Summary
La fusione biologica della membrana è catalizzata da proteine di fusione specializzate. Misurare le proprietà fusogene delle proteine può essere ottenuto mescolando saggi. Vi presentiamo un metodo per purificare la Drosophila ricombinante atlastina, una proteina che media la fusione omotipica del ER, riconformandola in liposomi preformati e testando la capacità di fusione.
Abstract
La fusione a membrana è un processo cruciale nella cellula eucarica. Proteine specializzate sono necessarie per catalizzare la fusione. Le atlastine sono proteine residenti nell'endoplasmico (ER) implicate nella fusione omotipica del ER. Abbiamo descritto qui un metodo per purificare un glutathione S-transferase (GST) e poli-istidina etichettato Drosophila atlastina da due cicli di cromatografia di affinità. Lo studio delle reazioni di fusione in vitro richiede l'inserimento di proteine di fusione purificate in un bistrato lipidico. I liposomi sono membrane modello ideale, come la composizione e le dimensioni dei lipidi possono essere regolati. A tal fine, descriviamo un metodo di ricostituzione mediante rimozione del detergente per la Drosophila atlastin a liposomi preformati. Sebbene siano disponibili diversi metodi di ricostituzione, la ricostituzione mediante rimozione del detergente presenta diversi vantaggi che lo rendono adatto per atlastini e altre proteine simili. Il vantaggio di questo metodo include un'elevata resa di ricostituzione e un corretto orientamento della proteina ricostituita. Questo metodo può essere esteso ad altre proteine della membrana e per altre applicazioni che richiedono proteoliposomi. Inoltre, descriviamo un saggio di miscelazione dei lipidi a base di FRET di proteoliposomi utilizzati come misura della fusione della membrana.
Introduction
La fusione a membrana è un processo critico in molte reazioni biologiche. In condizioni biologiche, la fusione della membrana non è spontanea e richiede proteine di fusione specializzate per catalizzare tali reazioni1. Er fusione della membrana otipipica è mediata negli animali dal dinamino correlato GTPase atlastin2. Il ruolo di Atlastin nella fusione omotipica è fondamentale per le giunzioni a tre vie nel ER periferico, che costituisce una grande rete interconnessa di tubuli che si estendono in tutta la cellula. Atlastins hanno una morfologia di dominio conservato costituito da una grande GTPase, un dominio intermedio fascio di tre elicoie, un'ancora di membrana idrofobica, e una breve coda citoplasmatica C-terminal33. Studi in vitro con drosophila ricombinante alla Drosophila atlastin hanno dimostrato che, una volta ricostituito per i liposomi, mantiene le sue proprietà fusogene. Altri atlastini, compresi gli omologhi umani non sono stati in grado di ricapitolare la fusione in vitro. Descriviamo qui una metodologia per purificare un GST e la poli-idina etichettata come l'atsolazione ricombinante della Drosophila, riconciliandola ai liposomi e rivaleggere la fusione.
Lo studio della fusione della membrana in vitro rappresenta una sfida in quanto le proteine fusogene di solito hanno un'ancora di membrana. Per studiarli, è necessario ricostituirli in modelli di bistrati lipidici. Le grandi vesciche di unilamellar (LUV) sono uno strumento utile per studiare le interazioni delle proteine lipidi. Vi presentiamo qui un sistema per fare LUV di diverse composizioni lipidiche per la ricostituzione delle proteine e i saggi di fusione. La ricostituzione delle proteine integrali nei LLU può essere ottenuta con una varietà di metodi, tra cui la ricostituzione organica mediata dal solvente, i meccanismi meccanici o la ricostituzione assistita dal detersivo4. Vi presentiamo qui un metodo per ricostituire la Drosophila atlastina in liposomi preformati mediante rimozione del detersivo. I vantaggi di questo metodo di ricostituzione includono elevati rendimenti di ricostituzione e un corretto orientamento di atlastin nel bistrato lipidico. Inoltre, attraverso questo metodo, la proteina non viene essiccata o esposta a solventi organici mantenendo così la struttura e la funzione. Tra i suoi svantaggi, la presenza di detergenti potrebbe non essere ideale per tutte le proteine e i proteoliposomi finali possono avere qualche detergente incorporato nel bistrato lipidico. Ulteriore dialisi può essere utilizzata per eliminare più del detersivo. Tuttavia, la dialisi può richiedere molto tempo e può quindi portare alla perdita di attività proteica.
La valutazione dell'attività di fusione di atlastin può essere determinata mescolando saggi come descritto in precedenza2. Qui, deperiamo un metodo per misurare la fusione mediata atlastina attraverso i lipidi etichettati N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine rhodamine-B sulfonyl (rhodamine). Questo saggio richiede la fusione di proteoliposomi donatore (etichettato) e proteoliposomi accettatori (senza etichetta). Un rilascio di FRET può essere misurato durante la reazione come la diluizione di una coppia donatore-acceleratore da liposomi "etichettati" a liposomi "senza etichetta" come risultato della miscelazione dei lipidi durante la fusione della membrana (Figura 1)5. Mentre questo test serve come proxy per la fusione della membrana, è limitato nel distinguere tra fusione della membrana ed emifusione, uno stato in cui solo i volantini esterni si mescolano. Per risolvere questo problema, un'alternativa è l'eliminazione di NBD da parte di NBD per dithionite. Seguendo la stessa metodologia dei pronostici di miscelazione dei lipidi NBD/rhodamine, dopo aver placato il volantino esterno qualsiasi rilascio NBD FRET mediante fusione sarà dovuto alla miscelazione interna dei volantini8.
Saggi di fusione alternativa da contenuti acquosi interni mixaggio indirizzo full fusion solo5. Esempi di questo sono i saggi di terbio (Tb)/dipicolinic acid (DPA) e i saggi di acido trisulfonico aminonaftalene (ANTS)/p-xylene bis(pyridinium) (DPX). Nei saggi Tb/DPA, un pool di liposomi con Tb incapsulato viene miscelato e fuso con liposomi con DPA incapsulato; al momento della fusione, la fluorescenza viene aumentata attraverso il trasferimento interno di energia da DPA a Tb all'interno del complesso [Tb(DPA)3]3- chelazione6. Al contrario, per i saggi ANTS/DPX, la fluorescenza ANTS viene spenta da DPX7. Mentre questi sistemi affrontano la miscelazione del contenuto interno, è necessaria una preparazione più approfondita dei liposomi per la rimozione di reagenti non incapsulati, così come l'interazione involontaria dei fluorofori.
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Protocol
1. Purificazione di GST-DAtl-His8
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Espressione proteica e preparazione del liscia
- Trasformare BL21 (DE3) E. coli con il costrutto GST-DAtl-His8 in pGEX4-T32 e selezionare su una piastra di ampicillina.
- Selezionare un singolo trasformativo e inoculato di 5 mL di LB - ampicillina (5 -L di 100 mg/mL di ampicillina) in un tubo di coltura da 14 mL e incubare a 25 mL con agitazione a 200 rpm per 6-8 h.
NOT: A causa dell'espressione che perde, non è consigliabile incubare a temperature più elevate. La crescita a 25 gradi centigradi riduce l'aggregazione di proteine durante questo periodo di crescita. - Inoculare 200 mL di LB - ampicillina con 1 mL della coltura 5 mL e incubare durante la notte (15-18 h) a 25 gradi centigradi.
- La mattina successiva, raccogliere le cellule per centrifugazione (2.000 x g per 10 min) e risospendere in 5 mL di LB.
- Inoculato 4 L di LB - ampicillina e misura OD600 (0,05–0,15). Incubare a 25 gradi centigradi con lo scuotimento.
NOT: Riservare alcuni supporti per fungere da spazio vuoto per le misurazioni OD600 prima di aggiungere batteri. - Misurare OD600 ogni ora fino a raggiungere un OD compreso tra 0,4-0,5. A questo punto, ridurre la temperatura a 16 gradi centigradi.
- Indurre con 0,2 mM di IPTG (800 -L di 1 M di stock), 10 min dopo che l'incubatrice raggiunge i 16 gradi centigradi. Incubare durante la notte (15–18 ore) a 16 gradi centigradi.
NOT: La temperatura più bassa migliora la resa della proteina funzionale riducendo l'aggregazione di atlastin. - La mattina successiva, raccogliere le cellule centrifugando a 7.500 x g a 4 gradi centigradi.
- Risospendere le celle in 200 mL di A200 (25 m HEPES (pH 7,4) e 200 mM KCl).
- Centrifugare le cellule a 11.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Risospendere il pellet in 40 mL di rottura del buffer (A200 più 10% glicerolo, 2 mM 2-mercaptoetanolo, 4% Triton X-100 (TX100), 40mMM imidazole, e un protease da cocktail tablet senza EDTA).
NOT: Aggiungere Il TX-100 dopo aver eseguito la rimozione per evitare di generare bolle e schiuma. - Passare attraverso un ago da 18 G ed eseguire le cellule attraverso un disgregatore di cellule tre volte a 10.000 dollari.
- Centrifugare l'estratto a 125.000 x g per 1 h.
NOT: Facoltativamente sciogliere il pellet 1:2 (w:v) in 8 M Urea e nutate a temperatura ambiente durante la notte. Urea come denaturante dissolverà lentamente qualsiasi proteina pellettante insolubile per l'analisi SDS-PAGE. Risparmiare 1 l per l'analisi delle macchie SDS-PAGE e Coomassie. - Filtrare l'estratto attraverso un filtro di membrana sterile di nitrato di cellulosa 0,45 m per rimuovere batteri e grandi detriti batterici.
NOTA: Opzionalmente, salvare 1 L per l'analisi delle macchie SDS e Coomassie.
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Purificazione delle proteine per fromatografia di affinità
- Caricare la colonna di rematografia di affinità del metallo immobilizzato (IMAC) carica con Ni2,pre-equilibrata con buffer imidazolo basso (A100 più 10% glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanolo, 1% TX-100, 40 mM imidazole) ad una velocità di 1 mL/ min a 4 gradi centigradi.
- Lavare la colonna con 25 mL di A100 più 10% glicerolo, 2 mM 2-mercaptoetanolo, 0,1% Anapoe X-100, 40 mM imidazolo con una velocità di 1 mL/min a 4 gradi centigradi. Eluire la proteina con un gradiente lineare di 30 mL di imidazolo da 40 mM a 500 mM e un lavaggio finale da 5 mL a 500 mM.
- Piscina insieme frazioni di picco e incubare per 1 h a 4 s c con perline gonfie GSH-Agarose, precedentemente gonfio in acqua ed equilibrato in A100 con 10% glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanolo, 0.1% Anapoe X-100, e 1 mM EDTA.
NOT: Le perle GSH-Agarose possono essere gonfie in 50 mL di acqua il giorno prima e incubate durante la notte a 4 gradi centigradi, o per 1 h a RT. Per rimuovere l'acqua e il buffer di equilibration, centrifugare in un rotore a benna oscillante a 500 x g per 1 min senza freno. Aspirare il supernatante con un ago 26 G. - Pellet GSH-Agarose perline da centrifuga in un rotore secchio oscillante a 500 x g senza freno e rimuovere il supernata lisata per aspirazione con un ago 26 G.
- Trasferire le perline in una colonna poliprep da 10 mL e lavare cinque volte con 5 mL di tampone equilibration (A100 con 10% glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanolo, 0.1% Anapoe X-100 e 1 mM EDTA) centrifugando a 500 x g.
- Eluire la proteina con 1–1,5 mL di tampone di equilibration integrato con 10 mM ridotto glutathione. Proteine elutate e congelano in azoto liquido. Le proteine possono essere conservate a -80 gradi centigradi a tempo indeterminato.
NOT: Regolare il pH del buffer di eluizione a 7.4. - Quantifica la concentrazione di proteine mediante il saggio9 della proteina nera di amido e valuta la purezza mediante colorazione SDS-PAGE e Coomassie.
2. Ricostituzione di Atlastin ricombinante in Liposomes
- Produzione liposomataria con metodo di estrusione 10 del sistema
- Realizzare le scorte di misceladi i lipidi in cloroformio (10 mm di lipidi totali). I lipidi necessari sono 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-DPPE) e 1,2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamina rhodamine B sulfonyl) (Rh-DPPE). I liposomi dell'accettazione sono costituiti da POPC: DOPS (85:15 molare ratio) e liposomi donatori di POPC:DOPS:Rh-PE:NBD-PE (83:15:1.5:1.5 rapporto molare).
NOT: Mentre le miscele di lipidi POPC:DOPS sono state tradizionalmente utilizzate per i saggi di miscelazione dei lipidi in vitro, le composizioni lipidiche alternative possono essere adattate per diversi scopi sperimentali. POPC: I liposomi DOPS sono molto stabili e più difficili da fondere, quindi è un sistema molto rigoroso per la fusione. - Aggiungere 1 cioccol di l-z-dipalmitoyl-fosfatidylcolina (metile di colina-3H) alle miscele di lipidi al fine di determinare le concentrazioni di lipidi nei passaggi successivi mediante il conteggio dello scintillazione del liquido. Riservare almeno 8 l di questo stock.
- Trasferire la quantità desiderata di miscele lipidiche in tubi di vetro di selce.
- Asciugare le miscele lipidiche sotto un flusso delicato di gas N2 per 10 min fino a quando non è visibile più cloroformio.
- Asciugare ulteriormente la pellicola lipidida in un desiccatore aspirando per 30 min.
- Aggiungere abbastanza A100 con 10% glicerol, 2 mM 2-mercaptoetanolo, e 1 mM EDTA alla pellicola lipidica e riportare la concentrazione a 10 mM. Risospendere la pellicola lipidida vortice leggermente per 15 min a temperatura ambiente. Si consiglia un vortice che possa ospitare tubi di vetro di selce.
- Congelare i lipidi idratati in azoto liquido dieci volte. Dopo aver congelato in azoto liquido, scongelare i liposomi lasciando la soluzione a temperatura ambiente per 30 s, quindi trasferire in acqua per un più veloce scongelamento. Questo ciclo di congelamento-disgelo ridurrà al minimo le vesciche multilamellar.
ATTENZIONE: I tubi possono rompersi se contengono volumi superiori a 0,5 mL e se vengono trasferiti direttamente all'acqua di azoto liquido. - Passare il lipido attraverso filtri in policarbonato con 100 nm dimensione poro 19 volte utilizzando mini-estrusore.
- Determinazione della concentrazione totale di lipidi dei liposomi mediante conteggio scintillante
NOT: Alcuni lipidi possono essere lasciati in tubi di vetro e in mini-estrusore.- Aggiungere 4 ll l di brodo lipidico e liposomi in 3 mL di cocktail scintillante.
- Misura i conteggi medi al minuto (CPMA) per scorte e liposomi. E calcola la concentrazione di liposomi con la seguente formula:
- Conservare i liposomi a 4 gradi centigradi per un massimo di una settimana. Lo stoccaggio più lungo non è raccomandato in quanto i liposomi potrebbero aggregarsi con il tempo, diminuendo l'efficienza della ricostituzione.
- Realizzare le scorte di misceladi i lipidi in cloroformio (10 mm di lipidi totali). I lipidi necessari sono 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-DPPE) e 1,2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamina rhodamine B sulfonyl) (Rh-DPPE). I liposomi dell'accettazione sono costituiti da POPC: DOPS (85:15 molare ratio) e liposomi donatori di POPC:DOPS:Rh-PE:NBD-PE (83:15:1.5:1.5 rapporto molare).
- Ricostituzione mediante incorporazione assistita di detersivo in liposomi preformati
- Calcolare la quantità di tampone, proteine, liposomi e detergenti extra da miscelare insieme:
- Determinare il volume totale desiderato. Questo volume è costituito da buffer A100 con 10% glicerolo, 2 mM 2-mercaptoetanolo e 1 mM EDTA. I volumi inferiori a 250 gradi non si mescolano bene in tubi di microcentrifuga da 0,5 ml.
- Calcolare il volume di liposomi necessari per dare una concentrazione lipidica finale di circa 1 mM. Sottrarre il volume dal volume del buffer.
- Calcolare il volume di proteine necessario per dare la proteina desiderata al rapporto molare lipidico (di solito 1:400). Diminuire di conseguenza il volume del buffer.
- Determinare la quantità di detersivo supplementare da aggiungere per saturare i liposomi che mirano a un efficace rapporto detergenti/lipidi (Reff) tra 0,64-0,8. Ricordatevi di considerare il detersivo che viene aggiunto con la proteina. Il (Reff) è
determinato dall'equazione Dtotale è la concentrazione totale di detergenti e Dacqua è la concentrazione di detergente monomerico (0,18 mM per TX-100 e Anapoe X-100 in presenza di detergente)4, 11.
- Mescolare le soluzioni in un tubo da 0,5 mL nel seguente ordine: tampone, detersivo, proteine e liposomi. Aggiungere rapidamente i liposomi e il vortice immediato per 5 s per omogeneizzare la miscela.
- Incubare la reazione in un nutator per 1 h a 4 gradi centigradi.
- Rendere 0,2 g/mL di polistirolo non polare adsorbente "slurry" in acqua.
NOT: Rendere il perline adstito in polistirolo "slurry" durante il precedente l'incubazione 1 h al passo 2.2.3. - Pesare 0,2 g di perline adassi di polistirolo e trasferirli in un tubo di microcentrifuga.
- Degas le perline aggiungendo 1 mL di metanolo al tubo e mescolare per 1 min.
- Aspirare il metanolo e aggiungere acqua alle perline. Lasciate che le perline si mescolino con acqua per 5 min, quindi aspirare l'acqua. Ripetere quattro volte, quindi portare il "slurry" adstibile in polistirolo a 1 ml di volume con acqua e una concentrazione finale di 0,2 g/mL.
NOT: Perline dovrebbero ancora stabilirsi sul fondo del tubo. Se non lo fanno, degas di nuovo. Utilizzare un ago 21 G o superiore per aspirare metanolo e acqua da perline. - Calcolare la quantità di perline ad assorbimento in polistirolo necessarie per assorbire tutto il detersivo in ogni campione. 1 g di perline adassorbite in polistirolo assorbe 70 mg di TX-100. Per calcolare il volume di liquami di perline di polistirolo necessari per ogni reazione, dividere il detergente totale nella reazione (passaggio 2.2.1.4) per 70 mg, quindi per la concentrazione del liquame di perline (0,2 g/mL (passaggio 2.2.7).
- Trasferire la quantità calcolata di liquame di perline adstituolo in polistirolo su un tubo da 0,5 mL e aspirare l'acqua.
NOT: Tagliare la fine di una punta di 20-200 gradi per trasferire le perline, vorticare il tubo appena prima della pipiglio per risospendere le perline stabili. - Aggiungere i campioni al tubo da 0,5 mL contenente perline ad assorbenti in polistirolo e incubare il campione con la faraazione per 1 h a 4 gradi centigradi.
- Ripetere due volte lasciando vecchie perline alle spalle e trasferendo il campione a perline fresche.
- Aggiungere il campione a un quarto tubo con perline fresche e incubare durante la notte (15-18 h) a 4 gradi centigradi.
- Calcolare la quantità di tampone, proteine, liposomi e detergenti extra da miscelare insieme:
- Al mattino, rimuovere il campione dalle perle adorbente in polistirolo e gli aggregati di proteine insolubili del pellet centrifugando per 10 min a 16.000 x g a 4 gradi centigradi.
- Recuperare il super-natante e determinare la concentrazione di lipidi finali mediante il conteggio della scintillazione liquida (vedere il passo 2.1.9.2). Facoltativamente, la concentrazione di proteine può essere determinata dal saggio proteico nero amido9.
NOT: Per i proteoliposomi atlastin, i saggi enzimatici devono essere eseguiti con liposomi freschi. Un lungo accumulo a 4 gradi centigradi o il congelamento porta a perdite significative nell'attività di atlastina.
determinato dall'equazione Dtotale è la concentrazione totale di detergenti e Dacqua è la concentrazione di detergente monomerico (0,18 mM per TX-100 e Anapoe X-100 in presenza di detergente)4, 11.3. Lipid Mixing Saggi
- Portare il proteoliposomi donatore e accettante a una concentrazione di 0,15 mM ciascuno in A100 con il 10% di glicerolo, 2 mM-mercaptoetanolo, 1 mM EDTA e 5 mM MgCl2. Ogni reazione (50 ) deve essere aggiunta ad un pozzo in un pozzo bianco piatto 96 adatto per letture di fluorescenza. Prepara almeno 4 reazioni, tra cui un triplice e un controllo negativo no-GTP.
- Collocare la piastra in un lettore di piastre preriscaldato a 37 gradi centigradi. Misurare la fluorescenza NBD (eccitazione 460 nm ed emissione 535 nm) per 5 min ogni min.
- Indurre la fusione con l'aggiunta di 5 mM GTP (5 -L di 50 mM GTP).
- Misurare la fluorescenza NBD ogni minuto per 1 h.
- Aggiungete 5 L del 2,5% w/v n-Dodecyl -D-maltoside per sciogliere i proteoliposomi e misurare la fluorescenza massima di NBD. Leggere la fluorescenza NBD per 15 min ogni min ogni min.
4. Galleggiamento liposomale su Iohexol Discontinuo Gradiente12
- (opzionale) Analizzare l'efficienza della ricostituzione mediante analisi di galleggiamento13.
- Preparare un 80% e un 30% w/v iohexol in A100 con 10% glicerolo, 2 mM 2-mercaptoetanolo e 1 mM EDTA. Iohexol non si scioglie facilmente, quindi questo deve essere preparato un giorno prima facendo la deformazione durante la notte a 4 gradi centigradi.
- Mescolare accuratamente 150 l di 80% di brodo iohexol con 150 l di proteoliposomi per portarlo ad un 40% iohexol. Aggiungere questo a un tubo 5 x 41 mm2 Ultra-chiaro evitando bolle.
- Strato 250 - L di 30% stock iohexol lentamente sopra il campione per fare uno strato medio. Evitare eventuali bolle e disturbare lo strato inferiore. In cima allo strato intermedio, aggiungere lentamente 50 -L di A100 con 2 mM 2-mercaptoetanolo e 1 mM EDTA.
- Centrifugare il gradiente in un rotore a benna oscillante a 220.000 x g per 4 h a 4 gradi centigradi con accelerazione lenta e senza rottura.
- Raccogliere gli strati del gradiente e analizzare da SDS-PAGE e Coomassie macchia, quantificazione può essere fatta da densitometria. Le proteine ricostituite dovrebbero fluttuare verso lo strato superiore, mentre gli aggregati di proteine e lipidi si sedimentano sul fondo o nello strato intermedio.
5. Analisi dell'orientamento delle proteine ricostituite dalla proteolisi da rombina
NOT: Il costrutto atlastin riportato qui ha un sito di taglio della trombina tra la fine del tag GST del terminale N e l'inizio di atlastin. Atlastin nell'orientamento corretto avrà questo sito di taglio accessibile alla proteasi, mentre le proteine con orientamento sbagliato saranno protette dal bistrato lipidico.
- Per scandire l'orientamento proteoliposomico ad all'accorto, riservare almeno 8 l di proteoliposomi freschi ricostituiti.
- Aggiungete 8 -L di proteoliposomi e 1 luna di 1 trombina U/L. Incubare a 37 gradi centigradi per 1 ora.
- Quenso la proteasi con 1 l'l di 5 mg/mL di cocktail inibitore della proteasi senza EDTA e incubare per 30 min a 37 .
- Analizzare il campione con macchie SDS-PAGE e Coomassie. La proporzione di proteine sciolse e ziave può essere determinata dalla densitometria.
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Representative Results
L'efficienza della ricostituzione atlastin è presentata nella Figura 2. I proteoliposomi ricostituiti sono stati galleggianti in un gradiente discontinuo iohexol. La proteina non incorporata è stata sedimentata nello strato inferiore (B) o nello strato intermedio (M). La proteina ricostituita fluttuerebbe verso lo strato superiore (T). I campioni del gradiente sono stati raccolti e analizzati da SDS-PAGE e Coomassie colorazione. La quantificazione del gel mediante densitometria mostra un'efficienza molto elevata della ricostituzione con perdite trascurabili; Il 96% della proteina totale è stato trovato come proteoliposomi che galleggiavano verso lo strato superiore (T). Meno dell'1% della proteina non era ricostituita e si trovava nello strato intermedio (M), e solo il 3% non era ricostituito o aggregato e sedimentato allo strato inferiore (B).
Oltre a descrivere la portata della ricostituzione, l'analisi dell'orientamento di atlastin dopo la ricostituzione è stata quantificata dai saggi di trombina14. La proteina ricostituita potrebbe potenzialmente essere nell'orientamento sbagliato, cioè di fronte allo spazio lumeno del liposoma. Le proteine con orientamento sbagliato dovrebbero essere protette dalla proteolisi dal bistrato lipidico. Un sito di cleavaggio della trombina è codificato tra la fine del tag GST a terminale N e l'inizio di atlastin. I proteoliposomi galleggianti sono stati incubati con trombina per 1 h a 37 , seguita da un'inattivazione di 30 min con inibitore della proteasi senza EDTA. I campioni sono stati analizzati da SDS-PAGE e Coomassie staine e quantificati dalla densitometria Figura 3. Come controllo negativo, un campione di proteoliposomi non trattati è mostrato nella corsia di sinistra. I proteoliposomi solubilivi detergenti (corsia destra) servivano da controllo positivo e mostravano l'estensione della cleavetà della trombina, con solo l'1% lasciato non fessurato. In tutto, questo saggio mostra che la maggior parte della proteina ricostituita è stata scissa con solo il 7% protetto dalla proteasi (corsia centrale). Vale la pena notare che il resto della proteina non tagliata può essere il risultato di aggregati proteici ricostituiti che potrebbero non avere il sito tagliato accessibile. In tutto, questi risultati descrivono un robusto sistema per la ristorazione atlastina.
La cinetica e l'estensione della fusione proteoliposomica mediata dall'attolina sono state analizzate da saggi di miscelazione lipidica (Figura 1). Un campione di atlastina fusion cinetica e quantificazione sono mostrati nella Figura 4. L'esecuzione cinetica completa è illustrata nella figura 4A. Un'incubazione di 5 min è stata fatta prima di indurre la fusione con GTP al momento zero e dopo 1 h, n-Dodecyl -D-maltoside è stato aggiunto per solubilizzare i proteoliposomi e ottenere il massimo rilascio FRET. Il massimo di fusione in esecuzione era dell'11% della fluorescenza massima (Figura 4B,C). I controlli non indotti (No GTP) possono essere utilizzati per determinare la linea di base di sfondo.
Figura 1: Modello di saggio Fusion della fusione liposomica. Una popolazione di liposomi etichettati con lipidi donatori fluorescenti etichettati fluorescenti NBD-fosfatidylethanolamine (rappresentata come sfere verdi) e l'accettatore rhodamine- fosfatidylethanolamine (rappresentato come sfere rosse) viene mescolato con un pool di liposomi. Prima della fusione, la fluorescenza di NBD è bassa a causa della vicinanza con l'accettatore fluoroforo, rhodamina. Dopo la fusione con liposomi non etichettati, un aumento della superficie porta alla diluizione delle sonde e un rilascio FRET di NBD può essere misurato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Efficienza della ricostituzione analizzata dai saggi di galleggiamento. L'efficienza di ricostituzione di atlastin può essere misurata mediante galleggiamento di proteoliposomi in un gradiente discontinuo iohexolo. Le proteine ricostituite dovrebbero galleggiare come proteoliposomi allo strato superiore (T), mentre le proteine non ricostituite e aggregate dovrebbero sedimentarsi sullo strato inferiore (B) o sullo strato intermedio (M). Un gel SDS-PAGE macchiato di Coomassie è stato quantificato dalla densitometria e misurava il 96% della proteina totale fluttuava come proteoliposomi con perdite trascurabili (-4%).
Figura 3: Analisi dell'attovana ricostituita nei proteoliposomi dalla digestione proteasi. Recombinante atlastin ha un tag GST a N terminale seguito da una sequenza di taglio della trombina. I proteoliposomi di atlastina ricombinante sono stati trattati con la trombina di proteasi serina per analizzare l'orientamento della proteina ricostituita rispetto al bistrato lipidico. Dopo il trattamento della trombina la proteasi viene inibita e i campioni vengono analizzati da SDS-PAGE, coomassie macchia, e quantificati da densitometria. I proteoliposomi presentati hanno una bassa percentuale di proteine protette, con solo il 4% che è rimasto non digerito (corsia centrale). Come controllo positivo alcuni proteoliposomi sono stati solubili con detergente (0,5% TX100) (corsia destra); il controllo negativo, proteoliposomi non trattati, non è stato scisso (corsia di sinistra).
Figura 4: Saggi di mixaggio di lipidi di proteoliposomi atlastin. (A) Esempio di traccia cinetica della reazione di fusione con un tempo di incubazione di 5 min prima di indurre la fusione con GTP a 0 min. Dopo 1 h corsa, solubilità detergente (freccia nera) è stato utilizzato per determinare il rilascio massimo FRET di NBD. (B) Ingrandito in considerazione della traccia da 0 a 1 h con e (C) fusione media (n ) di 11,3%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I metodi qui delineano un metodo efficiente per purificare, riclassificare e misurare l'attività di fusione dell'atlastina ricombinante. Per garantire alte rese di atlastina funzionale alcuni passaggi critici devono essere considerati. L'espressione di atlastin deve essere fatta a basse temperature (16 ) per evitare l'aggregazione e si dovrebbe puntare a una concentrazione finale tra 0,4-1,5 mg/mL. Le proteine molto diluite non saranno ricostituite in modo ottimale a un rapporto tra 1:400 proteine e lipidi. L'efficienza di ricostituzione può essere facoltativamente analizzata da asdice di galleggiamento descritti qui (Figura 2). Uno dei vantaggi dei saggi di galleggiamento dei liposomi è che possono essere estesi per analizzare le proteine solubili che si associano ai bistrati lipidiciò 13. Inoltre, l'orientamento della proteina ricostituita può essere analizzato anche mediante la digestione proteasi14, tuttavia, ciò potrebbe non distinguere tra proteine ricostituite in modo errato o aggregate o ricostituzione con orientamento errato (Figura3 ). I proteoliposomi sviluppati da questo metodo possono essere applicati al saggio per la fusione o per gli studi di atlastina in un modello di bistrato lipidico. Mentre la procedura di ricostituzione è relativamente semplice, piccole deviazioni dalle concentrazioni ottimali di detergenti e lipidi possono ridurre l'efficienza della ricostituzione. Ad esempio, una quantità eccessiva di detersivo può portare a liposo solubilizzazione.
I saggi di miscelazione dei lipidi richiedono un pool di liposomi donatori e accettatori (Figura 1). Questo metodo utilizza la radioattività da lipidico tritiato per quantificare la concentrazione di lipidi ad ogni passo. Tuttavia, sono stati riportati metodi di quantificazione alternativi utilizzando la fluorescenza intrinseca dei liposomi donatori e dei liposomi degli accettatori con dansyl-phosphoethanolamine15,16. Il dimensionamento dei liposomi può anche essere modificato durante l'estrusione, poiché la dimensione del poro della membrana di policarbonato può essere regolata di conseguenza.
Mentre i saggi di miscelazione lipidica sono un modo efficiente per analizzare la fusione, non può distinguere tra fusione ed emifusione. Diversi studi che visualizzano i proteoliposomi di atlastina dopo la fusione mediante microscopia elettronica15 e la fluorescenza lipidica16,17 supportano ulteriormente la piena fusione di atlastina. Tuttavia, quando si analizzano specifici mutanti di atlastina o altre proteine di fusione, è interessante garantire la piena fusione. Ulteriori passaggi per risolvere questo problema potrebbero essere fatti spegnindo il volantino esterno con dithionite e misurando la miscelazione dei lipidi del foglietto interno. Per questo motivo possono essere impiegati saggi di fusione alternativi, come la miscelazione di contenuti acquosi interni, tuttavia, saranno necessari ulteriori passaggi e dialisi dei liposomi.
È interessante per il fatto che questo metodo possa essere applicato ad altre proteine della membrana per studi in vitro delle proteine nei bistrati lipidi modello. Altre proteine della membrana sono state segnalate per ricostituire con questo metodo16,17. Questo metodo può quindi essere applicato a una varietà di proteine di membrana e fusione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Michael Stern e il suo laboratorio per le loro intuizioni e feedback su atlastin progetti correlati. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences [R01GM101377] e dall'Istituto Nazionale di Disturbi Neurologici e Ictus [R01NS102676].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 mm x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45 μm pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 μm pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 mm x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13 mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
References
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