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Neuroscience

Presynapse गठन परख का उपयोग Presynapse आयोजक मोती और "न्यूरॉन बॉल" संस्कृति

Published: August 2, 2019 doi: 10.3791/59893
Automatic Translation
1, 1, 1
1Functional Structure Biology Laboratory, Department of Medical Life Science, Yokohama City University Graduate School of Medical Life Science

Summary

Presynapse गठन उचित क्रम में synaptic प्रोटीन के संचय सहित एक गतिशील प्रक्रिया है. इस विधि में, presynapse गठन मोती द्वारा शुरू होता है "न्यूरॉन गेंद" संस्कृति के axonal शीट पर एक presynapse आयोजक प्रोटीन के साथ संयुग्मी, ताकि synaptic प्रोटीन का संचय presynapse गठन के दौरान विश्लेषण किया जा करने के लिए आसान है.

Abstract

न्यूरोनल विकास के दौरान, synapse गठन तंत्रिका सर्किट स्थापित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. synapses बनाने के लिए, synaptic प्रोटीन सेल निकायों से परिवहन द्वारा उचित क्रम में आपूर्ति की जानी चाहिए और / हालांकि, यह पूरी तरह से समझ में नहीं आता है कि कैसे synaptic प्रोटीन उचित क्रम में synapses में जमा. यहाँ, हम मोती के साथ न्यूरॉन गेंद संस्कृति के संयोजन का उपयोग करके presynaptic गठन का विश्लेषण करने के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तुत presynapse गठन प्रेरित करने के लिए. न्यूरॉन गेंदों कि न्यूरॉन सेल समुच्चय है सेल निकायों और dendrites से दूर axonal चादरें प्रदान करते हैं, ताकि presynapses के कमजोर फ्लोरोसेंट संकेतों सेल निकायों के भारी संकेतों से बचने के द्वारा पता लगाया जा सकता है. presynapse गठन को गति प्रदान करने के लिए मोती के रूप में, हम ल्यूकोइन समृद्ध दोहराने ट्रांसमेम्ब्रेन न्यूरोनल 2 (LRRTM2), एक उत्तेजक presynaptic आयोजक के साथ संयुग्मी मोती का उपयोग करें। इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने दिखा दिया कि vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 1 (vGlut1), एक synaptic vesicle प्रोटीन, munc18-1, एक सक्रिय क्षेत्र प्रोटीन की तुलना में तेजी से presynapses में जमा. Munc18-1 संचित अनुवाद-निर्भर रूप से presynapse में भी कोशिका निकायों को हटाने के बाद. यह निष्कर्ष एक्सॉन्स में स्थानीय अनुवाद द्वारा Munc18-1 संचय को इंगित करता है, कोशिका निकायों से परिवहन नहीं। अंत में, इस विधि presynapses और synaptic प्रोटीन के स्रोत में synaptic प्रोटीन के संचय का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है. न्यूरॉन गेंद संस्कृति सरल है और यह विशेष उपकरण का उपयोग करने के लिए आवश्यक नहीं है के रूप में, इस विधि अन्य प्रयोगात्मक प्लेटफार्मों के लिए लागू हो सकता है.

Introduction

सिनप्स गठन तंत्रिका परिपथ1,2,3के विकास के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम है . सिनैप्स का गठन जो पूर्व और बाद के सिनाप्स से बने विशेष डिब्बों के होते हैं, एक जटिल और बहुचरणी प्रक्रिया है जिसमें एक्सॉन और डेन्ड्राइट की उचित मान्यता, सक्रिय क्षेत्र और पोस्टीनैप्टिक घनत्व का गठन, और उचित संरेखण शामिल है। आयन चैनलों और न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स1,2. प्रत्येक प्रक्रिया में, synaptic प्रोटीन के कई प्रकार के सेल निकायों से synaptic प्रोटीन परिवहन द्वारा उचित समय में इन विशेष डिब्बों में जमा और / इन synaptic प्रोटीन कार्यात्मक synapses फार्म करने के लिए संगठित तरीके से व्यवस्थित किया जा करने के लिए माना जाता है. सिनेप्स गठन से जुड़े कुछ सिनाप्टिक प्रोटीनों के रोग मस्तिष्क संबंधी रोगों में परिणाम4,5. हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि कैसे synaptic प्रोटीन उचित समय में जमा.

कैसे synaptic प्रोटीन संगठित तरीके से जमा की जांच करने के लिए, यह कालानुक्रमिक क्रम में synaptic प्रोटीन के संचय की जांच करने के लिए आवश्यक है. कुछ रिपोर्टों में न्यूरॉन्स6,7की असंबद्ध संस्कृति में synapse गठन का निरीक्षण करने के लिए लाइव इमेजिंग का प्रदर्शन किया गया . हालांकि, यह सिर्फ माइक्रोस्कोपी के तहत synapse गठन शुरू न्यूरॉन्स खोजने के लिए समय लेने वाली है. synaptic प्रोटीन के संचय को कुशलता से निरीक्षण करने के लिए, synapse गठन समय पर शुरू करना चाहिए जब शोधकर्ताओं के गठन के लिए प्रेरित करना चाहते हैं. दूसरी चुनौती कोशिका निकायों या synapses में स्थानीय अनुवाद से परिवहन के कारण synaptic प्रोटीन के संचय भेद करने के लिए है. उस उद्देश्य के लिए, अनुवाद स्तर शर्त है कि कोशिका निकायों से synaptic प्रोटीन के परिवहन की अनुमति नहीं है के तहत मापा जा करने के लिए आवश्यक है.

हमने न्यूरॉन बॉल कल्चर के संयोजन का उपयोग करते हुए न्यूरॉन बॉल कल्चर के संयोजन का उपयोग करते हुए उपन्यास प्रेसिनेप्स गठन परख विकसित की ताकि प्रेसिनाप्स गठन 8 को प्रेरित कियाजासके . कोशिका पिंडोंकेचारों ओर के एक्सोनल शीटों के निर्माण के कारण नौनबाल-संलक्षणी की जांच करने के लिए तंत्रिका बाल संवर्धन विकसित किया गयाहै। हम ल्यूकोइन समृद्ध दोहराने ट्रांसमेम्ब्रेन न्यूरोनल 2 (LRRTM2) के साथ संयुग्मी चुंबकीय मोती का उपयोग किया है कि उत्तेजक presynapses प्रेरित करने के लिए एक presynaptic आयोजक है (चित्र 1A)11,12,13. LRRTM2 मोती का उपयोग करके, presynapse गठन समय पर शुरू जब मोती लागू कर रहे हैं. इसका मतलब यह है कि presynapse गठन एक ही समय में एक न्यूरॉन गेंद के axons के हजारों में शुरू होता है, इस प्रकार यह synaptic प्रोटीन के संचय के सटीक समय पाठ्यक्रम कुशलता से जांच करने के लिए अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, न्यूरॉन बॉल कल्चर कोशिका निकायों को हटाकर सोमा से परिवहन synaptic प्रोटीन को अवरोधित करना आसान है (चित्र 1B)8. हम पहले से ही पुष्टि की है कि सेल निकायों के बिना axons जीवित रह सकते हैं और सेल निकायों को हटाने के बाद कम से कम 4 एच स्वस्थ हैं. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल जहां synaptic प्रोटीन प्राप्त कर रहे हैं से जांच करने के लिए उपयुक्त है (सेल शरीर या एक्सॉन), और कैसे synaptic प्रोटीन संगठित तरीके से जमा.

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Protocol

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रयोगों को योकोहामा सिटी विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति में उल्लिखित दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया।

1. फांसी ड्रॉप संस्कृति के रूप में न्यूरॉन गेंदों की तैयारी (इन विट्रो में दिन (DIV) 0-3)

नोट: न्यूरॉन बॉल संस्कृति की तैयारी के लिए यहाँ वर्णित प्रक्रियाएं पहले सासाकी समूह द्वारा कुछ संशोधनों9,10के साथ रिपोर्ट की गई विधि पर आधारित हैं . हमने अलग संस्कृति14के लिए बैंकर पद्धति से कई प्रक्रियाएं भी अपनाईं .

  1. विच्छेदन प्रारंभ करने से पहले followings की पुष्टि
    1. सभी आवश्यक समाधान तैयार करें और उन्हें पहले से ऑटोक्लेव/फिल्ट्रेशन द्वारा बाँझ करें।
    2. इस cortical न्यूरॉन संस्कृति के प्रत्येक चरणों में इस्तेमाल किया जा करने के लिए सभी उपकरणों और सामग्री के लिए तैयार रखें।
    3. स्प्रे और 70% इथेनॉल के साथ स्तरीय हवा प्रवाह कैबिनेट, विच्छेदन तालिका, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप, कैंची, और forceps के मंच प्लेट पोंछ।
  2. सीओ2 के आवेदन पर माउस को यूथेनाइज करें और पेट को काट कर E16 भ्रूण प्राप्त करें।
  3. संदंश के ठीक सुझावों की मदद से भ्रूण से दिमाग को सावधानी से निकालें और उन्हें 60 मिमी सेल कल्चर व्यंजन में स्थानांतरित करें जिसमें 4 एमएल HEPES बफर्ड साल्ट सॉल्यूशन (HBSS) शामिल हैं।
    नोट: विच्छेदन मध्यम HBSS 10 एम एम HEPES (पीएच 7.4), 140 एम एम NaCl, 5.4 mM KCl, 1.09 mM Na2HPO4, 1.1 mM KH2PO4, 5.6 m D-ग्लूकोज, और 5.64 m phenol लाल होता है.
  4. खोपड़ी निकालें, घ्राण बल्ब में कटौती, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत forceps के ठीक सुझावों का उपयोग कर प्रत्येक मस्तिष्क गोलार्द्ध से अलग cortices, और ताजा HBSS युक्त एक और 60 मिमी व्यंजन के लिए स्थानांतरण. प्रत्येक अलग न्यूरॉन गेंद संस्कृति के लिए कम से कम 3-5 भ्रूण का प्रयोग करें.
  5. एक laminar प्रवाह सेल संस्कृति हुड में microsecting वसंत कैंची के साथ छोटे टुकड़ों में cortices काट.
  6. एक 15 एमएल ट्यूब के लिए कीमा बनाया cortices स्थानांतरण और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में 4.5 मिनट के लिए HBSS में 0.125% ट्रिप्सिन के 4 एमएल में कीमा बनाया cortices trypsinize।
    नोट: यह trypsinization समय बढ़ती समय के रूप में कुशल न्यूरॉन संस्कृति के लिए महत्वपूर्ण है (gt; 4.5 मिनट) बहुत अधिक मृत न्यूरॉन्स की ओर जाता है.
  7. सेल समुच्चय को एक नए 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें एक बाँझ स्थानांतरण पिपेट द्वारा 10 एमएल एचबीएस होता है, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इस चरण को एक बार और दोहराएं।
  8. एक नया 15 एमएल ट्यूब GlutaMax युक्त Neurobasal मीडिया के 2 एमएल युक्त करने के लिए सेल समुच्चय स्थानांतरण, B27 पूरक (NGB मध्यम), 0.01% DNase मैं और 10% घोड़े सीरम.
  9. बार-बार उन्हें ऊपर और नीचे (3-5 बार) आग-पॉलिश ठीक ग्लास पास्चर पिपेट का उपयोग करके trypsinized cortices triturate.
    नोट: आग पॉलिश ठीक ग्लास Pasteur pipette के व्यास बैंकर विधि कागज14में वर्णित के रूप में बहुत महत्वपूर्ण है. यदि पिपेट कॉर्टिस पास करने के लिए बहुत संकीर्ण है, तो 2-3 विभिन्न आकारों वाले पिपेट तैयार करें, और बड़े पिपेट से प्रयास करें।
  10. न्यूरॉन गेंदों की तैयारी के लिए, ऊपर सेल निलंबन लेने के लिए और 1 x 106 कोशिकाओं को सेल को समायोजित /
  11. 10 सेमी संस्कृति व्यंजनों के ऊपरी ढक्कन के अंदर 10,000 कोशिकाओं/ड्रॉप (1 ड्रॉप 10 डिग्री सेल्सियस है) युक्त फांसी बूंदों के रूप में cortical न्यूरॉन्स संस्कृति।
  12. संस्कृति व्यंजनों के निचले भाग में फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस) के 7 एमएल जोड़ें, फिर न्यूरॉन बॉल गठन के लिए अनुमति देने के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए एक इनक्यूबेटर में रखें।

2. PLL लेपित ग्लास coverslips और संस्कृति रखरखाव पर न्यूरॉन गेंदों रखकर (DIV 3-11)

नोट: पॉली-एल-लाइसिन (PLL) के साथ ग्लास कवरलिप्स को कोटिंग करने से पहले, डिटर्जेंट का उपयोग करके कवरलिप्स को धोना महत्वपूर्ण है। ग्लास covers कभी कभी न्यूरॉन संस्कृति और PLL के साथ वर्दी कोटिंग के लिए इतना साफ नहीं कर रहे हैं. गैर वर्दी PLL कोटिंग न्यूरॉन गेंदों के असमान axonal विस्तार में परिणाम हो सकता है.

  1. 1/0 पतला तटस्थ गैर फास्फोरस डिटर्जेंट में 1-3 रात के लिए चीनी मिट्टी के रैक में coverss लेना.
  2. कवरलिप्स को अल्ट्राप्योर पानी में 8 बार धोएं, और फिर 12 डिग्री सेल्सियस के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में बाँझ करें।
    नोट: यहाँ से सभी कदम एक laminar हवा प्रवाह सेल संस्कृति हुड में किया जाना चाहिए.
  3. 100 मिमी व्यंजन के लिए बेक्ड कवरलिप्स स्थानांतरण। एक ढक्कन और नीचे पकवान के बीच पैराफिल्म द्वारा पकवान सील करने के बाद, बेक्ड कवरलिप्स लंबी अवधि के भंडारण के लिए रखा जा सकता है।
  4. (वैकल्पिक) कवरलिप्स पर पैराफिन डॉट्स लागू करें। डॉट्स न्यूरॉन गेंदों प्लास्टिक व्यंजनों के लिए न्यूरॉन गेंदों के सीधे संपर्क से इम्यूनोस्टेनिंग के दौरान coverss से अलग न्यूरॉन गेंदों को रोकने के लिए अंतरिक्ष बनाते हैं। लगभग 90 डिग्री सेल्सियस पर गर्म पानी के स्नान में एक उपयुक्त बोतल में पिघल पैराफिन। पैराफिन में एक पास्चर पिपेट डुबकी, तो तेजी से इसे छूने के लिए एक coverslip के किनारे के पास तीन स्थानों बनाने के लिए.
  5. कोट PLL (MW और 300,000) पर पैराफिन-बीड ग्लास coverslips में 60 मिमी व्यंजन का उपयोग कर PLL समाधान (15 g/mL बोरेट बफर में), और उन्हें एक सीओ2 इनक्यूबेटर में कम से कम 1 एच के लिए रखें।
  6. पीबीएस के साथ 4 बार धोने के बाद, PLL लेपित कवरलिप्स को प्रत्येक कुएं में एनजीबी माध्यम के 350 डिग्री सेल्सियस युक्त 4-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें और साइटोसिन जेड-डी-अरबिनोफ्रुनोसाइड हाइड्रोक्लोराइड (एआरसी, 3 एम) को विभाजित कोशिकाओं को मारने के लिए मीडिया को।
  7. न्यूरॉन गेंदों को स्थानांतरित करने से पहले मध्यम पहुँच 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान को सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 20 मिनट के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में PLL लेपित कवरलिप्स युक्त इस 4-वेल प्लेट रखें।
  8. DIV 3 में जब "न्यूरॉन गेंदों" बहुत अच्छी तरह से गठन कर रहे हैं, उन्हें PLL लेपित coverslips पर 4-वेल प्लेट (5 न्यूरॉन गेंदों /
  9. 48 एच के बाद, ताजा AraC मुक्त NGB माध्यम के साथ न्यूरॉन गेंद संस्कृति माध्यम की जगह. एक पटलेदार वायु प्रवाह सेल संस्कृति हुड में एक गर्म प्लेट का उपयोग करें जिसका तापमान इस प्रक्रिया से ठीक पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर तैयार रखा जाता है।
    नोट: यह एक गर्म थाली पर संभव के रूप में तेजी से बदलने के माध्यम प्रदर्शन करने के लिए समय है कि संस्कृतियों सीओ2 इनक्यूबेटर के बाहर कर रहे हैं कम करने के लिए आवश्यक है।
  10. DIV 11 तक के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में इस न्यूरॉन बॉल संस्कृति रखें।
    नोट: DIV 11-12 में, न्यूरॉन गेंदों को 1-2 मिमी तक neurites विस्तार प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है.

3. कोशिका निकायों के साथ या उसके बिना न्यूरॉन बॉल संस्कृति पर LRRTM2 मोती लागू (DIV 11-12)

नोट: न्यूरॉन गेंद संस्कृति पर LRRTM2 मोती के आवेदन से पहले, यह सेल निकायों को दूर करने के लिए सिफारिश की है. इसलिए, पहले LRRTM2 मोती तैयार है, तो सेल निकायों को हटाने और बाद में जितनी जल्दी हो सके संस्कृति के लिए LRRTM2 मोती लागू होते हैं। Biotinylated LRRTM2 नोगी के समूह (योकोहामा सिटी विश्वविद्यालय) द्वारा वातानुकूलित माध्यम के रूप में प्रदान की जाती है। वे बायोटिन स्वीकारकर्ता अनुक्रम और ई से बायोटिन लिगेस सहित एक अभिव्यक्ति वेक्टर का उपयोग करें। कोलाई (बिरा) 15 , 16 LRRTM2 करने के लिए biotin संलग्न करने के लिए, और अभिव्यक्ति वेक्टर Expi293F कक्षExpi293 अभिव्यक्ति प्रणाली में शामिल करने के लिए transfected है। सदिश जानकारी अनुपूरक चित्र 1में उपलब्ध है। Biotinylated LRRTM2-संयुग्मी streptavidin मोती LRRTM2-Fc -संगित प्रोटीन एक मोती कि प्रोटोटाइप LRRTM2 प्रणाली8के लिए उपयोग किया जाता है की तुलना में बहुत प्रतिरक्षा की पृष्ठभूमि कम.

  1. biotinylated LRRTM2 मोती की तैयारी
    1. Expi293F कोशिकाओं biotinylated LRRTM2 व्यक्त की वातानुकूलित माध्यम से अतिरिक्त biotin को दूर करने के लिए, PD-10 जेल निस्पंदन कॉलम के लिए पीबीएस (कुल 2.5 एमएल) के 0.8 एमएल के साथ मिश्रित वातानुकूलित माध्यम के 1.7 एमएल लागू होते हैं। पीडी-10 कॉलम अल्ट्राप्यूरेट पानी के 25 एमएल और पीबीएस के 25 एमएल के साथ पूर्व-समतुल्य है।
    2. पीबीएस के 3.5 एमएल के साथ Elute और एक LRRTM2 शेयर के रूप में प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा.
      नोट: इस LRRTM2 शेयर aliquots के लिए वितरित किया जा सकता है और लंबी अवधि के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. biotinylated LRRTM2 की अभिव्यक्ति का स्तर कभी कभी बहुत से बहुत भिन्न है. इस प्रकार, LRRTM2 शेयर की उचित मात्रा मोती को संयुग्मी करने के लिए न्यूरॉन गेंदों पर पर्याप्त presynapses फार्म निर्धारित किया जाना चाहिए, जब LRRTM2 शेयर की नई बहुत पहली बार में प्रयोग किया जाता है.
    3. एक microcentrifuge ट्यूब के लिए streptavidin लेपित चुंबकीय कणों (व्यास: 4-5 डिग्री मी) के निलंबन से 20 डिग्री सेल्सियस ले लो। मोती को एक हस्तनिर्मित उपकरण में स्थिर करें जो नियोडिमियम स्थायी मैग्नेट से जुड़ा हुआ है और पीबीएस-एमसीबीसी के 100 डिग्री सेल्सियस ट्यूब के साथ तीन बार धोएं।
      नोट: पीबीएस-एमसीबीसी 5 एमएम MgCl2,3 एम एम CaCl2, 0.1% बीएसए, और 0.1% पूरा EDTA मुक्त सहित पीबीएस शामिल हैं।
    4. मोती से पूरी तरह से PBS-MCBC को निकालने के बाद, LRRTM2 स्टॉक की पूर्व निर्धारित मात्रा जोड़ें (आमतौर पर 500-1,000 $L, ध्यान दें 3.1.2) को धोया मोती देखें. 1-2 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रोटेटर का उपयोग करके मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    5. पीबीएस-एमसीबीसी के 100 डिग्री सेल्सियस के साथ दो बार मोती धो लें, और बाद में एनजीबी माध्यम के 100 डिग्री सेल्सियस के साथ।
    6. न्यूरॉन गेंद संस्कृति के लिए आवेदन के लिए NGB माध्यम के 50 डिग्री एल में LRRTM2 मोती को पुन: निलंबित.
    7. biotinylated-LRRTM2 प्रोटीन जोड़ने के अलावा एक और microcentrifuge ट्यूब में नियंत्रण मोती (नकारात्मक नियंत्रण) तैयार करने के लिए एक ही प्रक्रिया का प्रयोग करें.
  2. DIV 11-12 में न्यूरॉन गेंदों से सेल निकायों को हटाना और LRRTM2 मोती लागू करना
    1. "सेल बॉडी (+)" और "सेल बॉडी (-)" के रूप में 4-वेल प्लेट के कुओं को लेबल करें।
    2. एक उस्तरा ब्लेड के साथ 45 डिग्री कोण पर एक पीले टिप के अंत में कटौती पहले स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव (चित्र 1B) .
    3. एक न्यूरॉन गेंद के कोशिका शरीर क्षेत्र पर पीला टिप अंत रखो और चूषण द्वारा सेल निकायों को हटा दें (चित्र 1ख)।
    4. प्रयोग की प्रत्येक निर्दिष्ट शर्त की पहचान करने के लिए, कुओं को फिर से "LRRTM2 मोती" और "नियंत्रण मोती" के रूप में लेबल करें.
    5. LRRTM2 लागू करें और न्यूरॉन गेंद संस्कृति पर मोती नियंत्रण, और के लिए प्लेटों के नीचे करने के लिए डूब 1 मिनट फेराइट मैग्नेट का उपयोग करने के लिए presynapse गठन शुरू करते हैं. यह प्रक्रिया एक ही समय में सभी मोती touchdown करने के लिए सुनिश्चित करता है. विशेष रूप से, यह कम समय ऊष्मायन (उदाहरण के लिए, 30 मिनट और 1 ज) LRRTM2 मोती तुल्यकालिक के साथ के लिए प्रभावी होगा।
    6. समय-पाठ्यक्रम प्रयोगों को करने के लिए, प्रत्येक अलग-अलग के रूप में लेबल 0 मिनट, 30 मिनट, 1 एच, 2 एच, 4 एच और 18 एच और संकेत समय अंतराल पर LRRTM2 मोती लागू होते हैं।
    7. LRRTM2 मोती के अलावा के बाद, निर्दिष्ट समय के लिए मोती के साथ न्यूरॉन गेंद संस्कृति इनक्यूबेट (0 मिनट से 18 ज) presynapses फार्म.

4. इम्यूनोस्टेनिंग और माइक्रोस्कोपी

नोट: के साथ और सेल निकायों के बिना प्रयोगात्मक स्थितियों में LRRTM2 मोती के साथ ऊष्मायन के माध्यम से 4 एच के लिए कोशिकाओं को ठीक करें, के रूप में axons धीरे-धीरे 4 ज के बाद सेल निकायों के अभाव में मरने के लिए करते हैं। LRRTM2 मोती के साथ समय पाठ्यक्रम के मामले में, संकेत निर्दिष्ट समय पर कोशिकाओं को ठीक.

  1. LRRTM2 मोती के साथ presynapse गठन के बाद न्यूरॉन गेंद संस्कृति में फिक्सिंग और धुंधला न्यूरॉन्स
    1. NGB मध्यम निकालें और पीबीएस में 4% पीएफए के साथ न्यूरॉन गेंदों को ठीक (250 $L/अच्छी तरह से) कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए, और फिर पीबीएस के 500 $L के साथ धोने 4 बार प्रत्येक 5 मिनट.
    2. टीबीएस के साथ निश्चित कोशिकाओं को धो लें (ट्रिस-बफरेड नमकीन: 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.3) और 150 एमएम NaCl से अधिक 5 मिनट के लिए।
    3. 5 मिनट के लिए 0.3% Triton X-100 युक्त टीबीएस के साथ न्यूरॉन बॉल संस्कृति की कोशिकाओं /
    4. टीबीएस में बफर (0.1% ट्राइटन एक्स-100 और 5% एनजीएस (सामान्य बकरी सीरम) को अवरुद्ध करने के साथ अवरुद्ध करने के लिए कोशिकाओं को 1 एच रखें।
    5. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें; विरोधी rabbit-vGlut1 (vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 1 (1:4000)) और विरोधी माउस-Munc18-1 (1:300) पर रात भर के लिए एंटीबॉडी diluent के साथ पतला 4 डिग्री सेल्सियस.
    6. कवरलिप्स को इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) बफर (0.1% ट्राइटन एक्स-100 और टीबीएस में 2% बीएसए) के साथ 4 बार धोएं और 30 मिनट के लिए फ्लोरोफोर (एलेक्सा डाई)-कंजुटेड 2 एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें; एंटी-माउस-आईजीजी-एलेक्सा 555 (1:500), एंटी रैबिट-आईजी-एलेक्सा 488 (1:1000)।
    7. पीबीएस में 4$, 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (डीएपीआई, 1 डिग्री जी/एमएल) के साथ 5 मिनट के लिए न्यूरॉन्स के कोशिका निकायों के नाभिक को दागें।
    8. कवरलिप्स को पीबीएस के साथ तीन बार धोएं और फिर बढ़ते मीडिया का उपयोग करके कांच की स्लाइडपर पर माउंट करें जिसमें 167 मिलीग्राम/एमएल पॉली (विनविन) अल्कोहल और 6 मिलीग्राम/एमएल एन-प्रोपिल गैलेट शामिल हैं।
    9. कांच की स्लाइडों को -20 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोस्कोपी तक फ्रिज में रखें। कांच स्लाइड के फ्लोरोसेंट संकेतों को कम से कम 1 वर्ष के लिए पता लगाया जाता है जब स्लाइड -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत की जाती हैं।
  2. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत छवियों को ले जा रहा है
    1. 60X तेल विसर्जन लेंस का उपयोग कर एक ठंडा सीसीडी कैमरा के साथ एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत अंतर हस्तक्षेप इसके विपरीत और अगर छवियों पर कब्जा। छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के लिए, एक सॉफ्टवेयर स्थापित माइक्रोस्कोप प्रणाली का उपयोग करें. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के रूप में छवि J का उपयोग करें.
    2. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग कर एक्सॉन में presynapses में IF तीव्रता को मापने; यदि मोती पर ब्याज के क्षेत्र की तीव्रता (आरओआई) - बंद मोती क्षेत्र तीव्रता / यह अनुपात तीव्रता प्रोटीन संचय सूचकांक प्रदान करती है (चित्र 4क) छवि J सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मूल 16-बिट छवियों पर माप को पूरा करें.
    3. LRRTM2 मोती के साथ प्रेरित presynapse में विशेष प्रोटीन के संचय स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हमेशा देखने के 2-क्षेत्र या अधिक माइक्रोस्कोप (60X) के साथ सेल शरीर से अलग से दूर क्षेत्र का चयन करें।
      नोट: इमेजिंग के लिए न्यूरॉन गेंद में क्षेत्र का चयन महत्वपूर्ण है के रूप में घने axons सेल शरीर के पास हैं और न्यूरॉन गेंद की परिधि एकल एक्सॉन प्रदान कर सकते हैं.
    4. सटीक माप के लिए, 5-अलग एक्सोनल क्षेत्र (सेल निकायों से समान दूरी) /coverslip चुनें।
    5. अलग अलग दिन में और प्रयोगों के बीच में समान इमेजिंग स्थितियों रखें

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Representative Results

यहाँ, हम LRRTM2 में presynaptic प्रोटीन के संचय के प्रतिनिधि परिणाम दिखाने न्यूरॉन गेंद संस्कृति के axonal शीट के presynapses प्रेरित. presynaptic प्रोटीन के रूप में, हम उत्तेजक synaptic vesicle प्रोटीन vGlut1 और सक्रिय क्षेत्र प्रोटीन Munc18-1 का विश्लेषण किया. हम भी presynapses में vGlut1 और Munc18-1 के संचय के समय पाठ्यक्रम की जांच की, और प्राप्त परिणाम सेल निकायों और एक प्रोटीन संश्लेषण अवरोध करनेवाला हटाने axons का उपयोग कर presynapses में Munc18-1 के स्रोत का संकेत. हाल ही में, हम presynapses8में Munc18-1 के संचय पर नाजुक एक्स मानसिक मंदता प्रोटीन (FMRP) की भूमिका की जांच की है. FMRP, जो नाजुक एक्स सिंड्रोम (FXS) का एक कारक जीन उत्पाद है, अनुवाद को दबाने के लिए एक MRNA बाध्यकारी प्रोटीन है17,18,19. हम भी FXS मॉडल चूहों जो Fmr1 जीन एन्कोडिंग FMRP में कमी है का उपयोग कर Munc18-1 संचय में FMRP की भागीदारी की जांच की.

LRRTM2-beads के आवेदन DIV11 में न्यूरॉन गेंद संस्कृति में न्यूरॉन गेंद संस्कृति में न्यूरॉन गेंदों के presynapses में Munc18-1 के संचय प्रेरित (चित्र 2A)। यहां तक कि एक्सॉन में जो कोशिका निकायों को हटा दिया जाता है, Munc18-1 का संचय कोशिका निकायों के साथ न्यूरॉन गेंदों के एक्सॉन के समान मोती के नीचे देखा गया था (चित्र 2ख)। ठेठ मामले में, न्यूरॉन गेंदों के साथ 4 एच इनक्यूबेशन के बाद मोती के 80% से अधिक presynapses में synaptic प्रोटीन के संचय प्रेरित कर सकते हैं, Munc18-1 और vGlut-1 धुंधला द्वारा न्याय. क्योंकि एक्सॉन ्स्सन इतनी भीड़ और सेल निकायों के पास ओवरलैप होते हैं (चित्र 2आ, बा), एक्सोनल शीट के अधिक परिधीय क्षेत्र को मापा गया था जहां एक्सॉन्स इतने ओवरलैप नहीं होते हैं ( चित्र2अब, बी बी ,उदाहरण के लिए, परिधीय क्षेत्र 2-क्षेत्र से दूर सूक्ष्मदर्शी (60X) के साथ कोशिका शरीर से अधिक दृश्य या अधिक। जब एक्सोनल शीट के परिधीय क्षेत्र का विश्लेषण उच्च-आवर्धन अभिदृश्यक लेंस (60X), वग्लस1 तथा मुनक18-1 द्वारा मोतियों के अधीन अक्षों के पूर्वासन में स्पष्ट रूप से संचित किया गया (चित्र 3)। कभी-कभी, vGlut1 जैसे synaptic vesicular प्रोटीन के फ्लोरोसेंट संकेत ों की मोतियों के बाहर axonal क्षेत्र में पता लगाया जा करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं, क्योंकि इन synaptic vesicular प्रोटीन मोती के तहत इतना जमा. Munc18-1 के मामले में, फ्लोरोसेंट संकेतों मोती के बाहर axonal क्षेत्र में कमजोर पाया जा सकता है.

LRRTM2-beads द्वारा प्रेरित presynapses में synaptic प्रोटीन के संचय स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए, मोती के तहत और मोती के बाहर axons के फ्लोरोसेंट तीव्रता मापा गया, और फिर के रूप में गणना "प्रोटीन संचय सूचकांक" (चित्र 4A, और विस्तार से प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित). समय-समय पर किए गए प्रयोगों से पता चलता है कि presynapses में vGlut1 के संचय में 30 मिनट में काफी वृद्धि हुई (चित्र 4ठ) . दूसरी ओर, Munc18-1 संचय 2 ज पर काफी वृद्धि करने के लिए शुरू कर दिया, और 4 ज पर एक पठार तक पहुँचने (चित्र 4C) . इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि synaptic vesicle प्रोटीन vGlut1 सक्रिय क्षेत्र प्रोटीन Munc18-1 से पहले presynapses में जमा. Fmr1-KO न्यूरॉन्स के presynapses में Munc18-1 संचय जंगली प्रकार (WT) (चित्र4C)में उन लोगों की तुलना में 1.5 गुना अधिक वृद्धि हुई है, Munc18-1 संचय में FMRP की भागीदारी का संकेत. इसके बाद, कोशिका निकायों या एक्सॉन में स्थानीय अनुवाद से परिवहन के कारण Munc18-1 संचय भेद करने के लिए, प्रोटीन संश्लेषण अवरोधक anisomycin के प्रभाव सेल निकायों की उपस्थिति या अनुपस्थिति में संचय पर जांच की गई (चित्र 4D) . एनिसोमामाइसिन ने एक्सॉनमें मुनक18-1 संचय को काफी दबा दिया (चित्र 4D), यह दर्शाता है कि संचय प्रोटीन संश्लेषण पर निर्भर है। कोशिका निकायों के बिना अक्षों के प्रेसिनाप्स में संचय कोशिका निकायों के साथ काफी भिन्न नहीं था (चित्र 4D) . इन परिणामों से पता चलता है कि presynapses में Munc18-1 का संचय ज्यादातर axons से प्राप्त कर रहे हैं, लेकिन कोशिका निकायों से Munc18-1 के परिवहन नहीं. यदि कोशिका निकायों को हटाकर अक्षों के प्रेसिनों में synaptic प्रोटीन का संचय दबा दिया जाता है, तो यह माना जाता है कि यह कमी कोशिका निकायों से परिवहन के कारण होती है। वास्तव में, जब हम कुल नए संश्लेषित प्रोटीन के संचय की जांच चयापचय फ्लोरोसेंट डाई द्वारा लेबल, सेल निकायों को हटाने काफी कुल नए संश्लेषित प्रोटीन के संचय कम, के साथ axons के presynapses की तुलना में कोशिका निकायों8| हालांकि Fmr1-KO में Munc18-1 संचय WT की तुलना में अधिक वृद्धि हुई है, anisomycin WT के लिए इसी तरह के स्तर में संचय दबा दिया और सेल निकायों को हटाने संचय पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा (चित्र 4D)। इन परिणामों का सुझाव है कि FMRP axons में Munc18-1 के स्थानीय अनुवाद में शामिल है.

यहाँ प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम ों का प्रदर्शन है कि इस विधि की जांच कैसे synaptic प्रोटीन समय पाठ्यक्रम प्रयोगों द्वारा संगठित तरीके से जमा करने के लिए उपयुक्त है, और synaptic प्रोटीन के स्रोत की जांच करने के लिए (सेल निकायों या स्थानीय से परिवहन कोशिका निकायों को हटाने के द्वारा axons में अनुवाद.।

Figure 1
चित्र 1. न्यूरॉन गेंद से कोशिका निकायों के निर्माण और हटाने की योजना।
(क) Presynapse गठन परख biotinylated LRRTM2 संयुग्मी streptavidin मोती का उपयोग करने के लिए E16 cortices से तैयार न्यूरॉन गेंद संस्कृति के axons में presynapses प्रेरित. LRRTM2, एक postsynaptic प्रोटीन, neurexin (NRXN) बांधता है और एक presynapse आयोजक के रूप में कार्य. Streptavidin मोती biotinylated LRRTM2 extracellular क्षेत्रों (LRRTM2 मोती) के लिए conzuated न्यूरॉन गेंद संस्कृति के लिए presynapses प्रेरित करने के लिए DIV11-12 पर लागू किया गया. यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन8से संशोधित किया गया है। (बी) पीले सिरे अंत काट दिया गया था और 45 डिग्री कोण पर न्यूरॉन गेंद संस्कृति के सेल शरीर क्षेत्र पर रखा गया था। कोशिका निकायों को चूषण द्वारा हटा दिया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. न्यूरॉन गेंद के कोशिका निकायों की उपस्थिति और अनुपस्थिति में presynapses में Munc18-1 संचय.
(A) LRRTM2 मोती के साथ 4 एच ऊष्मायन के बाद, सक्रिय क्षेत्र प्रोटीन Munc18-1 axons में प्रेरित presynaptic साइटों पर जमा (ऊपरी पैनल; प्रयोगात्मक योजना, मध्य; चरण छवि, कम; यदि Munc18-1 संचय की छवियों). छवियाँ 10X लेंस और मध्यवर्ती आवर्धन (1.5X) का उपयोग कर कम आवर्धन छवियों के रूप में कब्जा कर लिया एक न्यूरॉन गेंद, axons, और मोती से बना पूरी तस्वीर को देखने के लिए किया गया. डैश्ड वर्ग मोती की सटीक इमेजिंग स्थिति के लिए न्यूरॉन गेंद के क्षेत्र का संकेत देते हैं। स्केल बार, 20 डिग्री मीटर (बाएं; मूल छवि), 10 डिग्री मीटर (दाएं; बढ़े हुए छवि)। (बी) Munc18-1 बहुत अच्छी तरह से जमा भी axons में प्रेरित presynaptic स्थलों पर सेल निकायों के अभाव में. यह परिणाम इंगित करता है कि एक्सॉन जीवित रह सकते हैं और कम से कम 4 ज के लिए सेल निकायों को हटाने के बाद भी presynapses फार्म कर सकते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. के साथ और सेल निकायों के बिना axons के presynapses में vGlut1 और Munc18-1 का संचय.
उत्तेजक presynaptic मार्कर vGlut1 (हरा) और Munc18-1 (लाल) LRRTM2 मोती के अलावा के बाद presynapses 4 एच में जमा. (ऊपरी पैनल; कोशिका निकायों के साथ, निचला; कोशिका निकायों के बिना)। छवियाँ फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने के लिए उच्च आवर्धन के लिए 60X तेल विसर्जन लेंस का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया. डैश्ड सर्कल ने मोतियों की स्थिति को रेखांकित किया। Munc18-1 presynapses में सेल निकायों की उपस्थिति और अनुपस्थिति में लगभग समान हद तक जमा लेकिन vGlut1 संचय सेल निकायों8के बिना कम हो गया है. स्केल बार, 5 m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. यदि तीव्रता माप और कोशिका निकायों को हटाने और न्यूरॉन गेंदों में Munc18-1 संचय पर प्रोटीन संश्लेषण अवरोध करनेवाला के प्रभाव की प्रक्रिया.
(क) आरेख ने न्यूरॉन बॉल कल्चर के एक्सॉन में प्रेरित-प्रसिनैप्टिक स्थल पर आईएफ तीव्रता की परिमाणीकरण विधि को दर्शाया। स्केल बार, 5 डिग्री मी. विवरण प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित हैं। (बी) LRRTM2 मोती के साथ प्रेरित presynapses में vGlut1 संचय का समय पाठ्यक्रम. दिखाए गए आँकड़ों का अर्थ है - SEM for n ] 20. Tukey के कई तुलना परीक्षण के साथ दो तरह से ANOVA. ** पी एंड एलटी; 0.01. (सी) LRRTM2 मोती के तहत WT और Fmr1-KO presynapses में Munc18-1 संचय का समय पाठ्यक्रम। दिखाए गए डेटा मतलब हैं - SEM n के लिए $ 20, Tukey के एकाधिक तुलना परीक्षण के साथ दो तरह से ANOVA. एन.एस., महत्वपूर्ण नहीं; * *पी एंड एलटी; 0.01, WT और KO के बीच काफी अलग है। (डी) बार ग्राफ में डब्ल्यूटी और एफएमआर1-कोन्यूरॉन गेंदों के प्रेसिनाप्स में 25 डिग्री सेल्सियस एनिसोमामाइसिन (एनिसो) के साथ (सीबी+) या बिना (सीबी-) सेल निकायों के साथ Munc18-1 संचय स्तर दिखाया गया है। दिखाए गए आँकड़ों का अर्थ है - SEM for n ] 20. Tukey के कई तुलना परीक्षण के साथ दो तरह से ANOVA. * *पी एंड एलटी; 0.01, एन.एस., महत्वपूर्ण नहीं है। $ संकेत दिया p और lt; 0.01, के साथ और anisomycin के बिना काफी अलग है. इन आंकड़ों को पिछले प्रकाशन8से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 1. LRRTM2-ECR (अतिरिक्त कोशिकीय क्षेत्र) और BirA (ई. कोलाई से बायोटिन लिगेस) के लिए बिसिस्टरोनिक अभिव्यक्ति वेक्टर।
LRRTM2-ECR और BirA कोडिंग दृश्यों के बीच, वहाँ एक आंतरिक Ribosomal प्रवेश साइट (IRES) अनुक्रम है कि सह एकल MRNA से दोनों प्रोटीन एक्सप्रेस की अनुमति देता है. HEF1-HTLV प्रमोटर ड्राइव expresson bicstronic MRNA, और दोनों प्रोटीन संकेत पेप्टाइड अनुक्रम द्वारा अनुवाद के बाद स्रावित कर रहे हैं. LRRTM2-ECR कोडिंग अनुक्रम कई पेप्टाइड टैग दृश्यों (DYKDDK, TEV, Myc और उसके टैग) और Biotin Acceptor अनुक्रम (BAS) से जुड़ा हुआ है. BirA DYKDDDV टैग से जुड़ा हुआ है। स्रावित बीरा बायोटिनीलेट्स एलआरआरटीएम2-ईसीआर के बीएएस अनुक्रम के लाइसिन को स्ट्रेप्टाविडिन मोती से बांधने के लिए। कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए.

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Discussion

हम न्यूरॉन गेंद संस्कृति का उपयोग कर LRRTM2-beads के साथ प्रेरित presynapse गठन की जांच करने के लिए उपन्यास विधि विकसित की है। वर्तमान में, अधिकांश presynapse गठन परख में पॉली-डी-लाइसिन (पीडीएल)-कोटित मोती औरअलग संस्कृति / इस विधि के लाभमें से एक LRRTM2-beads है. जबकि LRRTM2 neurexin के साथ सूचना का आदान-देना उत्तेजक presynapses विशेष रूप से बनाने के लिए11,12,13, PDL-beads दोनों उत्तेजक और निरोधात्मक presynapses गैर विशेष रूप से20प्रेरित करता है. इस विधि में, अन्य presynapse आयोजकों, जिनकेसदस्यों से अधिक कर रहे हैं 10 प्रोटीन 3, प्रयोगात्मक उद्देश्य के आधार पर biotinylated प्रोटीन के extracellular डोमेन बदलकर presynapses प्रेरित करने के लिए लागू होते हैं.

एक और लाभ न्यूरॉन गेंद संस्कृति है. कुछ मामलों में, पारंपरिक असंबद्ध संस्कृति का उपयोग पूर्वासन रचना20का विश्लेषण करने के लिए किया जाता था। हालांकि, अलग संस्कृति presynapses के भीतर synaptic प्रोटीन के निम्न स्तर का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त नहीं है, क्योंकि सेल निकायों और dendrites में भारी संकेत presynapses में संकेत हस्तक्षेप. इसके बजाय, कुछ समूह माइक्रोफ्लूइडिक चैम्बर में असंबद्ध संस्कृति का उपयोग करते हैं जो 2 comprtments21,22में अलग से संस्कृति एक्सॉन और सेल निकायों के लिए विशेष उपकरण है। microfluidic कक्ष का उपयोग करना, axonal शीट axonal डिब्बे में गठन किया है, और सेल निकायों सेल शरीर के डिब्बे से हटाया जा करने में सक्षम हैं, न्यूरॉन गेंद संस्कृति के समान. हालांकि, microfluidic कक्ष विशेष उपकरण है, और कुछ कौशल की आवश्यकता के लिए निरंतर संस्कृति की स्थिति को बनाए रखने. न्यूरोन बॉल संस्कृति विशेष उपकरण का उपयोग करने के लिए आवश्यक नहीं है, और अपेक्षाकृत एक नई प्रयोगात्मक विधि के रूप में पेश किया जा करने के लिए आसान है। क्योंकि न्यूरॉन गेंद संस्कृति का सार सिर्फ न्यूरॉन सेल समुच्चय जगह है (न्यूरॉन गेंदों) कांच के नीचे पकवान / उदाहरण के लिए, यह माना जाता है कि न्यूरॉन गेंद संस्कृति LRRTM2 मोती का उपयोग कर उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए एक ही समय में 10-20 मोती क्षेत्र के फ्लोरोसेंट को मापने के लिए लागू है.

इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम PLL के साथ कोटिंग है. यदि PLL कोटिंग वर्दी नहीं है, न्यूरॉन गेंदों के axons सभी दिशा में समान रूप से विस्तार नहीं होगा. यह presynapse गठन के कुशल विश्लेषण परेशान. हम ग्लास coverslips और कांच के नीचे व्यंजन का उपयोग करें, तथापि, कांच कभी कभी न्यूरॉन संस्कृति और PLL के साथ वर्दी कोटिंग के लिए इतना साफ नहीं है. इस प्रोटोकॉल में, पहले, कांच के कवरलिप्स और कांच के नीचे के व्यंजन रात भर के लिए तटस्थ गैर-फॉस्फोरस डिटर्जेंट में भिगोए जाते हैं, और फिर अल्ट्राप्यूर पानी के साथ 8 बार धोया जाता है। हम PLL जिसका आणविक वजन और 300,000 का उपयोग करने के लिए अपनी एकाग्रता को कम करने के लिए (15 g/mL) कम अवांछनीय पृष्ठभूमि के लिए. यदि पीएलएल(जैसे, 30,000-70,000) का कम आण्विक भार उपयोग किया जाता है, तो एक्सॉन का विस्तार करने के लिए उच्च सांद्रता (100 ग्राम/एमएल) आवश्यक है।

इस विधि की सीमा है कि न्यूरॉन गेंद संस्कृति को बनाए रखने नहीं कर सकते हैं और DIV15-16. न्यूरॉन गेंदों के Axons DIV15-16 के बाद खंडित कर रहे हैं. खंडित axons LRRTM2 मोती आवेदन के बाद किसी भी presynapse का उत्पादन नहीं करते। इस प्रकार, इस विधि परिपक्व न्यूरॉन्स का विश्लेषण करने के लिए लागू नहीं है (gt; DIV21). हालांकि, ज्यादातर मामलों में11,12,21,22, presynapse गठन परख युवा न्यूरॉन्स कि DIV14 तक सुसंस्कृत कर रहे हैं का उपयोग करता है. एक और सीमा है कि कोशिका निकायों के बिना axons 4 एच से अधिक जीवित नहीं रह सकते हैं. हम presynapses में 5 synaptic प्रोटीन के संचय का विश्लेषण अब तक, सभी प्रोटीन हम जाँच का संचय 4 ज (अप्रकाशित अवलोकन) के भीतर लगभग पठार तक पहुँच गया. यह माना जाता है कि synaptic प्रोटीन पर्याप्त जमा 4 ज पर विश्लेषण करने के लिए जहां synaptic प्रोटीन से प्राप्त कर रहे हैं (सेल शरीर या एक्सॉन).

LRRTM2-beads के साथ न्यूरॉन गेंद संस्कृति का संयोजन कई प्रयोगात्मक प्लेटफार्मों अनुकूलन करने के लिए अपेक्षाकृत सरल और लचीला है. हम पहले से ही AM1-43 डाई (अप्रकाशित अवलोकन) का उपयोग कर presynaptic गतिविधि को मापने के लिए इस विधि लागू किया है. इस विधि को उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए लागू माना जाता है। Presynapse गठन परख LRRTM2-beads के तहत गठित presynapses में synaptic प्रोटीन धुंधला द्वारा उच्च सामग्री स्क्रीनिंग लागू करने के लिए संभव है. इस विधि मस्तिष्क संबंधी बीमारी का इलाज करने के लिए नए यौगिकों को खोजने के लिए योगदान देगा.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम आंशिक रूप से जेपीएस अनुदान-इन-एड फॉर साइंटिफिक रिसर्च (KAKENHI) (C) (संख्या 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki) द्वारा समर्थित है। हम कृपया biotinylated LRRTM2 प्रोटीन प्रदान करने के लिए डॉ Terukazu Nogi और सुश्री Makiko Neyazaki (योकोहामा सिटी विश्वविद्यालय) धन्यवाद. हम भी तकनीकी सहायता के लिए Honami Uechi और री Ishii धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody diluent DAKO S2022
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-585-151
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-545-152
mouse anti-Munc18-1 BD Biosciences 610336
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044
Bovine Serum Alubumin (BSA) Nacalai Tesque 01863-48
Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) Nunc 176740
Complete EDTA-free Roche 11873580001
cooled CCD camera Andor Technology iXON3
Coverslip Matsunami C015001 Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) Sigma-Aldrich C1768
4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Nacalai Tesque 11034-56
Deoxyribonuclease 1 (DNase I) Wako pure chemicals 047-26771
Expi293 Expression System Thermo Fisher Scientific A14635
Horse serum Sigma-Aldrich H1270
image acquisition software Nikon NIS-element AR
Image analysis software NIH Image J https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted fluorecent microscope Nikon Eclipse Ti-E
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Neurobasal media Thermo Fisher Scientific #21103-049
Normal Goat Serum (NGS) Thermo Fisher Scientific #143-06561
N-propyl gallate Nacalai Tesque 29303-92
Paraformaldehyde (PFA) Nacalai Tesque 26126-25

Paraplast Plus		 Sigma-Aldrich P3558
Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) Nacalai Tesque 28359-54
poly (vinyl alcohol) Sigma P8136
Prepacked Disposable PD-10 Columns GE healthcare 17085101
rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 Synaptic Systems 135-302
SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) Nacalai Tesque 41506-04
Streptavidin-coated magnetic particles Spherotech Inc SVM-40-10 diameter: 4-5 µm
TritonX-100 Nacalai Tesque 35501-15
Trypsin Nacalai Tesque 18172-94

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References

  1. Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
  2. Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).
  3. Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).
  4. Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
  5. Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).
  6. Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).
  7. Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).
  8. Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. , (2018).
  9. Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).
  10. Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).
  11. Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
  12. de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
  13. Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  15. Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. , (2017).
  16. Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).
  17. Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).
  18. Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).
  19. Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).
  20. Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).
  21. Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
  22. Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).

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Parvin, S., Takeda, R., Sasaki, Y. Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and “Neuron Ball” Culture. J. Vis. Exp. (150), e59893, doi:10.3791/59893 (2019).

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