כביסה-החוקה בסיוע מחדש של רקומביננטי דרוזולה אטלסטין ליפוזומים בשביל השומנים
Summary
היתוך ממברנה ביולוגי מזרז על ידי חלבונים היתוך מיוחדים. מדידת תכונות fusogenic של חלבונים ניתן להשיג על ידי ערבוב שומנים בעלי. אנו מציגים שיטה לטיהור רקומביננטי דרוסוילה אטלסטין, חלבון המרפא הומוטיפקס של המיון, ממנה את המבנה ליפוזומים מראש ובדיקת קיבולת היתוך.
Abstract
פיוז’ן ממברנה הוא תהליך מכריע בתא איקריוטית. חלבונים מיוחדים נחוצים כדי לזרז את הפיוז. האצנים הם רשתית פלזמית (אר) חלבונים תושב מעורבים במיזוג הומוטיפקס של ER. אנו מפרטים כאן שיטה לטיהור של גלוטתיון S-transferase (GT) ו פולי היסטידין מתויג דרוסופילה אטלסטין על ידי שני סיבובים של כרומטוגרפיה של זיקה. לימוד תגובות היתוך בחוץ גופית דורש חלבונים היתוך מטוהרים להיות מוכנס bilayer ליפיד. ליפוזומים הם ממברנות מודל אידיאלי, כמו הרכב השומנים וגודל ניתן לכוונן. למטרה זו, אנו מתארים שיטת החוקה על ידי הסרת חומרי ניקוי עבור Drosophila ילה atlastin לתוך ליפוזומים טרום. בעוד כמה שיטות מחדש החוקה זמינים, החוקה על ידי הסרת חומרי ניקוי יש מספר יתרונות הופכים אותו מתאים עבור atins וחלבונים דומים אחרים. היתרון של שיטה זו כולל תשואה גבוהה לחוקה וכיוון נכון של חלבון מחדש. שיטה זו ניתן להרחיב חלבונים ממברנה אחרים עבור יישומים אחרים הדורשים פרוטאוליפוזומים. בנוסף, אנו מתארים שומנים בהתבסס על השומנים מבוסס ערבוב של פרוטאוליפוזומים המשמשים כמדידה של היתוך הממברנה.
Introduction
פיוז’ן ממברנה הוא תהליך קריטי בתגובות ביולוגיות רבות. בתנאים ביולוגיים, פיוז’ן ממברנה אינה ספונטנית ודורשת היתוך מיוחדים חלבונים כדי לזרז תגובות כאלה1. היתוך ממברנה הומוטיפקס מתווכת בעלי חיים על ידי הדינמיט הקשורים GTPase atlastin2. תפקידה של אטסטין במיזוג הומוטיפקס הינו יסוד לצמתים תלת-כלאליים ב-ER היקפית, המהווה רשת מחוברים באופן גדול של tubules הנמתחים ברחבי התא. Atins יש מורפולוגיה תחום שימור המורכב GTPase גדול, שלושה צרור סליל התחום האמצעי, עוגן ממברנה הידרופובי, וזנב קצר cytoplasmic C-טרמינל3. במחקרים בעלי מבחנה עם רקומביננטי דרוסופילה אטלסטין הראו שכאשר היוו ליפוזומים, הוא שומר על המאפיינים הפוגניים שלה. לא הצליחו ללכוד. את הפיוז במבחנה אנו מתארים כאן מתודולוגיה לטיהור GT ו-פולי היסטידין מתויג רקומביננטי דרוסוילה אטלסטין, ממנה אותו ליפוזומים, ואומר היתוך.
לימוד פיוז’ן ממברנה בחוץ גופית מציג אתגר כמו חלבונים fusogenic בדרך כלל יש עוגן קרום. כדי ללמוד אותם, יש צורך ליצור מחדש אותם למודל השומנים bilayers. Unilamellar שלפוחיות גדולות (אהובה) הם כלי שימושי כדי ללמוד אינטראקציות חלבון השומנים. אנו מציגים כאן מערכת כדי להפוך LUVs של קומפוזיציות השומנים שונים לחידוש חלבון והיתוך assays. החוקה של חלבונים אינטגרליים לתוך LUVs יכול להיות מושגת על ידי מגוון רחב של שיטות כולל, אורגני הממס בתיווך מחדש, מנגנונים מכניים, או חומרי ניקוי סיוע החוקה4. אנו מציגים כאן שיטה ליצור מחדש את דרוסופילה אטלסטין ליפוזומים מראש על ידי הסרת חומרי ניקוי. היתרונות של שיטת החוקה הזאת כוללים תשואות גבוהה לחוקה הכיוון הנכון של atlastin ב bilayer השומנים. בנוסף, באמצעות שיטה זו, החלבון אינו מיובש או חשוף ממיסים אורגניים ובכך שמירה על מבנה ותפקוד. בין החסרונות שלה, הנוכחות של דטרגנטים לא יכול להיות אידיאלי עבור כל החלבונים ואת פרוטאוליזומים הסופי יכול להיות כמה אבקת כביסה שולבו bilayer השומנים. דיאליזה נוספת ניתן להשתמש כדי לחסל יותר של כביסה. עם זאת, דיאליזה עשויה להימשך זמן רב ולכן יכול להוביל לאובדן פעילות החלבון.
הערכת פעילות היתוך של atlastin יכול להיקבע על ידי ערבוב שומנים בדם כפי שמתואר בעבר2. כאן, אנו להתוות שיטה עבור מדידת atlastin בתיווך פיוז’ן דרך N-(7-ניטרובנץ-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine rhodamine-B סולוניל (rhodamine) התווית שומנים. הסדר הזה דורש היתוך של התורם (מתויג) פרוטאוליפוזומים וקבלה (ללא תווית) פרוטאוליפוזומים. ניתן למדוד את השחרור במהלך התגובה כדילול של תורם – קבלה של זוג “שכותרתו” ליפוזומים “ליפוזומים” ללא תווית כתוצאה של ערבוב שומנים במהלך היתוך ממברנה (איור 1)5. בעוד שהוא משמש כפרוקסי לפיוז ממברנה, הוא מוגבל בהבחנה בין פיוז’ן ממברנה המיפיוז, מדינה שבה רק את העלונים החיצוניים לערבב. כדי לטפל בבעיה זו, חלופה היא מקופת העלעל החיצוני של NBD על ידי dithionite. בעקבות אותה מתודולוגיה כמו NBD/rhodamine ערבוב השומנים, לאחר העלעל העלון החיצוני כל שחרור הסריג NBD על ידי היתוך יהיה עקב העלון הפנימי ערבוב8.
היתוך אלטרנטיבי חלופי על ידי תוכן פנימי מימית ערבוב כתובת היתוך מלא רק5. דוגמאות לכך הם טרביום (Tb)/dipicolinic חומצה (dpa) בחני ו חומצה trisulfonic (נמלים)/pt-קסילן bis (pyridinium) ברומיד (dpa) בחני. בשחפת/DPA assays, בריכה של ליפוזומים עם שחפת מתחת למים מעורבבים והתמזגו עם ליפוזומים עם DPA שבאנקפסולציה; עם היתוך, הקרינה הפלואורסצנטית מוגברת באמצעות העברת אנרגיה פנימית מ DPA ל-Tb בתוך [Tb (DPA)3] קומפלקס3- כלציה6. לעומת זאת, עבור נמלים/DPX assays אומר, הנמלים פלואורסצנטי מוקף על ידי DPX7. בעוד מערכות אלה כתובת תוכן פנימי ערבוב, יותר מעמיק הכנה של ליפוזומים נדרש להסרת ריאגנטים שאינם מסופף, כמו גם אינטראקציה לא מכוונת של fluorophores.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה מתארת שיטה יעילה לטיהור, העצמה מחדש ומדידת פעילות היתוך של רקומביננטי atlastin. כדי להבטיח תשואה גבוהה של atlastin פונקציונלי כמה צעדים קריטיים יש לשקול. הביטוי של atlastin חייב להיעשות בטמפרטורות נמוכות (16 ° c) כדי למנוע צבירה ואחד צריך לכוון ריכוז סופי בין 0.4 – 1.5 mg/mL. מאוד חלבון מדלל לא יהיה מחדש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד ר מיכאל שטרן והמעבדה שלו על התובנות והמשוב שלהם על פרויקטים הקשורים באטלסטין. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי של מדעי הרפואה הכללית [R01GM101377] ואת המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ [R01NS102676].
Materials
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. Mechanics of membrane fusion. Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. GTP-dependent membrane fusion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
