 10% глицерола, 2 мМ 2-меркаптоэтанолом, 0,1% Anapoe X-100 и 1 мМ EDTA) центробежкой на 500 х г.
- Выявите белок с 1-1,5 мл окулистого буфера, дополненного 10 мМ уменьшенным глутатионом. Aliquot eluted белок и флэш заморозить в жидком азоте. Белок можно хранить при -80 градусов по Цельсию на неопределенный срок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте pH буфера elution до 7.4. - Количественное содержание белка путем ассировки 9 асссы 9 и оценить чистоту sDS-PAGE и Coomassie окрашивания.
2. Восстановление рекомбинантного аластинанта в липосомы
- Производство липосомы методом экструзии 10 Лет
- Сделать липидные смеси запасов в хлороформ (10 мМ общей липидов). Необходимые липиды 1-пальмитойл-2-олеойл-глицеро-3-фосфохолин (POPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-фосфо-L-серин (DOPS), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-фосфоэтаноламин-N-(7-нитро-2-1,3-бензоксадиазол-4-yl) (NBD-DPPE), и 1,2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-фосфоэтаноламин-N-(лиссамин родамин B сульфонил) (Rh-DPPE). Липосомы-асомы принимаются из POPC: DOPS (коэффициент моляров 85:15) и донорских липосом POPC:DOPS:Rh-PE:NBD-PE (83:15:1,5:1,5 молярного соотношения).
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как ЛИПидные смеси POPC:DOPS традиционно используются для анализа липидов in vitro, альтернативные липидные композиции могут быть адаптированы для различных экспериментальных целей. POPC:DOPS липосомы очень стабильны и труднее предохранитель, поэтому является очень жесткой системой для синтеза. - Добавьте в липидные смеси 1 кс/мл L-й-дипалмитойл-фосфатидилхолина (холин метил-3H) в липидные смеси для определения концентрации липидов на более поздних шагах путем подсчета жидкой сцинтилляции. Зарезервируйте не менее 8 л этой акции.
- Перенос нужного количества липидных смесей в кремневые стеклянные трубки.
- Сухие липидные смеси под нежным потоком газа N2 в течение 10 мин до тех пор, пока не будет видно больше хлороформа.
- Высушите липидную пленку далее в сушилке, пылесосив в течение 30 минут.
- Добавьте достаточное количество aqueous A100 с 10% глицерол, 2 мМ 2-меркаптоэтанол, и 1 мМ EDTA в липидной пленки и вернуть концентрацию до 10 мМ. Приостановите липидную пленку, слегка провисая в течение 15 минут при комнатной температуре. Рекомендуется вихрь, который может вместить кремневые стеклянные трубки рекомендуется.
- Заморозить-оттепель гидратированных липидов в жидком азоте в десять раз. После замораживания в жидком азоте, разморозить липосомы, позволяя раствору сидеть при комнатной температуре в течение 30 с, а затем передать в воду для более быстрого оттаивания. Этот цикл замораживания-оттепели сведет к минимуму многоламеллярные пузырьки.
ПРЕДЕКТО: Трубы могут трескаться, если они содержат объемы больше 0,5 мл, и если они передаются непосредственно образуют жидкий азот в воду. - Передайте липид через поликарбонатные фильтры с размером 100 нм пор 19 раз с помощью мини-экструдера.
- Определение общей липидной концентрации липосом путем подсчета сцинтилляции
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые из липидов могут быть оставлены в стеклянных трубках и в мини-экструдере.- Добавьте 4 л липидного бульона и липосом в 3 мл сцинтилляционного коктейля.
- Измерьте средние количества в минуту (CPMA) для акций и липосом. И рассчитать концентрацию липосом со следующей формулой:
- Храните липосомы при 4 градусах По Цельсию в течение недели. Более длительное хранение не рекомендуется, так как липосомы могут агрегироваться со временем, уменьшая эффективность восстановления.
- Сделать липидные смеси запасов в хлороформ (10 мМ общей липидов). Необходимые липиды 1-пальмитойл-2-олеойл-глицеро-3-фосфохолин (POPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-фосфо-L-серин (DOPS), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-фосфоэтаноламин-N-(7-нитро-2-1,3-бензоксадиазол-4-yl) (NBD-DPPE), и 1,2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-фосфоэтаноламин-N-(лиссамин родамин B сульфонил) (Rh-DPPE). Липосомы-асомы принимаются из POPC: DOPS (коэффициент моляров 85:15) и донорских липосом POPC:DOPS:Rh-PE:NBD-PE (83:15:1,5:1,5 молярного соотношения).
- Восстановление моющим средством помогло включение в предварительно сформированные липосомы
- Рассчитайте количество буфера, белка, липосомы и дополнительного моющего средства, которое необходимо смешать:
- Определите желаемый общий объем. Этот объем состоит из буфера A100 с 10% глицерола, 2 мМ 2-меркаптоэтанол, и 1 мМ EDTA. Объемы менее 250 л не хорошо смешиваются в микроцентрифуговых трубках 0,5 мл.
- Рассчитайте объем липосом, необходимых для того, чтобы дать окончательную концентрацию липидов около 1 мМ. Вычесть объем из объема буфера.
- Рассчитайте объем белка, необходимого для придав желаемому белку липидное молярное соотношение (обычно 1:400). Уменьшите объем буфера соответственно.
- Определите, сколько дополнительного моющего средства должно быть добавлено, чтобы насытить липосомы, направленные на эффективное моющее средство к липидного соотношения (Reff) между 0,64-0,8. Не забудьте рассмотреть моющее средство, которое добавляется с белком. (Reff) определяется
уравнением DВсего является общая концентрация моющего средства и Dвода мономерной концентрации моющего средства (0,18 мМ для TX-100 и Anapoe X-100 в присутствии моющего средства)4, 11.
- Смешайте растворы в трубке 0,5 мл в следующем порядке: буфер, моющее средство, белок и липосомы. Добавить липосомы быстро и вихрь сразу в течение 5 с, чтобы гомогенизировать смесь.
- Инкубировать реакцию в nutator для 1 ч при 4 c.
- Сделать 0,2 г/мл неполярного полистирола адсорбент "суспензия" в воде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сделать полистирол Адсорбент шарик "суспензия" в течение предыдущих 1 ч инкубации в шаге 2.2.3. - Взвесить 0,2 г полистирола адсорбент и передать в микроцентрифуг трубку.
- Дега бисер, добавив 1 мл метанола в трубку и перемешайте в течение 1 мин. Дегазированные бусы утонут.
- Аспирировать метанол и добавить воду в бисер. Пусть бисер смешать с водой в течение 5 минут, а затем аспирить воду. Повторите четыре раза, затем довести полистирол адсорбент "суспен", чтобы 1 мл объема с водой и окончательной концентрации 0,2 г/ мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бисер должен все равно оседать на дно трубки. Если они этого не сделают, дега снова. Используйте 21 G или выше иглы, чтобы аспирировать метанол и воду из бисера. - Рассчитайте количество полистирола адсорбент овых шариков, необходимых для поглощения всех моющих средств в каждом образце. 1 г полистирола адсорбентовых бусин поглощает 70 мг TX-100. Чтобы рассчитать объем полистирола адсорбентового шарика, необходимого для каждой реакции, разделите общее моющее средство в реакции (шаг 2.2.1.4) на 70 мг, а затем по концентрации шариковой суспензии (0,2 г/мл (шаг 2.2.7).
- Передача рассчитанного количества полистирола адсорбент шарикового суспензии на 0,5 мл трубки и аспирировать воду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вырезать конец 20-200 л наконечник для передачи бисера, вихрь трубки незадолго до pipetting для resuspend поселились бусы. - Добавьте образцы в трубку 0,5 мл, содержащую полистирол адсорбент, и инкубируйте образец, пяливый в течение 1 ч при 4 градусах Цельсия.
- Повторите дважды оставив старые бусы позади и перенося образец на свежие бусы.
- Добавьте образец в четвертую трубку со свежими бусинами и инкубируйте на ночь (15–18 ч) при 4 градусах Цельсия.
- Рассчитайте количество буфера, белка, липосомы и дополнительного моющего средства, которое необходимо смешать:
- Утром удалите образец из полистирола адсорбентовых бусин и гранул нерастворимых белковых агрегатов путем центрифуга в течение 10 мин при 16000 х г при 4 градусах Цельсия.
- Восстановить супернатант и определить окончательную концентрацию липидов с помощью жидкого сцинтилляционного подсчета (см. шаг 2.1.9.2). Дополнительно, концентрация белка может быть определена amido черный протеин анализ9.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для атластина протеолипосом, ферментативные анализы должны быть выполнены со свежими липосомы. Длительное хранение при температуре 4 градуса Цельсия или замораживание приводит к значительным потерям в активности атласина.
уравнением DВсего является общая концентрация моющего средства и Dвода мономерной концентрации моющего средства (0,18 мМ для TX-100 и Anapoe X-100 в присутствии моющего средства)4, 11.3. Липид Смешивание анализы
- Доведите донора и приемного протеолипосом до концентрации 0,15 мм каждый в A100 с 10% глицерола, 2 ММ-меркаптоэтанол, 1 мМ EDTA и 5 мМ MgCl2. Каждая реакция (50 л) должна быть добавлена к колодцу в плоской белой пластине 96, подходящей для флуоресценции. Подготовьте по крайней мере 4 реакции, включая тройной, и отрицательный контроль без GTP.
- Поместите тарелку в разогретую тарелку при 37 градусах Цельсия. Измерьте флуоресценцию NBD (возбуждение 460 нм и выброс 535 нм) в течение 5 мин каждый мин.
- Индуцировать синтез, добавляя 5 мМ ГТП (5 л 50 мМ GTP).
- Измерьте флуоресценцию NBD каждую минуту в течение 1 ч.
- Добавьте 5 qL 2.5% w/v n-Dodecyl q-D-maltoside для того чтобы растворить proteoliposomes и измерить максимальную флуоресценцию NBD. Читайте NBD флуоресценции в течение 15 минут каждый мин.
4. Липосомомного плавания на Iohexol Прерывный градиент12
- (необязательно) Проанализируйте эффективность восстановления путем плавания анализы13.
- Подготовка 80% и 30% ж / V iohexol в A100 с 10% глицерола, 2 мМ 2-меркаптоэтанол, и 1 мМ EDTA. Iohexol не растворяется легко, так что это должно быть подготовлено за день до nutating ночь при 4 градусах Цельсия.
- Тщательно смешайте 150 л 80% йохесола с 150 зл и протеолипосом, чтобы довести его до 40% йохексола. Добавьте это к 5 х 41 мм2 Ультра-прозрачая трубка, избегающая пузырьков.
- Слой 250 л 30% йохесола запасов медленно в верхней части образца, чтобы сделать средний слой. Избегайте пузырьков и нарушая нижний слой. Поверх среднего слоя медленно добавляйте 50 кЛ A100 с 2 мМ 2-меркаптоэтанолом и 1 мМ EDTA.
- Centrifuge градиент атакжем в размахивая ротор ведро на 220000 х г для 4 ч при 4 кв с медленным ускорением и без перерыва.
- Урожай слоев градиента и анализа SDS-PAGE и Coomassie пятно, количественная оценка может быть сделано с помощью денситометрии. Восстановленный белок должен плавать в верхнем слое, в то время как белковые и липидные агрегаты будут отложения в нижней или средней части.
5. Анализ ориентации восстановленного белка тромбинным протеолизам
ПРИМЕЧАНИЕ: Аластин конструкции сообщили здесь тромбина вырезать сайт между концом N-терминал АСТГОИна GST тега и начала атластина. Аластин в правильной ориентации будет иметь этот участок разреза доступным для протеазы, в то время как белок в неправильной ориентации будет защищен липидным двухслойным.
- Чтобы ассировать атластина протеолипосомной ориентации, зарезервируйте не менее 8 злитрос свежих восстановленных протеолипосом.
- Добавьте 8 зЛ протеолипоси и 1 Зл 1 Гулина. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 1 ч.
- Утолить протеазу 1 л 5 мг/мл без эдта-ингибитора протеазы и инкубировать в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.
- Проанализируйте образец по SDS-PAGE и Coomassie пятна. Пропорция расщепленного и незубного белка может определяться денситометрией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эффективность восстановления атластин представлена на рисунке 2. Восстановленные протеолипосомы плавали в иохесоловом градиенте. Неинкорпорированный белок был отложен в нижнем слое (B) или в среднем слое (M). Восстановленный белок будет плавать к верхнему слою (T). Образцы градиента были собраны и проанализированы SDS-PAGE и Coomassie окрашивания. Количественная оценка геля денситометрией показывает очень высокую эффективность восстановления с незначительными потерями; 96% от общего белка было обнаружено как протеолипосомы, которые плавали в верхнем слое (T). Менее 1% белка было невосстановленным и содержится в среднем слое (M), и только 3% были невосстановленными или агрегированными и отложенными до нижнего слоя (B).
В дополнение к описанию степени восстановления, анализ ориентации атластина после восстановления был количественно thrombin расщепления анализы14. Восстановленный белок потенциально может находиться в неправильной ориентации, то есть перед люменальным пространством липосомы. Белок в неправильной ориентации должен быть защищен от протеолиза липидным двухслойным. Место расщепления тромбина кодируется между концом тега N-терминалGST и началом атласина. Плавающие протеолипомы инкубировались тромбином на 1 ч при 37 градусах Цельсия, а затем 30 минут инактивации с ингибитором без протеазы, свободной от ЭДТА. Образцы были проанализированы SDS-PAGE и Coomassie пятно и количественно денситометрии Рисунок 3. В качестве отрицательного контроля в левой полосе отображается образец необработанных протеолипос. Детергентный растворимый протеолипосом (правая полоса) служил положительным контролем и показать степень расщепления тромбина, и только 1% осталось нерасщепленно. В целом, этот анализ показывает, что большая часть восстановленного белка была расщепляется только 7% защищены от протеазы (средняя полоса). Стоит отметить, что остаток неподрезаного белка может быть результатом восстановленных белковых агрегатов, которые могут не иметь места разреза. В целом, эти результаты описывают надежную систему для восстановления атластин.
Кинетика и степень атластина опосредованного протеолипомного слияния были проанализированы липидных анализов смешивания (Рисунок 1). Образец кинетики синтеза атластинина и количественной оценки показаны на рисунке 4. Полный кинетический пробег изображен на рисунке 4A. 5 мин инкубации было сделано до индуцирования слияния с GTP в нулевой временной точке и после 1 ч, n-Dodecyl й-D-maltoside был добавлен, чтобы solubilize proteoliposomes и получить максимальный релиз FRET. Максимальная мощность синтеза в беге составила 11% от максимальной флуоресценции(рисунок 4B,C). Неиндуцированные элементы управления (No GTP) могут быть использованы для определения фоновой базовой линии.
Рисунок 1: Fusion асссеив модели липосомного синтеза. Популяция маркированных липосом с флуоресцентно помеченными флуоресцентными донорскими липидами NBD-фосфатидидаланоламин (представлена в виде зеленых сфер) и принимающий родамин-фосфатидылтаноламин (представленный в виде красных сфер) смешивается с немаркированным бассейн липосомы. Перед слиянием флуоресценция НБД низка из-за близости с принимающим фторофором, родамином. При слиянии с немаркированными липосомами увеличение площади поверхности приводит к разбавлению зондов и может быть измерено фрет-релиз NBD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Эффективность восстановления, проанализированные анализом плавающей системы. Эффективность восстановления атластина может быть измерена путем плавания протеолипос в иохексоловом градиенте. Восстановленный белок должен плавать в виде протеолипосом к верхнему слою (T), в то время как невосстановленный и агрегированный белок должен отложения в нижний слой (B) или средний слой (M). Кумасси окрашенные SDS-PAGE гель был количественно денситометрии и измеряется 96% от общего белка плавали как протеолипомы с незначительными теряет (4%).
Рисунок 3: Анализ восстановленного атластина в протеолипосомы путем пищеварения протеазы. Рекомбинантный атластин имеет N-терминальный тег GST, а затем последовательность разреза тромбина. Протеолипосомы рекомбинантного аластинантного аластина лечились тромбином протеазы для анализа ориентации восстановленного белка по отношению к липидному двухслойному. После лечения тромбина протеазы ингибируется и образцы анализируются SDS-PAGE, Coomassie пятно, и количественно денситометрии. Представленные протеолипомы имеют низкую долю защищенного белка, и только 4%, которые остались непереваренные (средняя полоса). В качестве положительного контроля некоторые протеолипомы были растворимы моющим средством (0,5% TX100) (правая полоса); отрицательный контроль, необработанные протеолипомы, не был расщепляется (левая полоса).
Рисунок 4: Липид смешивания анализы атластина протеолипосом. (A) Образец кинетического следа реакции синтеза с 5 мин инкубации время, прежде чем индуцировать слияние с GTP на 0 мин. После 1 ч перспективе, моющее средство растворить (черная стрелка) был использован для определения максимального выброса FRET NBD. (B) Увеличено с учетом следа от точки времени 0 до 1 ч с и (C) средний синтез (n no 3) 11,3%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы здесь разграничены эффективный метод очистки, восстановления и измерения термоядерного синтеза активности рекомбинантного аластин. Для обеспечения высоких урожаев функционального атластина необходимо рассмотреть некоторые критические шаги. Выражение атласина должно быть сделано при низких температурах (16 градусов по Цельсию), чтобы избежать агрегации и следует стремиться к окончательной концентрации между 0,4-1,5 мг/мл. Очень разбавленный белок не будет восстановлен оптимально при соотношении белка 1:400 к липидам. Эффективность восстановления может быть дополнительно проанализирована по плаванию анализы описаны здесь (Рисунок 2). Одним из преимуществ липосомы плавающей анализ является то, что они могут быть расширены для анализа растворимых белков, которые ассоциируются с липидными двуслойными13. Кроме того, ориентация восстановленного белка может быть также проанализирована с помощью пищеварения14, однако, это не может различать восстановленный неправильно сложенный или агрегированный белок или восстановление в неправильной ориентации (Рисунок 3 ). Протеолипомы, разработанные этим методом, могут быть применены для исследования для синтеза или для изучения атласина в модели липидного двухслойного. В то время как процедура восстановления относительно проста, небольшие отклонения от оптимальных концентраций моющего средства и липидов могут снизить эффективность восстановления. Например, чрезмерное количество моющего средства может привести к липосомного растворения.
Липидсмешиванианализ анализы требуют пула доноров и принимать липосом(Рисунок 1). Этот метод использует радиоактивность тритриатом липидов для количественной оценки концентрации липидов на каждом шагу. Тем не менее, альтернативные методы количественной оценки были зарегистрированы с использованием внутренней флуоресценции донорских липосом и принимает липосомс ы дансил-фосфоэтаноламина15,16. Размер липосом также может быть изменен во время экструзии, так как размер поликарбонатной мембраны может быть соответствующим образом скорректирован.
В то время как липидные смешивания анализы являются эффективным способом анализа синтеза, он не может различать слияния и гемифузии. Несколько исследований, визуализирующих атластиновые протеолипосмы после синтеза с помощью электронной микроскопии15 и липидной флуоресценции16,17 далее поддерживают полное слияние атластина. Однако, при анализе конкретных мутантов атластин или других белков синтеза, это представляет интерес для обеспечения полного синтеза. Дополнительные шаги для устранения неполадок это может быть сделано путем утоления внешней листовки с dithionite и измерения внутренней листовки липидных смешивания. Альтернативные анализы синтеза, такие как внутреннее смешение ваквого содержимого могут быть использованы для этого, однако, дополнительные шаги и диализ липосом ы будет необходимо.
Интересно, что этот метод может быть применен к другим мембранным белкам для исследования в пробирке белков в модели липидных двухслойных. Другие мембранные белки, как сообщается, воссоздать с помощью этого метода16,17. Поэтому этот метод может быть применен к различным мембранным и термоядерным белкам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Майкла Стерна и его лабораторию за их понимание и обратную связь по атластинам, связанным с проектами. Эта работа была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук (R01GM101377) и Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (R01NS102676).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 mm x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45 μm pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 μm pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 mm x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13 mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. Mechanics of membrane fusion. Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. GTP-dependent membrane fusion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
