إعادة تشكيل المستحضرات المؤتلفة Drosophila Atlastin في Liposomes لفحوصات خلط الدهون
Summary
يتم تحفيز الانصهار الغشاء البيولوجي من قبل البروتينات الانصهار المتخصصة. قياس خصائص البروتينات الفوسوجينية يمكن أن يتحقق عن طريق اختبار خلط الدهون. نقدم طريقة لتنقية المؤتلف Drosophila atlastin، وهو البروتين الذي يتوسط الانصهار التجانسي من ER، وإعادة تشكيله إلى اليبوسومات الجاهزة، واختبار لقدرة الانصهار.
Abstract
انصهار الغشاء هو عملية حاسمة في الخلية eukaryotic. البروتينات المتخصصة ضرورية لحفز الانصهار. الأتلاستين هي البروتينات المقيمة في البروتينات المقيمة في الانصهار المتجانس للER. نحن هنا بالتفصيل طريقة لتنقية الجلوتاثيون S-ترانسفيراز (GST) وبولي هيستيدين الموسومة Drosophila atlastin من قبل جولتين من الكروماتوغرافيا التقارب. دراسة تفاعلات الانصهار في المختبر يتطلب البروتينات الانصهار تنقية لإدراجها في طبقة الدهون. الليبوسومات هي أغشية نموذجية مثالية، كما يمكن تعديل تكوين الدهون وحجمها. ولهذه الغاية، فإننا نوصف طريقة إعادة تشكيل بواسطة إزالة المنظفات لDrosophila atlastin إلى يبوسومات مُسبقة. في حين تتوفر عدة طرق إعادة تشكيل, إعادة تشكيل هاته إزالة المنظفات لها العديد من المزايا التي تجعل هاته مناسبة للاللاستين والبروتينات الأخرى المماثلة. ميزة هذه الطريقة تشمل العائد إعادة تشكيل عالية والتوجه الصحيح للبروتين المعاد تشكيله. ويمكن توسيع هذه الطريقة إلى البروتينات الغشاء الأخرى والتطبيقات الأخرى التي تتطلب البروتيوليبوسومات. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نوصف دراسة خلط الدهون القائمة على FRET من البروتيوليبوسومات المستخدمة كقياس للانصهار الغشاء.
Introduction
انصهار الغشاء هو عملية حاسمة في العديد من التفاعلات البيولوجية. في ظل الظروف البيولوجية، والانصهار غشاء ليست عفوية ويتطلب البروتينات الانصهار المتخصصة لحفز مثل هذه التفاعلات1. يتم التوسط في الانصهار الغشاء HOMOTYPIC ER في الحيوانات من قبل الدينامين ذات الصلة GTPase atlastin2. دور Atlastin في الانصهار التجانسي أساسي لتقاطعات ثلاثية في ER الطرفية، والتي تشكل شبكة كبيرة مترابطة من الأنابيب التي تمتد في جميع أنحاء الخلية. الأتلاستين لديها مورفولوجيا مجال محفوظة تتكون من GTPase كبيرة، وثلاثة الحلزون حزمة المجال الأوسط، ومرساة غشاء رهاب الماء، وقصير سيتوبلازميك C-المحطة الطرفية الذيل3. وقد أظهرت الدراسات في المختبر مع المؤتلف Drosophila atlastin أنه عند إعادة تشكيلها إلى liposomesomes, فإنه يحافظ على خصائصه فوسوجينيك. atlastins أخرى، بما في ذلك homologs الإنسان لم تكن قادرة على تلخيص الانصهار في المختبر. نحن نوصف هنا منهجية لتنقية ضريبة السلع والخدمات وبولي هيستيدين الموسومة المؤتلف Drosophila atlastin، وإعادة تشكيلها إلى liposomes، ودمج.
دراسة انصهار الغشاء في المختبر يمثل تحديا كما البروتينات fusogenic وعادة ما يكون مرساة غشاء. من أجل دراستها، فمن الضروري إعادة تشكيلها إلى ثنائيي الطبقات الدهون نموذج. الحويصلات أحادية كبيرة (LUV) هي أداة مفيدة لدراسة تفاعلات البروتين الدهون. نحن نقدم هنا نظام لجعل LUVs من التراكيب الدهون المختلفة لإعادة تشكيل البروتين واختبارات الانصهار. إعادة تشكيل البروتينات المتكاملة في LUVs يمكن أن يتحقق عن طريق مجموعة متنوعة من الأساليب بما في ذلك، العضوية المذيبات بوساطة إعادة تشكيل، والآليات الميكانيكية، أو المنظفات ساعد إعادة تشكيل4. نحن نقدم هنا طريقة لإعادة تشكيل Drosophila atlastin في liposomesomes مسبقة عن طريق إزالة المنظفات. مزايا هذه الطريقة إعادة تشكيل تشمل الغلة إعادة تشكيل عالية والتوجه السليم للالتاستين في طبقة الدهون. بالإضافة إلى ذلك، من خلال هذه الطريقة، لا يتم تجفيف البروتين أو تعرضه للمذيبات العضوية وبالتالي الحفاظ على الهيكل والوظيفة. من بين مساوئه، قد لا يكون وجود المنظفات مثالية لجميع البروتينات والبروتيوليبوسومات النهائية قد يكون بعض المنظفات المدرجة في طبقة الدهون. ويمكن استخدام مزيد من غسيل الكلى للقضاء على المزيد من المنظفات. ومع ذلك، قد يستغرق غسيل الكلى وقتاً طويلاً، وبالتالي يمكن أن يؤدي إلى فقدان نشاط البروتين.
يمكن تحديد تقييم نشاط التاستين في الانصهار عن طريق اختبار خلط الدهون كما سبق وصفه2. هنا، نحن تحديد طريقة لقياس الاتاستين بوساطة الانصهار من خلال N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine rhodamine-B sulfonyl (رودامين) المسمى الدهون. هذا التقييم يتطلب انصهار البروتيوليبوسومات المانحة (المسمى) والبروتيوليبوسومات (غير المسمى). ويمكن قياس الإفراج عن FRET أثناء رد الفعل كما تخفيف زوج المانحة- مقبول من “المسمى” liposomes إلى “غير المسمى” liposomes نتيجة لخلط الدهون أثناء انصهار الغشاء (الشكل 1)5. في حين أن هذا الإسراف بمثابة وكيل للانصهار غشاء، فإنه يقتصر في التمييز بين الانصهار الغشاء وhemifusion، وهي حالة حيث فقط المنشورات الخارجية مزيج. لمعالجة هذه المشكلة، بديل هو نشرة الخارجي إرواء من بنك دبي الوطني من قبل ديثيونيت. باتباع نفس المنهجية مثل بنك دبي الوطني / رودامين الدهون خلط الاختبارات، عند إرواء النشرة الخارجية أي الإفراج عن FRET بنك دبي الوطني عن طريق الانصهار سيكون بسبب نشرة الداخلية خلط8.
الاختبارات الانصهار البديل ة من قبل محتوى مائي داخلي خلط عنوان الانصهار الكامل فقط5. ومن أمثلة ذلك اختبارات التربيوم (Tb)/حمض الديفيكولينيك (DPA) واختبارات حمض الترايسولفونيك (ANTS) /p-xylene bis(pyridinium) (DPX) من بروميد البيريدينيوم. في اختبارات السل/إدارة الشؤون السياسية، يتم خلط مجموعة من الليبوسومات مع السل المغلفة ودمجها مع الليبوسومات مع مغلفة إدارة الشؤون السياسية؛ عند الانصهار، يتم زيادة الفلورسنت عن طريق نقل الطاقة الداخلية منإدارة الشؤون السياسية إلى السل داخل [Tb(DPA) 3]3- مجمع التشيليشن6. وعلى النقيض من ذلك، بالنسبة للفحوصات التي أجرتها شركة ANTS/DPX، يتم إخماد فلورون ANTS بواسطة DPX7. في حين أن هذه النظم تعالج خلط المحتوى الداخلي، مطلوب إعداد أكثر تعمقا من اليبوسومات لإزالة الكواشف غير مغلفة، فضلا عن التفاعل غير المقصود من الفلوروفوريات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطرق هنا تحدد طريقة فعالة لتنقية, إعادة تشكيل, وقياس نشاط الانصهار من التاستين المؤتلف. لضمان عوائد عالية من التاستين وظيفية يجب النظر في بعض الخطوات الحاسمة. يجب أن يتم التعبير عن الأتلاستين في درجات حرارة منخفضة (16 درجة مئوية) لتجنب التجميع، وينبغي أن يهدف المرء إلى التركيز النهائي بين 0…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور مايكل ستيرن ومختبره على رؤىهم وملاحظاتهم حول المشاريع ذات الصلة بالأتلاستين. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة [R01GM101377] والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية [R01NS102676].
Materials
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. Mechanics of membrane fusion. Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. GTP-dependent membrane fusion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
