Summary
Presynapse vorming is een dynamisch proces, met inbegrip van accumulatie van synaptische eiwitten in de juiste volgorde. Bij deze methode wordt presynapse vorming geactiveerd door kralen geconjugeerd met een presynapse Organizer eiwit op axonale vellen van "neuron Ball" cultuur, zodat accumulatie van synaptische eiwitten gemakkelijk kan worden geanalyseerd tijdens presynapse vorming.
Abstract
Tijdens neuronale ontwikkeling, Synapse vorming is een belangrijke stap voor het vaststellen van neurale circuits. Om synapsen vormen, synaptische eiwitten moeten worden geleverd in de juiste volgorde door transport van cellichamen en/of lokale vertaling in onrijpe synapsen. Echter, het is niet volledig begrepen hoe synaptische eiwitten accumuleren in de synapsen in de juiste volgorde. Hier presenteren we een nieuwe methode om presynaptische vorming te analyseren door gebruik te maken van de combinatie van neuron balcultuur met kralen om presynapse vorming te induceren. Neuron ballen die neuronale celgranulaten bieden axonale vellen ver van cellichamen en dendrites, zodat zwakke fluorescerende signalen van presynapses kunnen worden gedetecteerd door het vermijden van overweldigende signalen van cellichamen. Als kralen om presynapse vorming te triggeren, gebruiken we kralen die worden geconjugeerd met Leucine-rijke herhalings transmembraan neuronale 2 (LRRTM2), een excitatory presynaptische organisator. Met deze methode hebben we aangetoond dat vesiculaire glutamaat Transporter 1 (vGlut1), een Synaptisch blaasje eiwit, dat in presynapses sneller is opgebouwd dan Munc18-1, een actief zone-eiwit. Munc18-1 geaccumuleerde vertaling-afhankelijk van presynapse zelfs na het verwijderen van cellichamen. Deze bevinding geeft de Munc18-1 accumulatie door lokale vertaling in axonen, niet transport van cellichamen. Concluderend, deze methode is geschikt voor het analyseren van accumulatie van synaptische eiwitten in presynapses en de bron van synaptische eiwitten. Als neuron bal cultuur is eenvoudig en het is niet nodig om speciale apparatuur te gebruiken, deze methode kan worden toegepast op andere experimentele platforms.
Introduction
Synapse vorming is een van de kritische stappen tijdens de ontwikkeling van neurale circuits1,2,3. Vorming van synapsen die gespecialiseerde compartimenten zijn samengesteld uit pre-en post synapsen is een complex en meerstaps proces waarbij de juiste herkenning van axonen en dendrites, vorming van actieve zone en postsynaptisch dichtheid, en juiste uitlijning van ion kanalen en neurotransmitter receptoren1,2. In elk proces, vele soorten synaptische eiwitten accumuleren tot deze gespecialiseerde compartimenten in de juiste timing door het vervoeren van synaptische eiwitten uit cellichamen en/of door lokale vertaling in de compartimenten. Deze synaptische eiwitten worden beschouwd als georganiseerd op georganiseerde wijze te vormen functionele synapsen. Dysfunctie van sommige synaptische eiwitten met betrekking tot Synapse vorming resulteert in neurologische aandoeningen4,5. Echter, het blijft onduidelijk hoe synaptische eiwitten accumuleren in de juiste timing.
Om te onderzoeken hoe synaptische eiwitten zich op georganiseerde wijze ophopen, is het noodzakelijk om accumulatie van synaptische eiwitten in chronologische volgorde te onderzoeken. Sommige rapporten toonden Live beeldvorming aan Synapse vorming in de gezien cultuur van neuronen6,7observeren. Het is echter tijdrovend om neuronen te vinden die net Synapse vorming onder microscopie starten. Om accumulatie van synaptische eiwitten efficiënt observeren, Synapse vorming moet beginnen op het moment dat de onderzoekers willen de vorming te induceren. De tweede uitdaging is het onderscheiden van de accumulatie van synaptische eiwitten als gevolg van het transport van cellichamen of lokale vertaling in synapsen. Daartoe moet het Vertaal niveau worden gemeten onder de voorwaarde dat het transport van synaptische eiwitten uit cellichamen niet mogelijk is.
We ontwikkelden nieuwe presynapse formatie assay met behulp van een combinatie van neuron bal cultuur met kralen voor het opwekken van presynapse vorming8. Neuron Ball Culture is ontwikkeld om axonale fenotype te onderzoeken, als gevolg van de vorming van axonale vellen rondom cellichamen9,10. We gebruikten magnetische kralen geconjugeerd met Leucine-rijke herhaalde transmembraan neuronale 2 (LRRTM2) dat is een presynaptische organisator voor het opwekken van excitatory presynapses (Figuur 1a)11,12,13. Door gebruik te maken van de LRRTM2 Beads beginnen presynapse formatie op het moment dat de kralen worden aangebracht. Dit betekent dat presynapse vorming begint in duizenden axonen van een neuron bal op dezelfde tijden, dus het maakt het mogelijk om te onderzoeken precieze tijdsverloop van accumulatie van synaptische eiwitten efficiënt. Bovendien, neuron bal cultuur is gemakkelijk te blokkeren transport synaptische eiwitten uit Soma door het verwijderen van cellichamen (Figuur 1b)8. We hebben al bevestigd dat axonen zonder cellichamen kunnen overleven en ten minste 4 uur gezond zijn na verwijdering van cellichamen. Dus, dit protocol is geschikt om te onderzoeken van waar synaptische eiwitten zijn afgeleid (cel lichaam of Axon), en hoe synaptische eiwitten accumuleren op georganiseerde wijze.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De in dit manuscript beschreven experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen die zijn uiteengezet in het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Yokohama City University.
1. bereiding van neuron ballen als hangende druppel cultuur (dagen in vitro (DIV) 0-3)
Opmerking: de hier beschreven procedures voor de bereiding van neuron bal cultuur zijn gebaseerd op de methode eerder gerapporteerd door de Sasaki groep met enkele wijzigingen9,10. We hebben ook verschillende procedures overgenomen van de bankier methode voor gezien Culture14.
-
Bevestigen van de volgers voor het begin van de dissectie
- Bereid alle benodigde oplossingen voor en steriliseer ze vooraf door autoclaaf/filtratie.
- Houd alle instrumenten en materialen klaar om in elke stap van deze corticale neuron cultuur te worden gebruikt.
- Spray en veeg de laminaire luchtstroom kast, dissectie tafel, podium plaat van stereomicroscoop, schaar en Tang met 70% ethanol.
- Euthaniseer de muis op toepassing van CO2 en ontleden de buik om e16 embryo's te verkrijgen.
- Verwijder de hersenen zorgvuldig uit embryo's met behulp van fijne tips van de Tang en breng ze over in 60 mm celkweek gerechten met 4 mL HEPES gebufferde zoutoplossing (HBSS).
Opmerking: de dissectie medium HBSS bevat 10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,09 mM na2HPO4, 1,1 mm KH2po4, 5,6 mm D-glucose en 5,64 μM fenolrood. - Verwijder de hoofdhuid, snijd de olfactorische bol, scheid de cortices van elke hersen hemisfeer met behulp van de fijne uiteinden van de Tang onder stereomicroscoop, en breng over naar een andere 60 mm gerechten met verse HBSS. Gebruik ten minste 3-5 embryo's voor elke afzonderlijke neuron balcultuur.
- Snijd de cortices in kleine stukjes met microdissecting Spring schaar in een laminaire flow Cell Culture Hood.
- Breng fijngehakte cortices over in een buis van 15 mL en trypsinoseer de fijngehakte cortices in 4 mL 0,125% trypsine in HBSS voor 4,5 min in een waterbad van 37 °C.
Opmerking: deze trypsinisatie tijd is van cruciaal belang voor efficiënte neuron cultuur als de toenemende tijd (> 4,5 min) leidt tot veel meer dode neuronen. - Breng de celaggregaten over in een nieuwe buis van 15 mL met 10 mL HBSS met een steriele Pipet, en inincuberen bij 37 °C gedurende 5 min. Herhaal deze stap nog een keer.
- Overdracht van de celaggregaten naar een nieuwe 15 mL buis met 2 mL van Neurobasal media met GlutaMax, B27 supplement (NGB medium), 0,01% DNase I en 10% paarden serum.
- Triturate de trypsinized cortices door herhaaldelijk Pipetteer ze op en neer (3-5 keer) met behulp van vuur-gepolijst fijn glas Pasteur pipet.
Opmerking: diameter van de vuurgepolijste Fine Glass Pasteur-Pipet is erg belangrijk, zoals beschreven in de Banker Method paper14. Als de pipet te smal is om de cortices te passeren, bereidt u pipetten met 2-3 verschillende groottes voor en probeert u een grotere pipet. - Voor het bereiden van neuron ballen, neem de bovenstaande celsuspensie en pas de celdichtheid aan 1 x 106 cellen/ml met ngb medium.
- Cultuur de corticale neuronen als hangende druppels met 10.000 cellen/druppel (1 druppel is 10 μL) binnen de bovenste deksels van 10 cm cultuur gerechten.
- Voeg 7 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan het onderste deel van de kweek gerechten en bewaar vervolgens 3 dagen in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 onder bevoficeerde toestand, om de vorming van neuron ballen mogelijk te maken.
2. het plaatsen van neuron ballen op PLL-gecoate glazen dekstroken en cultuur onderhoud (DIV 3-11)
Opmerking: voor coating van glas dekstroken met poly-L-lysine (PLL), het wassen van de dekstroken met behulp van detergenten is belangrijk. Glazen dekstroken zijn soms niet zo schoon voor neuronale cultuur en uniforme coating met PLL. Niet-uniforme PLL-coating kan resulteren in ongelijke axonale uitbreiding van neuron ballen.
- Week de dekstroken in 1/20 verdund neutraal niet-fosfor middel in keramische rekken voor 1-3 overnachtingen.
- Was de afdek stroken 8 keer in ultrapuur water en steriliseer vervolgens in een oven bij 200 °C gedurende 12 uur.
Opmerking: alle stappen van hier moeten worden uitgevoerd in een laminaire luchtstroom cel cultuur kap. - Transfer gebakken covers Lips naar 100-mm gerechten. Na het afdichten van de schaal door Parafilm tussen een deksel en een bodem schotel, kunnen gebakken dekstroken worden bewaard voor langdurige opslag.
- Optionele Breng paraffine stippen aan op de afdek stroken. De stippen maken ruimte om te voorkomen dat neuron ballen loskoppelen van de dekstroken tijdens de immunokleuring door direct contact van neuron ballen om plastic gerechten. Smelt paraffine in een geschikte fles in een warmwaterbad van ongeveer 90 °C. Dompel een Pasteur-pipet in de paraffine en raak het snel aan om drie vlekken in de buurt van de rand van een dekslip te maken.
- Coat PLL (MW > 300.000) op de paraffine-kralen glazen dekstroken in 60-mm gerechten met behulp van PLL-oplossing (15 μg/mL in boor buffer), en bewaar ze gedurende ten minste 1 uur in een CO2 -incubator.
- Na 4 keer wassen met PBS, breng de met PLL gecoate dekstroken over naar een 4-put plaat met 350 μL NGB medium in elke put en Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride (AraC, 3 μM) naar de media om scheidings cellen te doden.
- Bewaar deze 4-put-plaat met de met PLL gecoate dekstroken in de CO2 -incubator ten minste 20 minuten om de temperatuur van het medium tot 37 °c te garanderen voordat u neuron ballen overdraagt.
- Bij DIV 3 wanneer "neuron ballen" zeer goed worden gevormd, zet ze over op PLL gecoate dekstroken in de 4-put plaat (5 neuron ballen/goed) bewaard in de CO2 incubator.
- Na 48 h, vervang het neuron Ball Culture medium met verse AraC-vrije NGB medium. Gebruik een hete plaat in een laminaire luchtstroom cel cultuur kap waarvan de temperatuur vlak voor deze procedure klaar is voor 37 °C.
Let op: het is noodzakelijk om het medium zo snel mogelijk op een hete plaat te veranderen om de tijd te verkorten dat de culturen zich aan de buitenkant van de CO2 -incubator bevinden. - Houd deze neuron-balcultuur in de CO2 -incubator voor maximaal div 11.
Opmerking: bij DIV 11-12 worden neuron ballen die neurites uitbreiden tot 1-2 mm gebruikt voor experimenten.
3. aanbrengen van LRRTM2 parels op de neuron bal cultuur met of zonder cellichamen (DIV 11-12)
Opmerking: voor de toepassing van LRRTM2 parels op neuron bal cultuur, is het raadzaam om cellichamen te verwijderen. Bereid daarom eerst LRRTM2 kralen voor, verwijder vervolgens de cellichamen en breng later LRRTM2 kralen aan op cultuur zo vroeg mogelijk. Biotinylated LRRTM2 wordt geleverd door de Nogi-groep (Yokohama City University) als geconditioneerd medium. Ze gebruiken een expressie vector met inbegrip van biotine acceptor sequentie en biotine Ligase van E. coli BirA 15 , 16 om Biotine te bevestigen aan LRRTM2, en de expressie vector is getransffecteerd naar Expi293F cellen die zijn opgenomen in het Expi293 expressie systeem. De vectorinformatie is beschikbaar in aanvullende figuur 1. Biotinylated LRRTM2-geconjugeerde streptavidine kralen verminderde achtergrond van de immunokleuring sterk vergeleken met LRRTM2-FC – geconjugeerd eiwit een kralen die worden gebruikt voor prototype LRRTM2 systeem8.
-
Bereiding van biotinyleerd LRRTM2 kralen
- Om overtollig Biotine te verwijderen uit geconditioneerd medium van Expi293F cellen dat biotinyleerd LRRTM2 uitdrukt, breng 1,7 ml van het geconditioneerde medium aan met 0,8 ml PBS (totaal 2,5 ml) tot PD-10 gel filtratie kolom. De PD-10-kolom is voorgeëscaleerd met 25 mL ultrapuur water en 25 mL PBS.
- Elute met 3,5 mL PBS en verzamel de doorstroom als een LRRTM2 voorraad.
Opmerking: deze LRRTM2 voorraad kan worden verstrekt aan aliquots en opgeslagen bij-80 °C voor lange termijn. Expressieniveaus van biotinyleerd LRRTM2 variëren soms van lot tot lot. Dus, het juiste volume van LRRTM2 voorraad te Conjugeren naar de kralen moet worden bepaald om te vormen presynapses genoeg op neuron ballen, wanneer nieuwe heleboel LRRTM2 voorraad wordt gebruikt op het eerste moment. - Neem 20 μL van de suspensie van met streptavidine gecoate magnetische deeltjes (diameter: 4-5 μm) naar een micro centrifugebuis. Immobiliseer de parels op een handgemaakt apparaat dat is bevestigd met neodymium permanente magneten en was driemaal met 100 μL PBS-MCBC in 1,5 mL micro centrifugebuizen.
Opmerking: PBS-MCBC bevat PBS, waaronder 5 mM MgCl2, 3 mm CACL2, 0,1% BSA en 0,1% compleet EDTA-vrij. - Nadat u volledig PBS-MCBC uit de kralen hebt verwijderd, voegt u vooraf bepaald volume van LRRTM2 voorraad (gewoonlijk 500-1000 μL, zie opmerking 3.1.2) toe aan de gewassen kralen. Inbroed het mengsel met behulp van Rotator bij 4 °C gedurende 1-2 h.
- Was de parels tweemaal met 100 μL PBS-MCBC en later met 100 μL NGB-medium.
- Respendeer de LRRTM2 kralen in 50 μL NGB medium voor toepassing op de neuron bal cultuur.
- Gebruik dezelfde procedures voor het bereiden van de controle kralen (negatieve controle) in een andere micro centrifugebuis behalve het toevoegen van biotinylated-LRRTM2 eiwitten.
-
Verwijderen van cellichamen van neuron ballen bij DIV 11-12 en toepassen van LRRTM2 kralen
- Label de putjes van een 4-putplaat als "Cellichaam (+)" en "Cellichaam (-)".
- Snijd het uiteinde van een gele punt in een hoek van 45 ° met een scheermesje dat eerder was gespoten met 70% ethanol onder stereomicroscoop (Figuur 1b).
- Plaats het gele uiteinde op het cellichaam van een neuron bal en verwijder de cellichamen door afzuigen (Figuur 1b).
- Voor het identificeren van elke gespecificeerde voorwaarde van het experiment, label de Wells opnieuw als "LRRTM2 Beads" en "controle kralen".
- Breng de LRRTM2 en Control kralen op neuron bal cultuur, en submerge naar de bodem van de platen voor 1 min met behulp van ferrietmagneten om presynapse vorming te starten. Deze procedure zorgt ervoor dat alle kralen op hetzelfde moment worden touchscreens. Vooral, het zou effectief zijn voor korte tijd incubatie (bijvoorbeeld 30 min en 1 h) met LRRTM2 kralen synchroon.
- Voor het uitvoeren van tijd-cursus experimenten, Label elke afzonderlijke goed als 0 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h en 18 h en apply LRRTM2 kralen op de aangegeven tijdsintervallen.
- Na de toevoeging van LRRTM2 kralen, incuberen de neuron bal cultuur met de kralen voor gespecificeerde tijd (0 min tot 18 h) om presynapses te vormen.
4. immunokleuring en microscopie
Opmerking: Bevestig de cellen voor 4 h via incubatie met LRRTM2 kralen in de experimentele omstandigheden met en zonder cellichamen, omdat de axonen geleidelijk aan sterven bij afwezigheid van cellichamen na 4 uur. In het geval van een tijdsverloop met LRRTM2 kralen, repareert u de cellen op de aangegeven gespecificeerde tijd.
-
Fixeren en kleuring neuronen in neuron bal cultuur na presynapse vorming met LRRTM2 kralen
- Verwijder NGB medium en bevestig de neuron ballen met 4% PFA in PBS (250 μL/well) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en was vervolgens met 500 μL PBS 4 keer per 5 min.
- Was de vaste cellen met TBS (tris-gebufferde zoutoplossing: 50 mM tris-HCl (pH 7,3) en 150 mM NaCl) gedurende meer dan 5 minuten.
- Permeabilize de cellen/axonen van neuron bal cultuur met TBS met 0,3% Triton X-100 gedurende 5 min.
- Houd de cellen 1 h voor blokkering met blokkerende buffer (0,1% Triton X-100 en 5% NGS (normaal geiten serum) in TBS).
- Inincuberen van de cellen met primaire antilichamen; anti-konijn-vGlut1 (vesiculaire glutamaat Transporter 1 (1:4000)) en anti-muis-Munc18-1 (1:300) verdund met antistof verdunningsmiddel voor overnachting bij 4 °C.
- Was de afdek stroken 4 keer met immunofluorescentie (if) buffer (0,1% Triton X-100 en 2% BSA in TBS) en incuberen gedurende 30 minuten met de (Alexa Dye)-geconjugeerde 2de antilichamen; anti-muis-IgG-Alexa 555 (1:500), anti-konijn-IgG-Alexa 488 (1:1000).
- Beits de kernen van de cellichamen van neuronen gedurende 5 minuten met 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, 1 μg/mL) in PBS.
- Was de afdekplaten drie keer met PBS en Monteer vervolgens op glazen dia's met behulp van een bevestigings medium met 167 mg/mL poly (vinyl) alcohol en 6 mg/mL N-Propylgallaat.
- Bewaar de glaasjes in de koelkast bij-20 °C tot microscopie. Fluorescerende signalen van de glaasjes zijn gedurende ten minste 1 jaar detecteerbaar wanneer de glaasjes bij-20 °C worden bewaard.
-
Foto's maken onder fluorescentiemicroscoop
- Leg differentiële interferentie contrast vast en als beelden onder een omgekeerde fluorescerende Microscoop met een gekoelde CCD camera met 60X olie Dompel lens. Voor beeldverwervings software gebruikt u een software-geïnstalleerd Microscoop systeem. Gebruik image J als beeldanalyse software.
- Meet de IF-intensiteit in presynapses in axon met behulp van de volgende formule; Als intensiteiten van de regio van belang zijn op kralen (ROI) – uit kralen regio intensiteit/axonale intensiteit langs 20 μm van kralen – achtergrond intensiteit. Deze ratio-intensiteit biedt eiwit accumulatie index (figuur 4a). Voltooi de metingen op originele 16-bits afbeeldingen met behulp van image J-software.
- Om het accumulatie niveau van bepaalde eiwitten in presynapse te kwantificeren, geïnduceerd met LRRTM2 kralen, selecteert u altijd het gebied weg van 2-veld van weergave of meer, afgezien van het cellichaam met Microscoop (60X).
Opmerking: de selectie van het gebied in neuron bal voorbeeld vorming is cruciaal omdat dichte axonen zich in de buurt van het cellichaam bevinden en de periferie van neuron bal één axon kan bieden. - Voor nauwkeurige meting, kies 5-verschillende axonale veld (vergelijkbare afstand van cellichamen)/coverslip.
- Identieke beeld omstandigheden op verschillende dagen en tussen experimenten behouden
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier tonen we representatieve resultaten van accumulatie van presynaptische eiwitten in LRRTM2-geïnduceerde presynapses van axonale vellen van neuron balcultuur. Als presynaptische eiwitten analyseerden we de excitatory synaptische blaasje Protein vGlut1 en de Active zone Protein Munc18-1. We onderzochten ook de tijdsduur van accumulatie van vGlut1 en Munc18-1 in presynapses, en verkregen resultaten die de bron van Munc18-1 in presynapses met behulp van axonen verwijderen van cellichamen en een eiwitsynthese remmer. Onlangs hebben we een rol van fragiele X Mental retardatie proteïne (FMRP) onderzocht op accumulatie van Munc18-1 in presynapses8. FMRP, een Causatief genproduct van het fragiele X-syndroom (FXS), is een bindend mRNA-eiwit om de vertaling17,18,19te onderdrukken. We onderzochten ook de betrokkenheid van FMRP in de Munc18-1 accumulatie met FXS model muizen die tekortschiet in Fmr1 gen encoding FMRP.
Toepassing van LRRTM2-kralen in neuron bal cultuur bij DIV11 geïnduceerde accumulatie van Munc18-1 in presynapses van axonen van neuron ballen (Figuur 2a). Zelfs in axonen die zijn verwijderd cellichamen, accumulatie van Munc18-1 werd waargenomen onder de kralen vergelijkbaar als axonen van neuron ballen met cellichamen (Figuur 2b). In typisch geval, meer dan 80% van de kralen na 4 h-incubatie met neuron ballen kan accumulatie van synaptische eiwitten in presynapses induceren, beoordeeld door kleuring Munc18-1 en vGlut-1. Omdat axonen zo druk zijn en elkaar overlappen in de buurt van cellichamen (Figuur 2AA, BA), werden meer perifere gebieden van axonale vellen gemeten waar axonen niet zo overlapt (Figuur 2AB, BB, bijv. perifeer gebied weg van 2-veld zicht of meer naast het cellichaam met Microscoop (60X)). Wanneer perifere regio van axonale blad werd geanalyseerd door een hoge vergroting objectief lens (60X), vGlut1 en Munc18-1 duidelijk geaccumuleerd in presynapses van axonen onder de kralen (Figuur 3). Soms, fluorescerende signalen van synaptische vesiculaire eiwitten zoals vGlut1 zijn moeilijk te worden gedetecteerd in axonale regio buiten de kralen, omdat deze synaptische vesiculaire eiwitten accumuleren zo veel onder de kralen. In het geval van Munc18-1 kunnen fluorescerende signalen zwak worden gedetecteerd in axonale regio buiten de kralen.
Te kwantificeren accumulatie niveau van synaptische eiwitten in presynapses geïnduceerd door LRRTM2-kralen, fluorescerende intensiteiten van axonen onder de kralen en buiten de kralen werden gemeten, en vervolgens berekend als "eiwit accumulatie index" (figuur 4a, en beschreven in de sectie Protocol in detail). Tijdsverloop experimenten toonden aan dat accumulatie van vGlut1 in presynapses significant steeg op 30 min (figuur 4b). Aan de andere kant, Munc18-1 accumulatie begon aanzienlijk te verhogen op 2 h, en bereiken een plateau op 4 h (figuur 4c). Deze gegevens geven aan dat het synaptische blaasje proteïne vGlut1 zich ophoteert in presynapses eerder dan het actieve zone eiwit Munc18-1. De Munc18-1 accumulatie in presynapses van Fmr1-ko neuronen toegenomen 1,5 keer meer dan die in wild type (WT) (figuur 4c), waarmee wordt aangegeven betrokkenheid van FMRP bij Munc18-1 accumulatie. Vervolgens werd een effect van de eiwitsynthese remmer anisomycine onderzocht op de accumulatie in de aanwezigheid of afwezigheid van cellichamen (figuur 4D) om de accumulatie van Munc18-1 te onderscheiden als gevolg van het transport van cellichamen of lokale vertaling in axonen. . Anisomycine onderdrukte de Munc18-1 accumulatie significant in axonen (figuur 4D), wat aangeeft dat de accumulatie eiwitsynthese-afhankelijk is. De accumulatie in presynapses van axonen zonder cellichamen was niet significant anders dan die met cellichamen (figuur 4D). Deze resultaten suggereren dat accumulatie van Munc18-1 in presynapses voornamelijk afkomstig is van axonen, maar geen transport van Munc18-1 van cellichamen. Als accumulatie van synaptische eiwitten wordt onderdrukt in presynapses van axonen door het verwijderen van cellichamen, wordt geoordeeld dat deze afname te wijten is aan het transport van cellichamen. Eigenlijk, toen we de accumulatie van totaal nieuw gesynthetiseerde eiwitten metabolisch gelabeld door fluorescerende kleurstof onderzocht, het verwijderen van cellichamen verminderde aanzienlijk de accumulatie van totaal nieuw gesynthetiseerde eiwitten, in vergelijking met presynapses van axonen met cellichamen8. Hoewel de Munc18-1 accumulatie in Fmr1-ko meer steeg in vergelijking met WT, onderdrukte anisomycine de accumulatie in soortgelijk niveau naar WT en het verwijderen van cellichamen had geen effect op de accumulatie (figuur 4D). Deze resultaten suggereren dat FMRP betrokken is bij de lokale vertaling van Munc18-1 in axonen.
Representatieve resultaten gepresenteerd hier tonen aan dat deze methode is geschikt om te onderzoeken hoe synaptische eiwitten accumuleren op georganiseerde wijze door middel van tijd cursus experimenten, en om de bron van synaptische eiwitten onderzoeken (transport van cellichamen of lokale vertaling in axonen) door het verwijderen van cellichamen.
Figuur 1. Schema van presynapse vorming en verwijdering van cellichamen van neuron bal.
A) test op presynapse vorming met behulp van biotinyleerd LRRTM2 geconjugeerde streptavidine kralen om de presynapses te induceren in axonen van neuron balcultuur, bereid uit e16 cortices. LRRTM2, een postsynaptisch eiwit, bindt neurexin (NRXN) en fungeert als een presynapse Organizer. Streptavidine kralen geconjugeerd aan biotinyleerd LRRTM2 extracellulaire gebieden (LRRTM2 kralen) werden toegepast op DIV11-12 tot neuron bal cultuur voor het opwekken van presynapses. Dit cijfer is gewijzigd van de vorige publicatie8. (B) het gele uiteinde van de tip werd gesneden en op het cellichaam van de neuron balcultuur geplaatst op een hoek van 45 °. De cellichamen werden verwijderd door afzuigen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Munc18-1 accumulatie in presynapses in aanwezigheid en afwezigheid van cellichamen van neuron bal.
A) na 4 uur incubatie met LRRTM2 parels, het actieve zone eiwit Munc18-1 geaccumuleerd op de geïnduceerde presynaptische locaties in axonen (bovenste paneel; experimentele schema, Midden; fase beeld, lager; Als afbeeldingen van Munc18-1 accumulatie). Beelden werden opgenomen als lage vergroting beelden met behulp van 10X lens en tussen vergroting (1.5 X) om de hele foto samengesteld uit een neuron bal, axonen, en kralen te zien. Onderbroken vierkantjes geven het gebied van neuron bal voor nauwkeurige beeldpositie van kralen. Schaalbalk, 20 μm (links; originele afbeelding), 10 μm (rechts; vergrote afbeelding). (B) Munc18-1 zeer goed geaccumuleerd, zelfs bij afwezigheid van cellichamen op de geïnduceerde presynaptische sites in axonen. Dit resultaat geeft aan dat axonen kunnen overleven en presynapses vormen, zelfs na het verwijderen van cellichamen gedurende ten minste 4 uur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Accumulatie van vGlut1 en Munc18-1 in presynapses van axonen met en zonder cellichamen.
De excitatory presynaptische marker vGlut1 (groen) en Munc18-1 (rood) geaccumuleerd in presynapses 4 h na toevoeging van LRRTM2 kralen. (Bovenste paneel; met cellichamen, lager; zonder cellichamen). Beelden werden gevangen met 60X olie Dompel lens voor een hoge vergroting om de fluorescentie intensiteit te meten. Gestippelde cirkel schetst de positie van kralen. Munc18-1 accumuleerde vrijwel vergelijkbare mate in aanwezigheid en afwezigheid van cellichamen in presynapses, maar vGlut1 accumulatie wordt verminderd zonder cellichamen8. Schaalbalk, 5 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Procedure van IF-intensiteit meting en impact van cellichamen verwijdering en eiwitsynthese remmer op Munc18-1 accumulatie in neuron ballen.
A) diagram toonde de kwantificeringsmethode van if-intensiteit op een geïnduceerd presynaptische plaats in axon van de neuron balcultuur. Schaalbalk, 5 μm. De details worden beschreven in de sectie Protocol. B) tijdsverloop van vGlut1 accumulatie in presynapses geïnduceerd met LRRTM2 parels. Getoonde gegevens zijn gemiddelde ± SEM voor n = 20. Twee richtings ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey. * *p < 0,01. C) tijdsduur van Munc18-1 accumulatie in WT en Fmr1-ko presynapses onder LRRTM2 kralen. Getoonde gegevens zijn gemiddelde ± SEM voor n = 20, tweeweg ANOVA met Tukey's meervoudige vergelijkingstest. n.s., niet significant; * *p < 0,01, significant verschillend tussen WT en ko. D) het staafdiagram toonde Munc18-1 accumulatie niveau in presynapses van WT en Fmr1-ko neuron ballen in de aanwezigheid of afwezigheid van 25 μM Anisomycine (aniso) met (CB +) of zonder (CB-) cellichamen. Getoonde gegevens zijn gemiddelde ± SEM voor n = 20. Twee richtings ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey. * *p < 0,01, n.s., niet significant. # geïndiceerd p < 0,01, significant verschillend met en zonder anisomycine. Deze cijfers zijn gewijzigd van de vorige publicatie8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1. Bicystronic expressie vector voor LRRTM2-ECR (extracellulaire regio) en BirA (Biotine Ligase van E. coli ).
Tussen LRRTM2-ECR en BirA coderings sequenties, er is een interne ribosomale entry site (IRES) sequentie die het mogelijk maakt om co-Express beide eiwitten uit enkele mRNA. hEF1-HTLV Promoter rijdt expressie de bicstronic mRNA, en beide eiwitten worden uitgescheiden door signaal peptide sequenties na de vertaling. LRRTM2-ECR-Codeer volgorde is gekoppeld aan verschillende peptide tag-sequenties (DYKDDDDK, TEV, Myc en zijn Tags) en de sequentie van biotin acceptor (BAS). Het BirA is bevestigd aan de DYKDDDDV tag. Secreted BirA biotinylates lysine van BAS sequentie van LRRRTM2-ECR te binden aan streptavidine kralen. Klik hier om de afbeelding te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We ontwikkelden een nieuwe methode om presynapse vorming te onderzoeken gestimuleerd met LRRTM2-kralen met behulp van neuron bal cultuur. Momenteel omvat de meeste presynapse formatie assay poly-D-Lysine (PDL)-gecoate kralen en gezien Culture/microfluïdische kamer20,21,22. Een van de voordelen van deze methode is LRRTM2-Beads. Terwijl LRRTM2 samenwerkt met neurexin te vormen excitatory presynapses specifiek11,12,13, PDL-kralen induceert zowel excitatory en remmende presynapses nonspecifiek20. Bij deze methode zijn andere presynapse organisatoren, waarvan de leden meer dan 10 eiwitten3zijn, van toepassing voor het opwekken van presynapses door het veranderen van het extracellulaire domein van biotinyleerd eiwit, afhankelijk van het experimentele doel.
Een ander voordeel is de neuron bal cultuur. In sommige gevallen werd conventionele gezien cultuur gebruikt om presynapse vorming20te analyseren. Echter, gezien cultuur is niet geschikt voor het analyseren van lage niveaus van synaptische eiwitten binnen presynapses, omdat overweldigende signalen in cellichamen en dendrieten interfereren signalen in presynapses. In plaats daarvan gebruiken sommige groepen dissociatie cultuur in de microfluïdische kamer, dat is een speciaal apparaat om axonen en cellichamen afzonderlijk te kweken in 2 comprtments21,22. Met behulp van de microfluïdische kamer, axonale blad wordt gevormd in axonale compartiment, en cellichamen kunnen worden verwijderd uit cel lichaam compartiment, vergelijkbaar met neuron bal cultuur. Echter, microfluïdische kamer is speciale apparatuur, en vereist een aantal vaardigheden te handhaven constante cultuur conditie. Neuron bal cultuur is niet nodig om speciale apparatuur te gebruiken, en is relatief gemakkelijk te worden geïntroduceerd als een nieuwe experimentele methode. Omdat de essentie van de neuron bal cultuur is gewoon om neuronale celaggregaten (neuron ballen) te plaatsen op glas-bodem gerecht/kamer, het kan gemakkelijk worden gecombineerd met andere methoden. Er wordt bijvoorbeeld van uitgegaan dat de neuron balcultuur met behulp van LRRTM2-Beads toepasbaar is voor een hoge inhouds screening om de fluorescentie van 10-20 kralen gebied op hetzelfde moment te meten.
Kritieke stap van dit protocol is coating met PLL. Als PLL-coating niet uniform is, zouden axonen van neuron ballen niet gelijkmatig in alle richtingen reiken. Dit verstoort de efficiënte analyse van presynapse vorming. We gebruiken glazen dekstroken en glazen bodem gerechten, maar glas is soms niet zo schoon voor neuronale cultuur en uniforme coating met PLL. In dit protocol, in het begin, glas dekstroken en glazen bodem gerechten worden geweekt in neutrale niet-fosfor reinigingsmiddel voor 1-3 's nachts, en vervolgens 8 keer gewassen met ultrapuur water. We gebruiken PLL waarvan het molecuulgewicht > 300.000 om de concentratie te verminderen (15 μg/mL) voor een lagere ongewenste achtergrond. Als een lager molecuulgewicht van PLL (bijv. 30000-70000) wordt gebruikt, is een hogere concentratie (100 μg/ml) nodig om axonen uit te breiden.
Beperking van deze methode is dat neuron bal cultuur kan niet handhaven > DIV15-16. Axonen van neuron ballen zijn gefragmenteerd na DIV15-16. Gefragmenteerde axonen produceren geen presynapse na LRRTM2 kralen toepassing. Deze methode is dus niet van toepassing op het analyseren van volwassen neuronen (> DIV21). Echter, in de meeste gevallen11,12,21,22, presynapse vorming assay maakt gebruik van jongere neuronen die worden gekweekt tot DIV14. Een andere beperking is dat axonen zonder cellichamen niet meer dan 4 uur kunnen overleven. We analyseerden accumulatie van 5 synaptische eiwitten in presynapses tot nu toe, de accumulatie van alle eiwitten die we controleerden bereikte bijna plateau binnen 4 uur (ongepubliceerde observatie). Het wordt beschouwd als dat synaptische eiwitten accumuleren genoeg op 4 h te analyseren waar synaptische eiwitten zijn afgeleid van (cel lichaam of Axon).
Combinatie van neuron Ball Culture met LRRTM2-Beads is relatief eenvoudig en flexibel om veel experimentele platforms aan te passen. We hebben deze methode al toegepast om presynaptische activiteit te meten met behulp van AM1-43 kleurstof (ongepubliceerde observatie). Deze methode wordt beschouwd als van toepassing voor screening met hoge doorvoer. Presynapse vorming assay is mogelijk om hoge inhoud screening toepassen door kleuring synaptische eiwitten in presynapses gevormd onder LRRTM2-kralen. Deze methode zou bijdragen aan het vinden van nieuwe verbindingen om neurologische aandoeningen te genezen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt deels ondersteund door JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (nr. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). We danken Dr. terukazu Nogi en MS. Makiko neyazaki (Yokohama City University) voor de vriendelijke verstrekking van biotinyleerd LRRTM2 eiwitten. We bedanken ook Honami Uechi en Rie Ishii voor technische assistentie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) | Nunc | 176740 | |
| Complete EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| cooled CCD camera | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Deoxyribonuclease 1 (DNase I) | Wako pure chemicals | 047-26771 | |
| Expi293 Expression System | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Horse serum | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| image acquisition software | Nikon | NIS-element AR | |
| Image analysis software | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Neurobasal media | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus |
Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| Prepacked Disposable PD-10 Columns | GE healthcare | 17085101 | |
| rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diameter: 4-5 µm |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
References
- Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
- Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).
- Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).
- Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).
- Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).
- Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. , (2018).
- Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).
- Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. , (2017).
- Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).
- Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).
- Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).
- Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).
- Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).
