Summary
생물학적 막 융합은 특수 융합 단백질에 의해 촉매됩니다. 단백질의 fusogenic 특성을 측정하는 것은 지질 혼합 분석을 통해 달성될 수 있다. 우리는 재조합 Drosophila 아틀라를 정화하는 방법을 제시, ER의 상모 융합을 중재하는 단백질, 미리 형성 된 리포솜에 그것을 재구성, 융합 용량에 대한 테스트.
Abstract
막 융합은 진핵 세포에서 중요한 과정입니다. 융합을 촉매하려면 특수 단백질이 필요합니다. 아틀라스틴은 ER의 상동성 융합에 연루된 소포체(ER) 상주 단백질이다. 여기서 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와 폴리히스티딘 태그가 붙은 드로소필라 아플라스틴을 친화성 크로마토그래피의 두 라운드로 정화하는 방법을 자세히 설명합니다. 시험관 내에서 융합 반응을 연구하려면 정제된 융합 단백질을 지질 이중층으로 삽입해야 합니다. 리포솜은 지질 조성 및 크기가 조정될 수 있기 때문에 이상적인 모델 막이다. 이를 위해, 우리는 미리 형성 된 리포좀으로 초파리 아플라스틴에 대한 세제 제거에 의해 재구성 방법을 설명합니다. 여러 가지 재구성 방법을 사용할 수 있지만, 세제 제거에 의한 재구성은 아틀라스틴 및 기타 유사한 단백질에 적합한 몇 가지 장점이 있습니다. 이 방법의 장점은 재구성 된 단백질의 높은 재구성 수율 및 올바른 배향을 포함한다. 이 방법은 단백질을 필요로 하는 그밖 막 단백질 및 그밖 용도로 확장될 수 있습니다. 추가적으로, 우리는 막 융합의 측정으로 이용된 프로테올리포좀의 FRET 기반 지질 혼합 분석사를 기술한다.
Introduction
막 융합은 많은 생물학적 반응에서 중요한 과정입니다. 생물학적 조건하에서, 막 융합은 자발적이지 않으며 그러한 반응을 촉매하기위해 전문화된 융합 단백질이 필요합니다 1. ER 상형 막 융합은 다이너닌 관련 GTPase 아플라스틴2에의해 동물에서 매개된다. 상모융합에서 아틀라스틴의 역할은 세포 전체에 걸쳐 확장되는 튜블의 큰 상호 연결된 네트워크를 구성하는 주변 ER의 3방향 접합에 대한 기본입니다. 아틀라스틴은 대형 GTPase, 3개의 나선 번들 중간 도메인, 소수성 멤브레인 앵커 및 짧은 세포질 C-말단 꼬리3으로구성된 보존된 도메인 형태를 가진다. 재조합 드로 소 필아슬아슬라 아플라스틴과 생체 외 연구는 리포솜으로 재구성 할 때, 그것은 그것의 fusogenic 속성을 유지하는 것으로 나타났습니다. 인간 상동체를 포함한 다른 아슬아슬증은 시험관 내에서 융합을 재현할 수 없었다. 우리는 여기에 GST와 폴리 히스티딘 태그 재조합 초파리 아틀라스틴을 정화하기위한 방법론을 설명, 리포솜에 그것을 재구성, 및 융합을 해석.
시험관내에서 막 융합을 연구하는 것은 일반적으로 막 앵커를 가지고 있는 푸소제닉 단백질로서 도전을 제시한다. 그들을 연구하기 위해서는 모델 지질 이중층으로 재구성해야합니다. 큰 unilamellar 소포 (LUV)는 지질 단백질 상호 작용을 공부하는 유용한 공구입니다. 우리는 단백질 재구성 및 융합 세포에 대한 다른 지질 조성물의 LUV를 만드는 시스템을 제시합니다. LuV로 의 통합 단백질의 재구성은 유기 용매 매개 재구성, 기계적 메커니즘, 또는 세제 보조 재구성을포함하는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다 4. 우리는 여기에 세제 제거에 의해 미리 형성 된 리포좀으로 Drosophila 아틀라스틴을 재구성하는 방법을 제시한다. 이 재구성 방법의 장점은 지질 이중층에서 높은 재구성 수율과 아슬라틴의 적절한 방향을 포함한다. 부가적으로, 이 방법을 통해, 단백질은 건조되거나 유기 용매에 노출되지 않아 구조 및 기능을 유지한다. 그 단점 중, 세제의 존재는 모든 단백질에 이상적이지 않을 수 있으며 최종 프로테올리포좀은 지질 이중층에 일부 통합 세제를 가질 수 있다. 추가 투석은 세제의 더 많은 제거하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그러나 투석은 시간이 오래 걸릴 수 있으므로 단백질 활성의 손실로 이어질 수 있습니다.
아플라스틴의 융합 활성을 평가하는 것은 앞서 설명한 바와 같이 지질 혼합 검사에 의해 결정될 수있다2. 여기서, 우리는 N-(7-니트로벤츠-2-옥사-1,3-디아졸-4-yl(NBD)/리사민 로다민-B 설포닐(로다민)에 표기된 지질을 통해 아플라스틴 매개 융합을 측정하는 방법을 묘사한다. 이 분석법은 기증자 (표지된) 프로테올리포좀및 수용자(표지되지 않은) 프로테올리포좀의 융합을 요구한다. FRET 방출은 막 융합 동안 지질 혼합의 결과로서 "표지된" 리포좀으로부터 "표지된" 리포좀으로부터 공여자-수용자 쌍의 희석으로서 반응동안 측정될 수 있다(도 1)5. 이 분석은 막 융합을 위한 프록시역할을 하는 동안, 막 융합과 헤미퓨전을 구별하는 데 에는 제한적이며, 외부 리플렛만 혼합하는 상태이다. 이 문제를 해결하기 위해, 대안은 디티오미트에 의한 NBD의 외부 전단지 담금질이다. NBD/로다민 지질 혼합 시험과 동일한 방법론에 따라, 외부 리플렛을 담금질하면 융합에 의한 NBD FRET 방출은 내부 리플렛 혼합에 기인할 것이다8.
내부 수성 함량 혼합 주소 전체 융합만5에의한 대체 융합 어제비. 이것의 예는 테르비움 (Tb)/디피콜린산 (DPA) 아미노나페탈렌 트리설포닉산 (ANTS)/p-자일렌 비스 (피리디늄) 브로마이드 (DPX) 애시스입니다. 결핵/DPA 검사에서, 캡슐화 된 결핵을 가진 리포좀 풀은 캡슐화된 DPA와 리포솜과 혼합되고 융합됩니다; 융합시, 형광은 [Tb(DPA) 3]3] 3-킬레이트 복합체6내에서 DPA에서 결핵으로 의 내부 에너지 전달을 통해 증가한다. 대조적으로, ANTS/DPX 어설션의 경우, 개미 형광은 DPX7에의해 담금질됩니다. 이러한 시스템은 내부 콘텐츠 혼합을 해결하는 동안, 리포좀의 더 심층적 인 준비는 비 캡슐화 시약의 제거뿐만 아니라 형광의 의도하지 않은 상호 작용을 위해 필요합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. GST-DAtl-His8의 정화
-
단백질 발현 및 포해준비
- pGEX4-T3 2의 GST-DAtl-His8 구성으로 BL21(DE3) 대장균을 변환하고 암피실린 플레이트에서 선택합니다.
- 14 mL 배양 튜브에서 단일 형질전환 및 접종 5 mL LB + ampicillin (5 μL 의 100 mg/mL ampicillin)을 선택하고 25 °C에서 배양하여 6-8 시간 동안 200 rpm에서 흔들어.
참고: 누수 발현으로 인해 더 높은 온도에서 배양하지 않는 것이 좋습니다. 25°C에서의 성장은 이 성장 기간 동안 단백질의 응집을 감소시킨다. - 5 mL 배양물의 1 mL로 LB + 암피실린의 200 mL을 접종하고 25 °C에서 밤새 배양 (~15-18 시간).
- 다음날 아침, 원심분리(10분 동안 2,000 x g)로 세포를 수확하고 5 mL의 LB에서 다시 중단합니다.
- LB + 암피실린 4 L을 접종하고 OD600 (0.05-0.15)을 측정하십시오. 25 °C에서 흔들어 서 배양.
참고: 박테리아를 추가하기 전에 OD600 측정에 대해 공백으로 사용할 일부 미디어를 예약합니다. - 0.4-0.5 사이의 OD에 도달할 때까지 시간당 OD600을 측정합니다. 이 시점에서 온도를 16°C로 낮추십시오.
- 0.2 mM IPTG (1 M 스톡의 800 μL)로 유도하고, 인큐베이터가 16 °C에 도달한 후 10 분 후에 유도하십시오. 16 °C에서 하룻밤 (~15-18 시간)을 배양하십시오.
참고: 낮은 온도는 아슬아슬증의 응집을 감소시킴으로써 기능성 단백질의 수율을 향상시킨다. - 다음날 아침, 4°C에서 7,500 x g에서 원심분리하여 세포를 수확합니다.
- A200의 200 mL (25 mM HEPES (pH 7.4) 및 200 mM KCl)에서 세포를 다시 일시 중단하십시오.
- 4 °C에서 5 분 동안 11,000 x g에서 세포를 원심 분리합니다.
- 40 mL의 브레이킹 버퍼 (A200 + 10 % 글리세롤, 2 mM 2-메르카포에탄올, 4 % 트리톤 X-100 (TX100), 40mM M imidazole 및 EDTA가없는 프로테아제 억제제 칵테일 정제)에서 펠릿을 다시 중단하십시오.
참고: 기포와 거품이 발생하지 않도록 재중단 후 TX-100을 추가합니다. - 18 G 바늘을 통과하고 ~ 10,000 psi에서 세포 파괴기를 통해 세포를 세 번 실행합니다.
- 1 시간 동안 125,000 x g에서 추출물을 원심 분리합니다.
참고: 선택적으로 펠릿 1:2(w:v)를 8M 우레아에 용해시키고 밤새 실온에서 누테이트합니다. 요소로서 는 SDS-PAGE 분석을 위해 임의의 불용성 펠릿 단백질을 천천히 용해시킬 것이다. SDS-PAGE 및 쿠마시 얼룩 분석을 위해 1μL을 절약합니다. - 0.45 μm 셀룰로오스 질산 멸균 막 필터를 통해 추출물을 걸쇠하여 박테리아와 큰 세균 이물질을 제거합니다.
참고: 선택적으로 SDS PAGE 및 Coomassie 얼룩 분석에 대해 1 μL을 저장합니다.
-
친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제
- Ni2+로충전된 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 수지 컬럼에 여과된 용해액을 적재하고, 낮은 이미다졸 버퍼(A100+ 10% 글리세롤, 2mM 2-메르카페토에탄올, 1% TX-100, 40 mM imidazole)로 미리 보정됨 4 °C에서 최소.
- A100+ 글리세롤 10% 25mL, 2mM 2-메르카포에탄올, 0.1% 아나포에 X-100, 40 mM imidazole로 4°C에서 1mL/min의 속도로 열을 세척하십시오. 40 mM에서 500 mM까지의 imidazole의 30 mL 선형 구배로 단백질을 엘라테우트하고, 500 mM에서 최종 5 mL 세척.
- 피크 분획을 함께 풀하고 4 °C에서 1 시간 동안 배양하고 부어 GSH-Agarose 구슬로, 이전에 물에 부어 10 % 글리세롤, 2 mM 2-메르카포에탄올, 0.1 % Anapoe X-100 및 1 mM EDTA로 A100에서 평형화.
참고: GSH-Agarose 구슬은 전날 50 mL의 물에 부어 4 °C에서 밤새 또는 RT에서 1 시간 동안 배양 될 수 있습니다. 물과 평형 버퍼를 제거하려면 브레이크없이 1 분 동안 500 x g의 스윙 버킷 로터에서 원심 분리기를 하십시오. 26G 바늘로 상급을 흡인합니다. - 펠렛 GSH-아가로즈 비즈는 브레이크 없이 500 x g의 스윙 버킷 로터에서 원심분리하고 26G 바늘로 포부로 용해초 상월체를 제거합니다.
- 구슬을 10 mL 폴리프렙 컬럼으로 옮기고 5 mL의 평형 완충액(글리세롤 10%, 메르카포에탄올 2mM, 0.1% Anapoe X-100 및 1 mM EDTA)으로 500 x g에서 원심분리하여 5회 세척합니다.
- 1-1.5 mL의 평형 완충액으로 단백질을 10 mM감소글루타티온으로 보충합니다. Aliquot 용출 단백질과 액체 질소에 플래시 동결. 단백질은 -80°C에서 무기한으로 보관할 수 있다.
참고: 용출 버퍼의 pH를 7.4로 조정합니다. - 아미도 흑단 단백질 분석 결과9에 의한 단백질 농도를 정량화하고 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 순도를 평가합니다.
2. 리포솜으로 재조합 아플라스틴의 재구성
- 압출 법에 의한 리포솜 생산 10개
- 클로로포름(총 지질 10m)으로 지질 믹스 스톡을 만드세요. 필요한 지질은 1-팔미토일-2-올레오일 글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디올레오일-센-글리세로-3-포스포-L-세린(DOPS), 1 , 2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-(7-니트로-2-1,3-벤조사디아졸-4-yl) (NBD-DPPE) 및 1,2- 디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-(리사민 로다민 B 설포닐) (Rh-DPPE). 수용리포솜은 POPC: DOPS (85:15 어금니 비) 및 POPC의 기증자 리포좀:DOPS:RH-PE:NBD-PE (83:15:1.5:1.5 어금니 비)로 구성됩니다.
참고: POPC:DOPS 지질 혼합은 시험관 내 지질 혼합 실험에 전통적으로 사용되어 왔지만, 대체 지질 조성물은 다른 실험 목적을 위해 적응될 수 있다. POPC :DOPS 리포솜은 매우 안정적이고 융합하기 어렵기 때문에 융합을위한 매우 엄격한 시스템입니다. - 액체 섬광 계수 계산에 의해 나중 단계에서 지질 농도를 결정하기 위해 지질 혼합물에 L-α 디팔미토일 포스파디딜콜린 (콜린 메틸-3H)의 1 μCi/mL를 추가합니다. 이 주식의 최소 8 μL을 예약하십시오.
- 원하는 양의 지질 혼합물을 부싯돌 유리 튜브로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김.
- 더 이상 클로로폼이 보이지 않게 될 때까지 N2 가스의 부드러운 흐름 아래에서 10분 동안 지질 혼합물을 건조시고.
- 30분 동안 진공 청소기로 건조필름을 건조시한 후 건조시합니다.
- 충분한 수성 A100을 글리세롤 10%, 2mM 2-메르카포에탄올, 1 mM EDTA를 지질 필름에 넣고 농도를 10 mM으로 되돌리십시오. 실온에서 15분 동안 가볍게 소용돌이치면서 지질 막을 다시 일시 중단시면 됩니다. 부싯돌 유리 튜브를 수용 할 수있는 와르셔터를 권장합니다.
- 액체 질소에 수화 된 지질을 10 번 동결 해동하십시오. 액체 질소에서 동결 한 후 용액을 실온에서 30 s로 방치하여 리포솜을 해동한 다음 더 빠른 해동을 위해 물로 옮김하십시오. 이 동결 해동 사이클링은 다중 배변 소포를 최소화합니다.
주의 사항: 튜브는 0.5 mL보다 큰 부피를 포함하고 직접 액체 질소를 물로 형성하는 경우 균열이 발생할 수 있습니다. - 미니 압출기를 사용하여 100 nm 기공 크기의 폴리 카보네이트 필터를 통해 지질을 19 회 통과시면됩니다.
- 섬광 계수에 의한 리포좀의 총 지질 농도 결정
참고: 지질의 일부는 유리 튜브와 미니 압출기에 뒤에 남아있을 수 있습니다.- 3 mL의 섬광 칵테일에 지질 스톡과 리포좀 4 μL을 넣으세요.
- 주식 및 리포좀에 대한 분당 평균 개수(CPMA)를 측정합니다. 그리고 다음 공식으로 리포솜 농도를 계산합니다.
- 리포솜을 최대 1주일 동안 4°C에 보관하십시오. 리포솜이 시간이 지남에 따라 집계되어 재구성 효율이 감소할 수 있으므로 더 이상 보관하지 않는 것이 좋습니다.
- 클로로포름(총 지질 10m)으로 지질 믹스 스톡을 만드세요. 필요한 지질은 1-팔미토일-2-올레오일 글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디올레오일-센-글리세로-3-포스포-L-세린(DOPS), 1 , 2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-(7-니트로-2-1,3-벤조사디아졸-4-yl) (NBD-DPPE) 및 1,2- 디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-(리사민 로다민 B 설포닐) (Rh-DPPE). 수용리포솜은 POPC: DOPS (85:15 어금니 비) 및 POPC의 기증자 리포좀:DOPS:RH-PE:NBD-PE (83:15:1.5:1.5 어금니 비)로 구성됩니다.
- 미리 형성 된 리포솜에 세제 보조 통합에 의한 재구성
- 함께 혼합할 버퍼, 단백질, 리포좀 및 여분의 세제의 양을 계산합니다.
- 원하는 총 볼륨을 결정합니다. 이 부피는 10% 글리세롤, 2 mM 2-메르카포에탄올, 1 mM EDTA를 가진 버퍼 A100으로 구성됩니다. 250 μL 미만의 부피는 0.5 mL 미세 원심 분리튜브에서 잘 혼합되지 않는다.
- 약 1 mM의 최종 지질 농도를 제공하는 데 필요한 리포좀의 부피를 계산합니다. 버퍼 볼륨에서 볼륨을 뺍니다.
- 지질 몰 비율 (일반적으로 1:400)에 원하는 단백질을 주는 데 필요한 단백질의 볼륨을 계산합니다. 그에 따라 버퍼 볼륨을 줄입니다.
- 0.64-0.8 사이의 효과적인 세제 대 지질 비율(R eff)을 목표로리포좀을 포화시키기 위해 얼마나 많은 여분의 세제를 추가해야 하는지 결정합니다. 단백질과 함께 첨가되는 세제를 고려해야 합니다. 상기 (Reff)는 총
세제 농도와 D수에 의해 결정되는 수학식 D는 단면성 세제 농도(TX-100의 경우 0.18 mM 및 아나포X-100의 경우 세제의 존재)4,4, 11.
- 완충제, 세제, 단백질 및 리포솜 : 다음과 같은 순서로 0.5 mL 튜브에 함께 솔루션을 혼합합니다. 리포좀을 빠르게 추가하고 혼합물을 균질화하기 위해 5 s를 즉시 소용돌이.
- 4 °C에서 1 시간 동안 영양분으로 반응을 배양합니다.
- 물에 0.2 g /mL 비극성 폴리스티렌 흡착제 비드 "슬러리"를 확인합니다.
참고: 2.2.3단계에서 이전 1시간 배양 중에 폴리스티렌 흡착제 비드 "슬러리"를 만드십시오. - 0.2 g의 폴리스티렌 흡착제 구슬을 계량하고 미세 원심 분리튜브로 옮긴다.
- 튜브에 메탄올 1 mL을 추가하여 구슬을 탈기하고 1 분 동안 혼합합니다.
- 메탄올을 흡인하고 구슬에 물을 추가합니다. 구슬을 5 분 동안 물과 섞은 다음 물을 흡인합니다. 4 회 반복 한 다음 폴리스티렌 흡착제 비드 "슬러리"를 물과 0.2 g / mL의 최종 농도로 1 mL 부피에 가져온다.
참고: 구슬은 여전히 튜브의 바닥에 정착한다. 그렇지 않으면 다시 탈가합니다. 21G 이상의 바늘을 사용하여 구슬에서 메탄올과 물을 흡인하십시오. - 각 샘플의 모든 세제를 흡수하는 데 필요한 폴리스티렌 흡착제 비드의 양을 계산합니다. 폴리스티렌 흡착제 구슬 1 g은 TX-100 70 mg을 흡수합니다. 각 반응에 필요한 폴리스티렌 흡착제 비드 슬러리의 부피를 계산하려면 반응(단계 2.2.1.4)에서 총 세제를 70 mg으로 나누고 비드 슬러리(0.2 g/mL(단계 2.2.7)의 농도로 나눕니다.
- 폴리스티렌 흡착제 비드 슬러리의 계산된 양을 0.5 mL 튜브로 옮기고 물을 흡인합니다.
참고: 20-200 μL 팁의 끝을 잘라 구슬을 전송하고, 정착 된 비드를 다시 일시 중단하기 위해 파이펫팅 직전에 튜브를 소용돌이. - 샘플을 폴리스티렌 흡착구 구슬을 함유하는 0.5 mL 튜브에 추가하고 4 °C에서 1 시간 동안 샘플 영양을 배양합니다.
- 오래된 구슬을 두 번 남기고 샘플을 신선한 구슬로 옮깁니다.
- 샘플을 신선한 구슬이 있는 네 번째 튜브에 넣고 4°C에서 밤새 배양합니다(~15-18시간).
- 함께 혼합할 버퍼, 단백질, 리포좀 및 여분의 세제의 양을 계산합니다.
- 아침에, 폴리스티렌 흡착구 부드 및 펠릿 불용성 단백질 응집물에서 샘플을 제거하고 4 °C에서 16,000 x g에서 10 분 동안 원심 분리합니다.
- 상류를 회수하고 액체 침전 계수에 의해 최종 지질 농도를 결정합니다(단계 2.1.9.2 참조). 선택적으로, 단백질 농도는 아미도 흑색단백질 분석제 9에 의해 결정될 수 있다.
참고: 아텔스테올리포좀의 경우 효소 세포는 신선한 리포솜으로 수행해야합니다. 4°C에서 장기간 보관하거나 동결하면 아슬아스틴 활성이 현저한 손실을 초래합니다.
세제 농도와 D수에 의해 결정되는 수학식 D는 단면성 세제 농도(TX-100의 경우 0.18 mM 및 아나포X-100의 경우 세제의 존재)4,4, 11.3. 지질 혼합 어세
- 기증자 및 수용자 프로테올리포솜을 A100에서 각각 0.15 mM의 농도로 10% 글리세롤, 2 mM β-메르카포에탄올, 1mM EDTA 및 5 mM MgCl 2로 가져온다. 각 반응(50 μL)은 형광 판독에 적합한 평평한 흰색 96 웰 플레이트에 웰을 첨가해야 한다. 삼중 항및 노GTP 음성 대조군을 포함하여 적어도 4개의 반응을 준비한다.
- 플레이트를 37°C에서 예열된 플레이트 리더에 놓습니다. NBD 형광측정(여기 460 nm 및 방출 535 nm)을 1분당 5분동안 측정합니다.
- 5 mM GTP (50 mM GTP의 5 μL)를 추가하여 융합을 유도합니다.
- 1 시간 동안 매 분마다 NBD 형광을 측정하십시오.
- 프로테올리포좀을 용해시키고 최대 NBD 형광을 측정하기 위해 2.5% w/v n-Dodecyl β-D-maltoside의 5 μL을 추가합니다. 1분마다 15분 동안 NBD 형광을 읽으십시오.
4. 이오헥솔 불연속 그라데이션에 리포솜 부동12
- (선택 사항) 부동 분석13에 의한재구성의 효율을 분석한다.
- A100에서 글리세롤 10%, 메르카포에탄올 2mM, EDTA 1mM로 80%와 30% w/v 요오헥솔을 준비합니다. 이오헥솔은 쉽게 용해되지 않으므로 4 °C에서 하룻밤 동안 영양을 배분하여 하루 전에 준비해야합니다.
- 80% 요오헥솔 스톡 150 μL과 프로테올리포좀 샘플 150 μL을 철저히 혼합하여 40% iohexol로 가져옵니다. 거품을 피하는 5 x 41mm2 울트라 클리어 튜브에 추가하십시오.
- 30% 요오색솔의 250 μL을 시료 위에 천천히 스톡하여 중간층을 만든다. 거품이 나고 바닥 층을 방해하지 마십시오. 중간 층 위에 2 mM 2-메르카포에탄올과 1 mM EDTA로 A100 50 μL을 천천히 추가하십시오.
- 4°C에서 4시간 동안 220,000 x g의 스윙 버킷 로터에서 그라데이션을 천천히 가속하고 브레이크가 없는 원심분리기.
- 그라데이션의 층을 수확하고 SDS-PAGE 및 Coomassie 얼룩에 의해 분석, 정량화는 밀도 측정에 의해 수행 될 수있다. 재구성된 단백질은 최상위 층으로 떠있어야 하며, 단백질과 지질 응집체는 바닥 또는 중간 층에서 퇴적됩니다.
5. 트롬빈 프로테올리시스에 의한 재구성 단백질의 배향 분석
참고: 여기에 보고된 아틀라스틴 구조에는 N-말단 GST 태그의 끝과 아플라스틴의 시작 사이에 트롬빈 절단 부위가 있다. 올바른 방향의 아틀라스틴은 프로테아제에 접근할 수 있는 이 절단 부위를 가지며, 잘못된 방향의 단백질은 지질 이중층에 의해 보호됩니다.
- 아스테올리포좀 방향을 분석하려면, 신선한 재구성된 프로테올리포좀을 적어도 8 μL 이상 예약하십시오.
- 프로테올리포좀 8 μL과 1 μL의 U/μL 트롬빈을 첨가합니다. 37°C에서 1시간 동안 배양한다.
- EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일 5 mg/mL의 1 μL로 프로테아제와 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- SDS-PAGE 및 쿠마시 얼룩으로 샘플을 분석합니다. 갈라진 단백질과 삼촌단백질의 비율은 밀도측정에 의해 결정될 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
아슬라스틴 재구성의 효율성은 그림2에 제시되어 있습니다. 재구성된 프로테오폴리포솜은 요오헥솔 불연속 그라데이션에 떠 있었다. 통합되지 않은 단백질을 하부층(B) 또는 중간층(M)에서 침전시켰다. 재구성된 단백질은 최상위 층(T)에 떠있을 것이다. 그라데이션의 샘플을 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색에 의해 수확 및 분석하였다. 밀도측정에 의한 겔의 정량화는 무시할 수 있는 손실로 재구성의 매우 높은 효율을 나타낸다; 총 단백질의 96%가 상부층(T)에 떠 있는 프로테올리포좀으로 발견되었다. 단백질의 1% 미만이 재구성되지 않고 중간 층(M)에서 발견되었고, 단지 3%만이 분해되지 않거나 응집되어 하부 층(B)에 침전되었다.
재구성의 정도를 설명하는 것 외에도, 재구성 후 아틀라스틴의 배향을 분석하는 것은 트롬빈 분열 분석제14에의해 정량화되었다. 재구성된 단백질은 잠재적으로 리포좀의 내성 공간을 마주하는 잘못된 방향, 즉 잘못된 방향에 있을 수 있습니다. 잘못된 배향의 단백질은 지질 이중층에 의해 단백질 해로부터 보호되어야 합니다. 트롬빈 분열 부위는 N-말단 GST 태그의 끝과 아플라스틴의 시작 사이에 코딩된다. 부동 프로테올리포좀은 37°C에서 1시간 동안 트롬빈으로 배양하고, EDTA 프리 프로테아제 억제제와 함께 30분 불활성화를 하였다. 샘플을 SDS-PAGE 및 Coomassie 얼룩에 의해 분석하고 밀도 측정도 3에의해 정량화되었습니다. 네거티브 대조군으로서, 처리되지 않은 프로테올리포좀의 샘플이 왼쪽 차선에 나타난다. 세제 용해 된 프로테올리포좀 (오른쪽 차선)은 긍정적 인 제어 및 트롬빈 분열의 정도를 보여주기 위해, 단지 1 % 왼쪽 비 절단. 모두, 이 분석은 재구성된 단백질의 대부분이 프로테아제(중간 차선)로부터 보호되는 7%만으로 갈라졌다는 것을 보여준다. 절단되지 않은 단백질의 나머지는 절단 부위에 접근할 수 없는 재구성된 단백질 응집체의 결과일 수 있다는 점에 주목할 필요가 있습니다. 전체적으로, 이러한 결과는 아틀라스틴을 재구성하기위한 강력한 시스템을 설명합니다.
운동학 및 아태스틴 매개 프로테올리포좀 융합의 정도는 지질 혼합 분석에 의해분석되었다(도 1). 아슬란스틴 융합 역학 및 정량화 샘플은 그림4에 나와 있습니다. 전체 운동 실행은 그림 4A에설명되어 있습니다. 5분 배양은 제로 타임포인트에서 GTP와의 융합을 유도하기 전에 이루어졌고, 1시간 후에, n-Dodecyl β-D-maltoside는 프로테올리포좀을 용해시키고 최대 FRET 방출을 얻기 위해 첨가되었다. 실행에서 의 융합 최대는 최대 형광의 11 %였다 (그림4B,C). 유도되지 않은(GTP 없음) 컨트롤을 사용하여 배경 기준을 결정할 수 있습니다.
그림 1: 리포솜 융합의 융합 분석 모델. 형광 태그형 형광 공여자 지질 NBD-포스파티딜레탄아닌(녹색 구체로 표시)과 수용자 로다민-포스파티딜레탄아민(붉은 구체로 표현)을 가진 표지된 리포좀의 집단은 표지되지 않은 바와 혼합된다. 리포솜 풀. 융합 전에, NBD의 형광은 수용기 형광포, 로다민과의 근접성으로 인해 낮다. 표지되지 않은 리포솜과 융합하면 표면적이 증가하여 프로브의 희석을 유도하고 NBD의 FRET 방출을 측정할 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 부동 분석으로 분석된 재구성 효율. 아슬란스틴의 재구성 효율은 요오헥솔 불연속 구배에서 프로테올리포좀의 부유에 의해 측정될 수 있다. 재구성된 단백질은 상부 층(T)에 프로테올리포좀으로 부유해야 하며, 재구성되지 않은 응집된 단백질은 바닥층(B) 또는 중간층(M)으로 침전되어야 한다. 쿠마시 염색 SDS-PAGE 젤은 밀도 측정에 의해 정량화되었고, 무시할 수 없는 손실(~4%)을 가진 프로테올리포좀으로 떠있는 총 단백질의 96%를 측정하였다.
그림 3: 프로테아제 소화에 의한 프로테올리포좀에서 재구성된 아플라스틴분석. 재조합 아플라스틴은 N-말단 GST 태그 뒤에 트롬빈 컷 서열이 있다. 재조합 아플라스틴의 프로테올리포좀은 지질 이중층에 대하여 재구성된 단백질의 배향을 분석하기 위해 세린 프로테아제 트롬빈으로 처리하였다. 트롬빈 처리 후 프로테아제는 억제되고 샘플은 SDS-PAGE, Coomassie 얼룩에 의해 분석되고 밀도 측정에 의해 정량화됩니다. 제시된 단백질은 보호된 단백질의 낮은 비율을 가지고 있으며, 소화되지 않은 채로 남아 있는 4%만이 (중간 차선). 양성 대조군으로서 일부 프로테올리포좀은 세제(0.5% TX100)(오른쪽 차선)로 용해되었다; 음의 대조군, 치료되지 않은 프로테올리포좀은 갈라지지 않았습니다 (왼쪽 차선).
도 4: 아스테올리포좀의 지질 혼합 검정. (A) 0분에서 GTP와의 융합을 유도하기 전에 5분 배양 시간으로 융합 반응의 역학 흔적을 샘플링한다. 1시간 실행 후, NBD의 최대 FRET 방출을 결정하기 위해 세제 용해(검정 화살표)를 사용하였다. (B) 시간점 0에서 1시간까지의 추적 보기를 확대하고 (C) 평균 융합(n = 3)이 11.3%입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기서 방법은 재조합 아슬란스틴의 융합 활성을 정화, 재구성 및 측정하기위한 효율적인 방법을 묘사합니다. 기능 적 아플라스틴의 높은 수율을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계를 고려해야합니다. 아슬란스틴의 발현은 응집을 피하기 위해 저온 (16 °C)에서 수행해야하며 0.4-1.5 mg / mL 사이의 최종 농도를 목표로해야합니다. 매우 희석된 단백질은 지질 비율로 1:400 단백질로 최적으로 재구성되지 않을 것이다. 재구성 효율은 여기서 설명한 부동 분석에의해 선택적으로 분석될 수 있다(도 2). 리포좀 부유 분석의 장점 중 하나는 지질 이중층13과연관된 수용성 단백질을 분석하기 위해 확장될 수 있다는 것이다. 추가적으로, 재구성된 단백질의 배향은 또한 프로테아제소화(14)에 의해 분석될 수 있지만, 이것은 잘못된 방향으로 재구성된 잘못 접히거나 응집된 단백질 또는 재구성을 구별하지 않을 수 있다(그림3 ). 이 방법에 의해 개발된 프로테롤리포좀은 모델 지질 이중층에서 아플라스틴의 융합 또는 연구를 위한 분석법에 적용될 수 있다. 재구성 절차를 만드는 것은 상대적으로 간단하지만, 최적의 세제및 지질 농도에서 작은 편차는 재구성의 효율성을 줄일 수 있습니다. 예를 들어, 과도한 양의 세제는 리포솜 용해로 이어질 수 있습니다.
지질 혼합 은 기증자 및 수용기 리포좀의 풀을 필요로 한다(그림1). 이 방법은 모든 단계에서 지질 농도의 정량화를 위해 삼중 지질에 의한 방사능을 사용합니다. 그러나, 대체 정량화 방법은 단실-포스포에탄올아민(15,16)을이용한 공여자 리포좀 및 수용체 리포좀의 본질적인 형광을 이용하여 보고되었다. 폴리카보네이트 멤브레인 기공 크기는 그에 따라 조정될 수 있기 때문에 리포좀의 크기조정도 압출 중에 변형될 수 있다.
지질 혼합 분석은 융합을 분석하는 효율적인 방법이지만, 융합과 반혈을 구별하지 않을 수 있습니다. 전자 현미경15및 지질 형광에 의하여 융합 한 후 아텔라틴 프로테올리포솜을 시각화하는 여러 연구16,17 추가로 아플라스틴의 완전한 융합을 지원합니다. 그러나, 특정 아슬라스틴 돌연변이 체 또는 다른 융합 단백질을 분석할 때, 완전한 융합을 보장하는 것이 관심사이다. 이 문제를 해결 하는 추가 단계 dithionite와 외부 전단지를 담금 질 하 고 내부 전단지 지질 혼합을 측정 하 여 수행할 수 있습니다. 내부 수성 함량 혼합과 같은 대체 융합 성 반응제는 이를 위해 채택될 수 있지만, 리포좀의 추가 단계 및 투석이 필요할 것이다.
이 방법은 모델 지질 이중 층에서 단백질의 시험관 내 연구를위한 다른 막 단백질에 적용 될 수 있다는 관심의. 다른 막 단백질은 이 방법16,17로재구성하는 것으로 보고되었다. 따라서 이 방법은 다양한 막 및 융합 단백질에 적용될 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
마이클 스턴 박사와 그의 연구실에서 아플라스틴 관련 프로젝트에 대한 통찰력과 피드백에 감사드립니다. 이 작품은 일반 의학의 국립 연구소에 의해 지원되었다 [R01GM101377] 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소 [R01NS102676].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 mm x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45 μm pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 μm pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 mm x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13 mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M.
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F.
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
