Summary
היתוך ממברנה ביולוגי מזרז על ידי חלבונים היתוך מיוחדים. מדידת תכונות fusogenic של חלבונים ניתן להשיג על ידי ערבוב שומנים בעלי. אנו מציגים שיטה לטיהור רקומביננטי דרוסוילה אטלסטין, חלבון המרפא הומוטיפקס של המיון, ממנה את המבנה ליפוזומים מראש ובדיקת קיבולת היתוך.
Abstract
פיוז'ן ממברנה הוא תהליך מכריע בתא איקריוטית. חלבונים מיוחדים נחוצים כדי לזרז את הפיוז. האצנים הם רשתית פלזמית (אר) חלבונים תושב מעורבים במיזוג הומוטיפקס של ER. אנו מפרטים כאן שיטה לטיהור של גלוטתיון S-transferase (GT) ו פולי היסטידין מתויג דרוסופילה אטלסטין על ידי שני סיבובים של כרומטוגרפיה של זיקה. לימוד תגובות היתוך בחוץ גופית דורש חלבונים היתוך מטוהרים להיות מוכנס bilayer ליפיד. ליפוזומים הם ממברנות מודל אידיאלי, כמו הרכב השומנים וגודל ניתן לכוונן. למטרה זו, אנו מתארים שיטת החוקה על ידי הסרת חומרי ניקוי עבור Drosophila ילה atlastin לתוך ליפוזומים טרום. בעוד כמה שיטות מחדש החוקה זמינים, החוקה על ידי הסרת חומרי ניקוי יש מספר יתרונות הופכים אותו מתאים עבור atins וחלבונים דומים אחרים. היתרון של שיטה זו כולל תשואה גבוהה לחוקה וכיוון נכון של חלבון מחדש. שיטה זו ניתן להרחיב חלבונים ממברנה אחרים עבור יישומים אחרים הדורשים פרוטאוליפוזומים. בנוסף, אנו מתארים שומנים בהתבסס על השומנים מבוסס ערבוב של פרוטאוליפוזומים המשמשים כמדידה של היתוך הממברנה.
Introduction
פיוז'ן ממברנה הוא תהליך קריטי בתגובות ביולוגיות רבות. בתנאים ביולוגיים, פיוז'ן ממברנה אינה ספונטנית ודורשת היתוך מיוחדים חלבונים כדי לזרז תגובות כאלה1. היתוך ממברנה הומוטיפקס מתווכת בעלי חיים על ידי הדינמיט הקשורים GTPase atlastin2. תפקידה של אטסטין במיזוג הומוטיפקס הינו יסוד לצמתים תלת-כלאליים ב-ER היקפית, המהווה רשת מחוברים באופן גדול של tubules הנמתחים ברחבי התא. Atins יש מורפולוגיה תחום שימור המורכב GTPase גדול, שלושה צרור סליל התחום האמצעי, עוגן ממברנה הידרופובי, וזנב קצר cytoplasmic C-טרמינל3. במחקרים בעלי מבחנה עם רקומביננטי דרוסופילה אטלסטין הראו שכאשר היוו ליפוזומים, הוא שומר על המאפיינים הפוגניים שלה. לא הצליחו ללכוד. את הפיוז במבחנה אנו מתארים כאן מתודולוגיה לטיהור GT ו-פולי היסטידין מתויג רקומביננטי דרוסוילה אטלסטין, ממנה אותו ליפוזומים, ואומר היתוך.
לימוד פיוז'ן ממברנה בחוץ גופית מציג אתגר כמו חלבונים fusogenic בדרך כלל יש עוגן קרום. כדי ללמוד אותם, יש צורך ליצור מחדש אותם למודל השומנים bilayers. Unilamellar שלפוחיות גדולות (אהובה) הם כלי שימושי כדי ללמוד אינטראקציות חלבון השומנים. אנו מציגים כאן מערכת כדי להפוך LUVs של קומפוזיציות השומנים שונים לחידוש חלבון והיתוך assays. החוקה של חלבונים אינטגרליים לתוך LUVs יכול להיות מושגת על ידי מגוון רחב של שיטות כולל, אורגני הממס בתיווך מחדש, מנגנונים מכניים, או חומרי ניקוי סיוע החוקה4. אנו מציגים כאן שיטה ליצור מחדש את דרוסופילה אטלסטין ליפוזומים מראש על ידי הסרת חומרי ניקוי. היתרונות של שיטת החוקה הזאת כוללים תשואות גבוהה לחוקה הכיוון הנכון של atlastin ב bilayer השומנים. בנוסף, באמצעות שיטה זו, החלבון אינו מיובש או חשוף ממיסים אורגניים ובכך שמירה על מבנה ותפקוד. בין החסרונות שלה, הנוכחות של דטרגנטים לא יכול להיות אידיאלי עבור כל החלבונים ואת פרוטאוליזומים הסופי יכול להיות כמה אבקת כביסה שולבו bilayer השומנים. דיאליזה נוספת ניתן להשתמש כדי לחסל יותר של כביסה. עם זאת, דיאליזה עשויה להימשך זמן רב ולכן יכול להוביל לאובדן פעילות החלבון.
הערכת פעילות היתוך של atlastin יכול להיקבע על ידי ערבוב שומנים בדם כפי שמתואר בעבר2. כאן, אנו להתוות שיטה עבור מדידת atlastin בתיווך פיוז'ן דרך N-(7-ניטרובנץ-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine rhodamine-B סולוניל (rhodamine) התווית שומנים. הסדר הזה דורש היתוך של התורם (מתויג) פרוטאוליפוזומים וקבלה (ללא תווית) פרוטאוליפוזומים. ניתן למדוד את השחרור במהלך התגובה כדילול של תורם – קבלה של זוג "שכותרתו" ליפוזומים "ליפוזומים" ללא תווית כתוצאה של ערבוב שומנים במהלך היתוך ממברנה (איור 1)5. בעוד שהוא משמש כפרוקסי לפיוז ממברנה, הוא מוגבל בהבחנה בין פיוז'ן ממברנה המיפיוז, מדינה שבה רק את העלונים החיצוניים לערבב. כדי לטפל בבעיה זו, חלופה היא מקופת העלעל החיצוני של NBD על ידי dithionite. בעקבות אותה מתודולוגיה כמו NBD/rhodamine ערבוב השומנים, לאחר העלעל העלון החיצוני כל שחרור הסריג NBD על ידי היתוך יהיה עקב העלון הפנימי ערבוב8.
היתוך אלטרנטיבי חלופי על ידי תוכן פנימי מימית ערבוב כתובת היתוך מלא רק5. דוגמאות לכך הם טרביום (Tb)/dipicolinic חומצה (dpa) בחני ו חומצה trisulfonic (נמלים)/pt-קסילן bis (pyridinium) ברומיד (dpa) בחני. בשחפת/DPA assays, בריכה של ליפוזומים עם שחפת מתחת למים מעורבבים והתמזגו עם ליפוזומים עם DPA שבאנקפסולציה; עם היתוך, הקרינה הפלואורסצנטית מוגברת באמצעות העברת אנרגיה פנימית מ DPA ל-Tb בתוך [Tb (DPA)3] קומפלקס3- כלציה6. לעומת זאת, עבור נמלים/DPX assays אומר, הנמלים פלואורסצנטי מוקף על ידי DPX7. בעוד מערכות אלה כתובת תוכן פנימי ערבוב, יותר מעמיק הכנה של ליפוזומים נדרש להסרת ריאגנטים שאינם מסופף, כמו גם אינטראקציה לא מכוונת של fluorophores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. טיהור של GT-DAtl-His8
-
ביטוי חלבונים והכנה ליפוסט
- המרה BL21 (DE3) E. coli עם מבנה Gt-datl-His8 בpGEX4-T32 ובחר על צלחת אמפיצילין.
- בחר טרנספורנט בודד ו-האיחסן 5 מ ל של LB + אמפיצילין (5 μL של 100 mg/mL אמפיצילין) בצינור התרבות 14 מ ל ו-דגירה ב -25 ° צ' עם טלטול ב 200 סל ד עבור 6-8 h.
הערה: בשל ביטוי דולף, זה לא מומלץ לדגירה בטמפרטורות גבוהות יותר. גידול ב -25 ° c מפחית את צבירת החלבון בתקופת גידול זו. - איחסן 200 mL של LB + אמפיצילין עם 1 מ ל של התרבות 5 מ"ל ו-דגירה לילה (~ 15-18 h) ב 25 ° c.
- למחרת בבוקר, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה (2,000 x g עבור 10 דקות) ו להשעות מחדש ב 5 מ ל של LB.
- אינוחסן 4 L של LB + אמפיצילין ולמדוד OD600 (0.05 – 0.15). מודטה ב -25 ° c עם טלטול.
הערה: שמור חלק מהמדיה לשמש ריק עבור OD600 מדידות לפני הוספת חיידקים. - למדוד OD600 כל שעה עד שהוא מגיע OD בין 0.4 – 0.5. בשלב זה, הפחת את הטמפרטורה ל -16 ° c.
- לגרום עם 0.2 mM IPTG (800 μL של 1 M מניות), 10 דקות לאחר החממה מגיע 16 ° c. דגירה לילה (~ 15 – 18 h) ב 16 ° c.
הערה: הטמפרטורה התחתונה משפרת את התשואה של חלבון פונקציונלי על ידי הפחתת הצבירה של atlastin. - למחרת בבוקר, לקצור את התאים על ידי תפרידו ב 7,500 x g ב 4 ° c.
- השהה מחדש את התאים ב-200 mL של A200 (25 מ"מ HEPES (pH 7.4) ו 200 mM KCl).
- צנטריפוגה את התאים ב 11,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
- להשעות את הגלולה ב 40 mL של מאגר שבירת (A200 ועוד 10% גליצרול, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol, 4% טריטון X-100 (TX100), הסרבזים 40mM, ואחד EDTA ללא מעכב פרוטאז הלוח קוקטייל.
הערה: הוסף TX-100 לאחר השעיית מחדש כדי להימנע מיצירת בועות קצף. - לעבור דרך המחט 18 גרם ולהפעיל את התאים באמצעות המשטר תא שלוש פעמים ב ~ 10,000 psi.
- צנטריפוגה את התמצית ב 125,000 x g עבור 1 h.
הערה: באופן אופציונלי לפזר את הגלולה 1:2 (w:v) ב 8 M אוריאה ו nutate בטמפרטורת החדר בלילה. אוריאה כמו denaturant יהיה לפזר באיטיות כל החלבון מלא מסיסים בניתוח SDS-PAGE. שמור 1 μL לצורך ניתוח כתמי הנייר של SDS-PAGE ו-Coomassie. - לסנן את התמצית באמצעות 0.45 יקרומטר צלולוזה מסנן קרום סטרילי כדי להסיר חיידקים פסולת בקטריאלי גדול.
הערה: באופן אופציונלי, שמור 1 μL לצורך ניתוח הכתמים בעמוד SDS.
-
טיהור חלבונים באמצעות כרומטוגרפיה של אהדה
- טען את הליפוסט המסונן אל מכרומטוטור מתכת כרומטוגרפיה (IMAC) שרף מטען עם Ni2 +, טרום באופן מבוקר עם מאגר הסרמזים נמוך (A100 ועוד 10% גליצרול, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol, 1% TX-100, 40 מ"מ הסרמדול) בקצב של 1 מ"ל/ דקות ב-4 ° c.
- שטוף את הטור עם 25 מ ל של A100 ועוד 10% גליצרול, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol, 0.1% Anapoe X-100, 40 מ"מ שנאפיאזול עם שיעור של 1 מ"ל/min ב 4 ° c. החלבון עם מעבר ליניארי של 30 מ ל של שנדוראזול מ 40 מ"מ עד 500 מ"מ, ו 5 מ ל לשטוף ב 500 mM.
- בריכה יחד שיא שברים ו-מודטה עבור 1 h ב 4 ° c עם חרוזים מתנפחות GSH-Agarose בעבר נפוחות במים ו משקל ב A100 עם 10% גליצרול, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol, 0.1% Anapoe X-100, ו 1 מ"מ EDTA.
הערה: חרוזים GSH-Agarose יכול להיות נפוח בשנת 50 mL של מים ביום לפני ו מודבטים לילה ב 4 ° c, או עבור 1 h ב RT. כדי להסיר מים ומאגר השפה, צנטריפוגה ברוטור דלי מנופף ב 500 x g עבור 1 דקות ללא בלם. . עם מחט בעלת 26 גר' - גלולה GSH-Agarose חרוזים על ידי תפרידו ברוטור דלי מנופף ב 500 x g ללא בלימה ולהסיר supernatant ליפוסט על ידי השאיפה עם מחט g 26.
- להעביר את החרוזים ל 10 mL בטור polyprep ולשטוף חמש פעמים עם 5 מ ל של מאגר equilibration (עם 10% גליצרול, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol, 0.1% Anapoe X-100, ו 1 מ"מ EDTA) על ידי תפרידו ב 500 x g.
- החלבון עם 1 – 1.5 מ ל של מאגר שיווציה בתוספת 10 מ"מ מופחת הגלוטתיון. . והקפאת מבזק בחנקן נוזלי חלבון יכול להיות מאוחסן ב-80 ° c ללא הגבלה.
הערה: התאם את ה-pH של מאגר משחרל 7.4. - מכמת ריכוז חלבון על ידי שיטת החלבון שחור amido9 ולהעריך טוהר על ידי sds-עמוד וכתמים coomassie.
2. החוקה של רקומביננטי אטסטין ליפוזומים
- ליפוכמה הפקה על ידי שיטת ההבלטה מיכל עשור
- להפוך מניות לערבב השומנים ב כלורופורם (10 מ"מ השומנים הכולל). השומנים הנחוצים הם 1-palmitoyl-2-oleoyl-גליקו-3-פוספולולין (POPC), 1, 2-dioleoyl-sn-גליקו-3-פואהו-ל-סרין (DOPS), 1, 2-dioleoyl-sn-גליצארו-3-פוספולאנאואמין-N-(7-ניטרו-2-1, 3-בנזוקסאזיול -4-yl) (NBD-DOPS), ו-1, 2- דיפלמיטאואיל-sn-גליקו-3-פוספופאנאואמין-N-(lissamine rhodamine B) (Rh-DPPE). איקטור ליפוזומים מורכב POPC: DOPS (85:15 היחס הטוחנת) ואת ליפוזומים התורם של POPC: לחות: Rh-PE: NBD-PE (83:15:1.5: היחס הטוחנת של 1.5).
הערה: בעוד POPC: השומנים DOPS תערובות שימשו באופן מסורתי עבור השומנים שומנים מבחנה assays, קומפוזיציות שומנים חלופיים עשוי להיות מותאם למטרות ניסיוני שונים. POPC: ליפוזומים DOPS הם יציבים מאוד קשה לפתיל, ולכן הוא מערכת מחמירה מאוד עבור היתוך. - להוסיף 1 μCi/mL של L-α-dipalmitoyl-פוספריסטיליולין (כולין מתיל-3H) לתערובות שומנים על מנת לקבוע ריכוזי השומנים בשלבים מאוחרים יותר על ידי ספירת הטעמים הנוזליים. שמור לפחות 8 μL של מניה זו.
- העבר כמות רצויה של תערובות השומנים לצינורות זכוכית חלמיש.
- יבש את תערובות השומנים תחת זרם עדין של N2 גז עבור ~ 10 דקות עד לא כלורופורם יותר הוא גלוי.
- יבש את הסרט השומנים עוד יותר בdesiccator על ידי שואב אבק במשך 30 דקות.
- להוסיף מספיק מימית A100 עם 10% גליצרול, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol, ו 1 מ"מ EDTA לסרט השומנים ולהחזיר את הריכוז 10 מ"מ. להשעות את סרט השומנים על ידי vortexing בקלות עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. מומלץ לספק מורטקסר שיכול להכיל צינורות זכוכית חלמיש.
- הקפא את שומנים הנוזלים בחנקן נוזלי עשר פעמים. לאחר הקפאת חנקן נוזלי, להפשיר את הליזומים על ידי מאפשר לפתרון לשבת בטמפרטורת החדר במשך 30 s, ואז להעביר למים עבור החלקה מהירה יותר. האופניים האלה להפשיר את ההקפאה מצמצמים שלפוחיות של מולטיצ'יני.
זהירות: צינורות עלולים לפצח אם הם מכילים אמצעי אחסון גדולים יותר מ 0.5 mL ואם הם מועברים ישירות בטופס חנקן נוזלי למים. - להעביר את השומנים באמצעות מסנני פוליקרבונט עם 100 בגודל נקבובית ננומטר 19 פעמים באמצעות מיני מכבש.
- קביעת ריכוז השומנים הכולל של ליפוזומים על-ידי ספירת שומנים
הערה: חלק השומנים ניתן להשאיר מאחור צינורות זכוכית ו-mini-הבלטת der.- הוסף 4 μL של מלאי שומנים וליפוזומים ב 3 מ ל של קוקטייל של שלוש הטעמים.
- מדידת ספירות ממוצע לדקה (CPMA) עבור מלאי וליפוזומים. ולחשב ריכוז ליפוזומים עם הנוסחה הבאה:
- אחסן את הליזומים ב -4 ° c עד שבוע. אחסון ארוך יותר אינו מומלץ כיפוזומים עשוי לצבור זמן ולהקטין את יעילות החוקה החוזרת.
- להפוך מניות לערבב השומנים ב כלורופורם (10 מ"מ השומנים הכולל). השומנים הנחוצים הם 1-palmitoyl-2-oleoyl-גליקו-3-פוספולולין (POPC), 1, 2-dioleoyl-sn-גליקו-3-פואהו-ל-סרין (DOPS), 1, 2-dioleoyl-sn-גליצארו-3-פוספולאנאואמין-N-(7-ניטרו-2-1, 3-בנזוקסאזיול -4-yl) (NBD-DOPS), ו-1, 2- דיפלמיטאואיל-sn-גליקו-3-פוספופאנאואמין-N-(lissamine rhodamine B) (Rh-DPPE). איקטור ליפוזומים מורכב POPC: DOPS (85:15 היחס הטוחנת) ואת ליפוזומים התורם של POPC: לחות: Rh-PE: NBD-PE (83:15:1.5: היחס הטוחנת של 1.5).
- חוקה על ידי ניקוי התאגדות בסיוע ליפוזומים טרום בנוי
- לחשב את כמות המאגר, חלבון, ליפוזומים תוספת אבקת להיות מעורב יחד:
- קבע את אמצעי האחסון הכולל הרצוי. כרך זה מורכב של מאגר A100 עם 10% גליצרול, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol, ו 1 מ"מ EDTA. כרכים פחות מ-250 μL אינם מתערבבים היטב בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 0.5 mL.
- לחשב את נפח של ליפוזומים הדרושים לתת ריכוז השומנים הסופי של כ 1 מ"מ. הפחת את עוצמת הקול מאמצעי האחסון של המאגר.
- לחשב את נפח החלבון הדרוש כדי לתת את החלבון הרצוי יחס טוחנת שומנים (בדרך כלל 1:400). הפחת בהתאם את אמצעי האחסון של המאגר.
- לקבוע כמה אבקת כביסה נוספת יש להוסיף לרוויה הליזומים מכוון לניקוי יעיל ליחס השומנים(R אף) בין 0.64 – 0.8. זכור לשקול את תכשיר הניקוי המוסף עם החלבון. The (Rאף) נקבע על ידי המשוואה
Dסך הכל ריכוז חומרי ניקוי ומים D הוא הריכוז של אבקת הניקוי monomeric (0.18 MM עבור TX-100 ו anapoe X-100 בנוכחות של חומרי ניקוי)4, . בסדר, 11
- ערבב את הפתרונות יחד בשפופרת 0.5 mL בסדר הבא: מאגר, חומרי ניקוי, חלבונים וליפוזומים. להוסיף את ליפוזומים במהירות מערבולת מיד עבור 5 s כדי המגון את התערובת.
- מודפה את התגובה בשעה 16:00. ב -4 ° c
- הפוך 0.2 g/mL ללא פוליסטירן מוקצף מכופף "להשתהות" במים.
הערה: הפוך את הפוליסטירן מכופף חרוז "להשתהות" במהלך הקודם 1 h הדגירה בשלב 2.2.3. - שוקלים 0.2 g של פוליסטירן מחרוזים כפופות והעברה לצינור מיקרוצנטריפוגה.
- דגה את החרוזים על ידי הוספת 1 מ ל של מתנול לצינור ולערבב עבור 1 דקות.. חרוזים של הדתחת ישקעו
- ממתנול ומוסיפים מים לחרוזים. תן את החרוזים לערבב עם מים עבור 5 דקות, ואז לבשל את המים. חזור ארבע פעמים, ולאחר מכן להביא את הפוליסטירן מכופף חרוז "משקה" לנפח 1 מ ל עם מים וריכוז סופי של 0.2 g/mL.
הערה: החרוזים עדיין צריכים. להתיישב בתחתית הצינור . אם לא, דגה שוב להשתמש 21 G או מחט גבוה כדי להשקות מתנול ומים מחרוזים. - לחשב את כמות הפוליסטירן מוקצף החרוזים הדרושים כדי לקלוט את כל חומרי הניקוי בכל מדגם. 1 גר' פוליסטירן מוקצף החרוזים סופג 70 מ ג של TX-100. כדי לחשב את עוצמת הקול של פוליסטירן adsorbent חרוז הצורך עבור כל תגובה, לחלק את הניקוי הכולל של התגובה (שלב 2.2.1.4) על ידי 70 mg, ולאחר מכן על ידי ריכוז של שאיפה חרוז (0.2 g/mL (שלב 2.2.7).
- העברת כמות מחושבת של קלקר adsorbent חרוז לתוך שפופרת 0.5 mL ומפתי את המים.
הערה: גזור את סופו של 20-200 μL עצה כדי להעביר את החרוזים, מערבולת את הצינור רק לפני ליטוף כדי להשעות מחדש חרוזים התיישבו. - הוסיפו את הדגימות לצינור ה0.5 mL המכיל פוליסטירן מחרוזים ומודטים את הדגימה של 1 h ב -4 ° c.
- חזרו פעמיים והשאירו חרוזים ישנים מאחור והעבירו את הדגימה לחרוזים טריים.
- הוסיפו את הדגימה לצינור רביעי עם חרוזים טריים ומודלון לילה (~ 15-18 שעות) ב -4 ° c.
- לחשב את כמות המאגר, חלבון, ליפוזומים תוספת אבקת להיות מעורב יחד:
- בבוקר, להסיר את המדגם מקלקר adsorbent חרוזים וכדורי אגרגטים מסיסים חלבון ידי תפרידו עבור 10 דקות ב 16,000 x g ב 4 ° c.
- לשחזר את הסופרנטאנט ולקבוע את הריכוז הסופי של השומנים על ידי ספירת הטעמים הנוזליים (ראה שלב 2.1.9.2). באופן אופציונלי, ריכוז החלבון עשוי להיקבע על ידי שיטת באמת חלבון שחור9.
הערה: כדי לקבל הפרוטזיזומים, אנזימטיות מצריך להתבצע עם ליפוזומים טריים. אחסון ארוך ב-4 ° צ' או הקפאה מוביל להפסד משמעותי בפעילות atlastin.
Dסך הכל ריכוז חומרי ניקוי ומים D הוא הריכוז של אבקת הניקוי monomeric (0.18 MM עבור TX-100 ו anapoe X-100 בנוכחות של חומרי ניקוי)4, . בסדר, 113. השומנים ערבוב Assays
- הביאו את התורם והקבלה פרוטאוליפוזומים לריכוז של 0.15 mM כל אחד A100 עם 10% גליצרול, 2 מ"מ β-mercaptoethanol, 1 מ"מ EDTA ו 5 מ"מ MgCl2. כל תגובה (50 μL) יש להוסיף גם טוב בלבן שטוח 96 צלחת הבאר מתאים קריאות הזריחה. הכינו לפחות 4 תגובות כולל טרילקביט, ושליטה לא-GTP שלילית.
- מניחים את הצלחת בקורא לוחית מחוממת ב 37 ° c. למדוד את הזריחה NBD (עירור 460 nm ו פליטה 535 nm) עבור 5 דקות כל דקה.
- לגרום פיוז'ן על ידי הוספת 5 מ"מ GTP (5 μL של 50 mM GTP).
- מדוד את הקרינה הפלואורסצנטית כל דקה עבור 1 h.
- הוסף 5 μL של 2.5% w/v n-Dodecyl β-D-maltoside כדי לפזר את הפרוטאוליפוזומים ולמדוד את מקסימום NBD הזריחה. קרא את הזריחה של NBD במשך 15 דקות בכל דקה.
4. ליפוקו מעבר באופן רציף12
- אופציונלי לנתח את היעילות של החוקה מחדש על ידי הפלוציה בחני מאמר13.
- הכינו 80% ו-30% w/v iohexol ב A100 עם 10% גליצרול, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol, ו 1 מ"מ EDTA. איוהקנול אינו מתמוסס בקלות, לכן יש להכין את היום לפני השינה ב -4 ° c.
- לערבב ביסודיות 150 μL של 80% iohexol מלאי עם 150 μL של מדגם פרוטאוליפוזומים כדי להביא אותו ל-40% iohexol. להוסיף את זה 5 x 41 mm2 שפופרת אולטרה ברור הימנעות בועות.
- שכבה 250 μL של 30% iohexol מלאי באיטיות על גבי המדגם כדי ליצור שכבה אמצעית. הימנע בועות והטרידה את השכבה התחתונה. על גבי השכבה האמצעית, לאט להוסיף 50 μL של A100 עם 2 מ"מ 2-mercaptoethanol ו 1 מ"מ EDTA.
- צנטריפוגה את מעבר הצבע ברוטור דלי מנופף ב 220,000 x g עבור 4 h ב 4 ° c עם האצה איטית ללא הפסקה.
- לקצור את השכבות של מעבר הצבע ולנתח ידי SDS-PAGE ו Coomassie כתם, הכמת ניתן לעשות על ידי densi, try. חלבון מחדש צריך לצוף לשכבה העליונה, בעוד אגרגטים חלבונים ושומנים בדם יהיה משקע בתחתית או בשכבה האמצעית.
5. ניתוח כיוון של חלבון מחדש על ידי תרומבין פרוטפוליזיס
הערה: במבנה האטלסטין שדווח כאן יש מקום לחתוך את התרומבין בין סוף התגית של מסוף N-טרמינל לבין תחילת האטלסטין. Atlastin בכיוון הנכון יהיה לחתוך את האתר הזה נגיש הפרוטאז, בעוד חלבון בכיוון הלא נכון יהיה מוגן על ידי bilayer ליפיד.
- כדי לאמת התמצאות לפחות 8 μL של מחדש את האוריינטציה החדשה.
- הוסף 8 μL של הפרוטאוליזומים ו 1 μL של 1 U/μL של תרומבין. מודטה ב 37 ° c בשביל 1 h.
- כיבוי הפרוטאז עם 1 μL של 5 מ"ג/mL של הקוקטייל מעכב הפרוטאז EDTA חינם ו דגירה של 30 דקות ב 37 ° c.
- לנתח את המדגם על ידי SDS-PAGE ו Coomassie כתם. חלק של חלבון ביקע ומלא ביקע עשוי להיקבע על ידי densi, try.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היעילות של החוקה החוזרת מוצגת באיור 2. . במעבר הדרגתי מקוטע חלבון בלתי משולב היה מימדי בשכבה התחתונה (ב) או בשכבה האמצעית (M). חלבון מחדש צף לשכבה העליונה (T). דגימות של מעבר הצבע נקצרו ונותחו על ידי כתמים של מערכות SDS-PAGE ו-Coomassie הקוונפיקציה של הג על ידי densi, try מראה יעילות גבוהה מאוד של החוקה עם מאבדים זניח; 96% של החלבון הכולל נמצא הפרוטאוליזומים צף לשכבה העליונה (T). פחות מ-1% מהחלבון לא היווה ונמצא בשכבה האמצעית (M), ורק 3% לא היוו או נצבר והוא מונעד לשכבה התחתונה (B).
בנוסף לתיאור היקף החוקה, ניתוח כיוון האטלסטין לאחר החוקה היה מכמת על ידי התרומבין מחשוף14. חלבון reconstituted יכול להיות בכיוון הלא נכון, כלומר, מול החלל לומאל של ליפוכמה. חלבון בכיוון הלא נכון צריך להיות מוגן מ פרוטפוליזיס על ידי bilayer השומנים. האתר מקודד מתחת לקצה של תג מסוף N-טרמינל ותחילת האטלסטין. פרוטאוליזומים צף היו מודבטים עם תרומבין עבור 1 h ב 37 ° c, ואחריו 30 דקות איון פעלה עם מעכב פרוטאז edta חינם. דגימות נותחו על ידי SDS-PAGE ו Coomassie כתם כימות על ידי הדמות densi, לנסות 3. כשליטה שלילית, דגימה של פרוטאוליזומים לא מטופל מוצג בנתיב השמאלי. מסיסות חומרי ניקוי (הנתיב הימני) שימש כבקרה חיובית וכלה בהצגת היקף המחשוף של התרומבין, כאשר רק אחוז אחד נותר בלתי-ביקתי. בסך הכל, שיטת הפעולה הזאת מראה שרוב החלבון החדש הכיל רק 7% המוגנים מהפרוטאז (הנתיב האמצעי). ראוי לציין כי שארית של חלבון לא מלוטש עשוי להיות תוצאה של מחדש אגרגטים חלבון שייתכן שהאתר לחתוך לא נגיש. בסך הכל, התוצאות הללו מתארות מערכת חזקה לצורך הבנה מחדש של atlastin.
את הקינטיקה ואת היקף atlastin-בתיווך פרוטוליפומין היתוך נותחו על ידי ערבוב שומנים בדם (איור 1). מדגם של קינטיקה היתוך atlastin וקוונפיקציה מוצגים באיור 4. הריצה הקינטית המלאה מתוארת באיור 4A. הדגירה 5 דקות נעשה לפני גרימת היתוך עם GTP בזמן אפס נקודה ואחרי 1 h, n-Dodecyl β-D-maltoside התווסף מסיסות הפרוטאוליזים ולקבל את שחרור הסריג המקסימלי. הפיוז המקסימלי בריצה היה 11% של מקסימום פלואורסצנטית (איור 4ב, ג). ניתן להשתמש בפקדי ללא המושרה (ללא GTP) כדי לקבוע את תוכנית הבסיס לרקע.
איור 1: מודל היתוך המודל של ליפומה היתוך. אוכלוסייה של ליפוזומים שכותרתו עם פלואור מתויג התורם פלורסנט ליפידים NBD-פוספולידילטהאנאמין (מיוצג כספירות ירוקות) ו הקבלה rhodamine-פוספולייאמין (מיוצג כדורים אדומים) מעורב עם מסומן ריכה של ליפוזומים. לפני היתוך, הזריחה של NBD נמוכה בשל הקרבה עם הקבלה fluorophore rhodamine. עם היתוך עם ליפוזומים בלתי מסומן להגדיל את פני השטח מוביל לדילול של הבדיקות ושחרור של שחרורו של NBD ניתן למדוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בדיקה חוזרת של יעילות החוקה על ידי התקליטונים. יעילות החוקה של atlastin יכול להיות נמדד על ידי מילוי של פרוטאוליפוזומים במעבר הדרגתי מקוטע של iohexol. חלבון מחדש צריך לצוף כמו פרוטאוליפוזומים אל השכבה העליונה (T), בעוד חלבון מצטבר ומצטברים צריך להציף את השכבה התחתונה (ב) או את השכבה האמצעית (M). Coomassie מוכתם SDS-דף ג'ל היה כמת על ידי densi, ומדד 96% החלבון הכולל צף כמו פרוטאוליפוזומים עם מאבד זניח (~ 4%).
איור 3: ניתוח מחדש של הדלקת בחלבונים באמצעות עיכול הפרוטאז. רקומביננטי atlastin יש תג GT N-מסוף ואחריו רצף לחתוך התרומבין. הפרוטאוליזומים של רקומביננטי atlastin טופלו עם סרין פרוטאז התרומבין כדי לנתח את הכיוון של חלבון מחדש לגבי bilayer השומנים. לאחר טיפול בתרומבין הפרוטאז מעוכב והדגימות מנותחות על ידי SDS-PAGE, כתם Coomassie ו כימות על ידי densi, try. הפרוטאוליזומים המוצגים יש חלק נמוך של חלבון מוגן, עם רק 4% שנותרו לא מתעכל (הנתיב האמצעי). כמו שליטה חיובית כמה הפרוטאוליזומים היו מסיסות עם אבקת (0.5% TX100) (הנתיב הימני); השליטה השלילית, פרוטאוליזומים לא מטופל, לא היה ביקד (הנתיב השמאלי).
איור 4: שומנים בערבוב השומנים של atlastin פרוטאוליזומים. (א) לדוגמה מעקב קינטי של תגובת היתוך עם זמן הדגירה 5 דקות לפני גרימת היתוך עם gtp ב 0 דקות. לאחר 1 h הפעלה, מסיסות חומרי הניקוי (חץ שחור) שימש כדי לקבוע את המהדורה המרבית של השחרור של NBD. (ב) הציג את הסימן מ timepoint 0 עד 1 h עם ו (ג) פיוז'ן ממוצע (n = 3) של 11.3%. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה מתארת שיטה יעילה לטיהור, העצמה מחדש ומדידת פעילות היתוך של רקומביננטי atlastin. כדי להבטיח תשואה גבוהה של atlastin פונקציונלי כמה צעדים קריטיים יש לשקול. הביטוי של atlastin חייב להיעשות בטמפרטורות נמוכות (16 ° c) כדי למנוע צבירה ואחד צריך לכוון ריכוז סופי בין 0.4 – 1.5 mg/mL. מאוד חלבון מדלל לא יהיה מחדש בצורה אופטימלית ב 1:400 חלבון ליחס שומנים בדם. יעילות החוקה ניתן לנתח באופן אופציונלי על ידי התקליטונים המתואר כאן (איור 2). אחד היתרונות של ליפוזומים ציפה בחני הוא שהם יכולים להיות מורחבים כדי לנתח חלבונים מסיסים השייכים עם bilayers השומנים13. בנוסף, התמצאות של חלבון מחדש ניתן לנתח גם על ידי העיכול הפרוטאז14, עם זאת, זה לא יכול להבדיל בין מחדש לקוי או חלבון מצטבר או לחוקה מחדש בכיוון הלא נכון (איור 3 ). הפרוטאוליפוזומים שפותחו על ידי שיטה זו ניתן להחיל על שיטת היתוך או למחקרים של atlastin ב שומנים במודל bilayer. בעוד ביצוע הליך החוקה היא פשוטה יחסית, סטיות קטנות מן הניקוי האופטימלי ריכוזי השומנים עשוי להפחית את היעילות של החוקה החוזרת. לדוגמה, כמות מוגזמת של חומרי ניקוי עשוי להוביל ליפופיקציה מסיסות.
השומנים ערבוב בחני דורשים מאגר של ליפוזומים תורם וקבלה (איור 1). שיטה זו משתמשת ברדיואקטיביות על ידי השומנים tritiated עבור כימות של ריכוז השומנים בכל שלב. עם זאת, שיטות לכימות חלופיות דווחו באמצעות הזריחה הפנימית של ליפוזומים תורמים וקבלה ליפוזומים עם dansyl-פוספולאנאמין15,16. שינוי גודל של ליפוזומים יכול להיות גם שונה במהלך שחול, כמו הנקבוביות הקרום פוליקרבונט הממברנה ניתן לכוונן בהתאם.
בעוד השומנים ערבוב בחני הם דרך יעילה לנתח פיוז ' ן, זה לא יכול להבדיל בין היתוך המיפיוז. מספר מחקרים המחשה לאחר היתוך על ידי אלקטרון מיקרוסקופ15 ועל ידי שומנים פלואורסצנטית16,17 תמיכה נוספת פיוז'ן מלא של atlastin. עם זאת, כאשר ניתוח מוטציות מסוימות atlastin או חלבונים היתוך אחרים, זה מעניין כדי להבטיח היתוך מלא. צעדים נוספים כדי לפתור את זה יכול להיעשות על ידי הוספת העלון החיצוני עם dithionite ומדידת העלעל הפנימי ערבוב השומנים. היתוך אלטרנטיבי חלופי, כגון ערבוב תוכן פנימי מימית עשוי להיות מועסק עבור זה, עם זאת, שלבים נוספים ודיאליזה של ליפוזומים יהיה צורך.
זה עניין שיטה זו יכולה להיות מוחלת על חלבונים ממברנה אחרים עבור במחקרים מחוץ גופית של חלבונים במודל שומנים מודל bilayers. חלבונים ממברנה אחרים דווחו להוות מחדש עם שיטה זו16,17. שיטה זו יכולה אפוא להיות מיושם על מגוון של חלבונים קרום היתוך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לד ר מיכאל שטרן והמעבדה שלו על התובנות והמשוב שלהם על פרויקטים הקשורים באטלסטין. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי של מדעי הרפואה הכללית [R01GM101377] ואת המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ [R01NS102676].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 mm x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45 μm pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 μm pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 mm x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13 mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M.
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F.
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
