Summary
Presynapse oluşumu doğru sırayla sinaptik proteinlerin birikimi de dahil olmak üzere dinamik bir süreçtir. Bu yöntemle, presynapse oluşumu "nöron topu" kültürünün aktik levhalar üzerinde bir presynapse Organizatör protein ile konjuti boncuklar tarafından tetiklenir, böylece Sinapik proteinlerin birikimi presynapse oluşumu sırasında analiz edilmesi kolaydır.
Abstract
Nöronal gelişim sırasında, sinaps oluşumu nöral devreler kurmak için önemli bir adımdır. Sinapslar oluşturmak için, sinaptik proteinler hücre organları ve/veya yerel çeviri olgunlaşmamış sinapsların taşıma ile uygun sırada sağlanmalıdır. Ancak, tam olarak nasıl sinaptik proteinlerin doğru sırayla sinaps birikir anlaşılmadı. Burada, presynapse oluşumunu teşvik etmek için boncuk ile nöron top kültürünün kombinasyonunu kullanarak presimtik oluşumu analiz etmek için yeni bir yöntem sunuyoruz. Nöron hücre agregaları olan nöron topları hücre organları ve dendrites uzak aksal levhalar sağlar, böylece presynaplar zayıf floresan sinyalleri hücre organları ezici sinyalleri kaçınarak tespit edilebilir. Boncuk presynapse oluşumu tetiklemek için, biz leucine zengin tekrarlama transmembran nöronal 2 (LRRTM2), bir uyarıcı presinaptik organizatör ile konjuti boncuklar kullanın. Bu yöntemi kullanarak, biz göstermiştir ki veziküler glutamat taşıyıcı 1 (vGlut1), bir sinaptik vezirik protein, Munc18-1 daha hızlı presynapses birikmiş, aktif bir bölge protein. Munc18-1 birikmiş çeviri-güvenilir presynapse bile hücre gövdeleri kaldırdıktan sonra. Bu bulgu, hücre gövdelerini taşıma değil, akons yerel çeviri tarafından Munc18-1 birikimini gösterir. Sonuç olarak, bu yöntem presynaplar ve sinaptik proteinlerin kaynağı sinaptik proteinlerin birikimi analiz etmek için uygundur. Nöron topu kültürü basittir ve özel cihaz kullanmak gerekli değildir, bu yöntem diğer deneysel platformlar için geçerli olabilir.
Introduction
SYNAPSE oluşumu, nöral devrelerin geliştirilmesi sırasında kritik adımlardan biridir1,2,3. Ön ve post-sinapslardan oluşan özel bölmeler olan sinapsların oluşumu, akons ve dendritlerin uygun şekilde tanınması, aktif bölge ve postsinaptik yoğunluğun oluşması ve uygun şekilde hizalanması ile ilgili karmaşık ve çok adımlı bir süreçtir. iyon kanalları ve nörotransmitter reseptörleri1,2. Her süreçte, sinaptik proteinlerin birçok tür hücre organları ve/veya bölmeler yerel çeviri tarafından sinaptik proteinleri taşıyarak uygun zamanlamaya göre bu özel bölmeleri birikir. Bu sinaptik proteinler fonksiyonel sinaps oluşturmak için organize bir şekilde düzenlenmiş olarak kabul edilir. Bazı sinaptik proteinlerin disfonksiyon nörolojik hastalıklarda sinaps oluşumu sonuçları4,5. Ancak, sinaptik proteinlerin uygun zamanlamaya göre nasıl biriktiği belirsiz kalır.
Sinaptik proteinlerin organize bir şekilde nasıl birikdiğini araştırmak için sinaptik proteinleri kronolojik sırada birikmesini incelemek gerekir. Bazı raporlar,6,7' deki nöronlar kültüründe sinaps oluşumunu gözlemlemek için canlı görüntüleme gösterdi. Ancak, sadece mikroskopide sinaps oluşumu başlatmak nöronlar bulmak için zaman alıcı. Etkili sinaptik proteinlerin birikimini gözlemlemek için, sinaps oluşumu araştırmacılar oluşumu ikna etmek istediğinizde zaman başlamalıdır. İkinci zorluk hücre organları veya sinapslar yerel çeviri taşıma nedeniyle sinaptik proteinlerin birikimini ayırt etmektir. Bu amaçla, çeviri seviyesi hücre gövdelerini sinaptik proteinlerin taşınması izin vermez koşul altında ölçülmesi gereklidir.
Biz, presynapse oluşumu8teşvik boncuk ile nöron top kültürünün kombinasyonu kullanarak roman presynapse oluşumu tahlil geliştirdi. Nöron top kültürü, hücre gövdelerini çevreleyen aksonal levhalar oluşumu nedeniyle aksonal phenoype incelemek için geliştirilmiştir9,10. Biz leucine zengin tekrarlı transmembran nöronal 2 (LRRTM2) ile konjugated manyetik boncuk kullanılan uyarıcı presynapses (Şekil 1a)11,12,13ikna etmek için bir presinaptik Organizatör. LRRTM2 boncukları kullanarak, boncuk uygulandığında zaman presynapse oluşumu başlar. Bu presynapse oluşumu aynı zamanda bir nöron topu binlerce akons başlar anlamına gelir, böylece etkili sinaptik proteinler birikiminin kesin zaman ders incelemek için izin verir. Buna ek olarak, nöron top kültürü, hücre gövdelerini kaldırarak Soma 'dan taşıma sinaptik proteinlerini engellemek için kolaydır (Şekil 1B)8. Biz zaten hücre organları olmadan akons hayatta ve en az 4 saat hücre organları kaldırıldıktan sonra sağlıklı olduğunu doğruladı. Böylece, bu protokol sinaptik proteinlerin (hücre gövdesi veya Akon) türetildiği ve nasıl sinaptik proteinler organize bir şekilde birikir araştırmak için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu yazıda açıklanan deneyler Yokohama City Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nde belirtilen yönergelere göre yapılmıştır.
1. asılı bırakma kültürü olarak nöron topları hazırlanması (gün içinde vitro (dıv) 0-3)
Not: nöron Ball kültürünün hazırlanması için burada anlatılan prosedürler, daha önce Sasaki grubu tarafından bazı değişikliklere İstinaden bildirilen yönteme dayanmaktadır9,10. Biz de çeşitli prosedürleri benimsenen banker yönteminden ayrılmış kültür14.
-
Diseksiyon başlamadan önce followings teyit
- Gerekli tüm çözümleri hazırlayın ve önceden autoclave/filtrasyon ile sterilize edin.
- Bu kortikal nöron kültürünün her adımında kullanılmak üzere tüm aletler ve malzemeler hazır tutun.
- % 70 etanol ile laminar hava akış kabinini, diseksiyon tablosunu, stereomikoskop, makas ve forseps Sahne plakasını sprey ve silin.
- CO2 uygulama üzerine fare euthanize ve E16 embriyo elde etmek için karın incelemek.
- Forseps ince ipuçları yardımıyla dikkatle embriyolar gelen beyin çıkarın ve 60 mm hücre kültürü yemekleri 4 ml HEPES tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) içeren içine aktarın.
Not: diseksiyon orta HBSS içerir 10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,09 mM na2HPO4, 1,1 mm KH2Po4, 5,6 mm D-glikoz, ve 5,64 μM fenol kırmızı. - Kafa derisi çıkarın, koku ampul kesmek, stereomicroscope altında forseps ince ipuçları kullanarak her serebral Yarımküre ayrı kortiklar, ve taze HBSS içeren başka bir 60 mm yemeklere transfer. Her ayrı nöron top kültürü için en az 3-5 embriyo kullanın.
- Bir laminar akış hücresi kültür kaputu mikrodissecting yay makas ile küçük parçalar halinde korsları kesip.
- Kıyılmış korsinleri 15 mL 'Lik bir tüpe aktarın ve 37 °C ' de bir su banyosuna 4,5 dk için HBSS 'de% 0,125 tripsin 4 mL 'de kıyılmış kortibi tripsinleştirin.
Not: Bu tripsinizasyon süresi artan zaman (> 4,5 dk) çok daha ölü nöronlara yol açar olarak verimli nöron kültürü için önemlidir. - Hücre toplamalarını steril bir transfer pipeti ile 10 mL HBSS içeren yeni 15 mL 'Lik bir tüpe aktarın ve 37 °C ' de 5 dakika boyunca inküye yapın. bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
- Yeni bir 15 mL tüp içeren 2 mL Nörobasal medya GlutaMax, B27 takviyesi (NGB orta), 0,01% DNase ı ve% 10 at serumu içeren hücre toplamları aktarın.
- Tripsinize kortibi triturate, yangın parlatılmış ince cam Pasteur pipet kullanarak onları tekrar yukarı ve aşağı (3-5 kez) pipetleme ile.
Not: Yangın parlatılmış ince camlı Pasteur pipet çapı, banker Yöntem kağıt14' te açıklandığı gibi çok önemlidir. Pipet korterler geçmek için çok dar ise, 2-3 farklı boyutlarda sahip pipetler hazırlamak ve büyük pipet deneyin. - Nöron topları hazırlamak için, yukarıdaki hücre süspansiyon almak ve 1 x 106 hücreler/ml NGB orta kullanarak hücre yoğunluğu ayarlayın.
- Kültür, 10 cm kültür yemeklerinin üst kapakları içinde 10.000 hücre/damla (1 damla 10 μL) içeren asılı damla olarak kortikal nöronlar.
- Kültür yemeklerinin alt kısmına 7 mL fosfat tampon tuz (PBS) ekleyin, sonra 37 °C ' de 3 gün boyunca bir kuluçte tutun,% 5 CO2 ile nöron topu oluşumuna izin vermek için nemlendirilmiş durumda.
2. PLL kaplı cam kapaklara ve kültür bakımına nöron topları yerleştirme (DıV 3-11)
Not: poli-L-lizin (PLL) ile cam kapakların kaplamadan önce, deterjan kullanarak coverfları yıkamak önemlidir. Cam kapakların bazen PLL ile nöronal kültür ve üniforma kaplama için o kadar temiz değildir. Non-Uniform PLL kaplama nöron topları düzensiz aksal uzatma neden olabilir.
- 1-3 geceleme için seramik raflarda 1/20 seyreltilmiş nötr olmayan fosforsuz deterjan içinde coverfları ıslatın.
- Kapak fişelerini ultra saf suda 8 kez yıkayın ve 200 °c ' de fırın içinde 12 saat sterilize edin.
Not: buradan gelen tüm adımlar bir laminar hava akımı hücre kültür kaputu yapılmalıdır. - 100 mm 'lik yemeklerle pişmiş kapak makbuzları aktarın. Bir kapak ve alt çanak arasında Parafilm tarafından çanak mühürleme sonra, pişmiş Cover, uzun süreli depolama için muhafaza edilebilir.
- Isteğe bağlı Kapakları parafin noktalar uygulayın. Noktalar, nöron toplarının plastik yemeklerde doğrudan temas ederek immünostatik sırasında coverstardan ayırma nöron topları önlemek için yer yapmak. Yaklaşık 90 °C ' de sıcak su banyosunda uygun bir şişede parafin eritin. Bir Pasteur pipet parafin içine daldırma, sonra hızla bir coverslip kenarına yakın üç nokta yapmak için dokunun.
- Coat PLL (MW > 300.000), 60-mm yemeklerinde parafin-boncuklu cam coverları üzerine PLL çözeltisi (15 μg/ml Borat tampon) kullanılarak
- PBS ile 4 kez yıkandıktan sonra, PLL-kaplı kapakları, bölme hücrelerini öldürmek için medyada her bir iyi ve sitozin β-D-arabinofuranoside hidroklorür (AraC, 3 μM) içinde 350 μL NGB orta içeren 4-kuyu plakasına aktarın.
- Nöron toplarını aktarmadan önce Orta erişim 37 °C ' nin sıcaklığının sağlanması için en az 20 dakika boyunca CO2 inkükotandaki PLL kaplı kapaklarını içeren bu 4-kuyu plakasını tutun.
- Içinde DıV 3 zaman "nöron topları" çok iyi oluşturulur, 4-kuyu plaka içinde PLL kaplı Cover, onları aktarmak (5 nöron topları/iyi) CO2 kuluçside tutulan.
- Sonra 48 h, taze AraC-ücretsiz NGB orta ile nöron topu kültür ortamı değiştirin. Bu prosedürün hemen önce sıcaklığı 37 °C ' de hazır tutulan bir laminar hava akımı hücre kültürü kaputunda sıcak plaka kullanın.
Not: kültürlerin CO2 kuluçta dışında olduğu zamanı azaltmak için sıcak bir plaka üzerinde mümkün olduğunca hızlı bir şekilde değişen orta gerçekleştirmek gereklidir. - Bu nöron top kültürünü DıV 11 ' e kadar CO2 inkükode tutun.
Not: at DIV 11-12, nöron topları 1-2 mm kadar nöronlar uzanan deneyler için kullanılır.
3. hücre organları (DıV 11-12) ile veya olmadan nöron top kültürü üzerinde LRRTM2 boncuk uygulanması
Not: nöron top kültürü LRRTM2 boncuk uygulamadan önce, hücre gövdeleri kaldırmak için tavsiye edilir. Bu nedenle, ilk başta LRRTM2 boncuk hazırlamak, sonra hücre gövdeleri kaldırmak ve daha sonra mümkün olduğunca erken kültür LRRTM2 boncuk uygulamak. Biotinylated LRRTM2, Nogi 'nin grubu (Yokohama City University) tarafından şartlanmış orta olarak sağlanmaktadır. Biotin alıcı dizisi ve E 'den biotin ligaz dahil olmak üzere bir ifade vektörü kullanıyorlar . coli BirA 15 , 16 LRRTM2 için biotin eklemek için ve ifade vektörü Expi293 ifade sisteminde bulunan Expi293F hücrelere transfekte. Vektör bilgileri ek Şekil 1' de mevcuttur. Biotinylated LRRTM2-konjuti streptavidin boncuklar immünostasyon büyük ölçüde LRRTM2-FC-konjuti protein prototip LRRTM2 sistemi8Için kullanılan bir boncuk karşılaştırıldığında azalan arka plan.
-
Biyotinlenmiş LRRTM2 boncuk hazırlanması
- Biyotinlenmiş LRRTM2 ifade Expi293F hücrelerin şartından aşırı biotin kaldırmak için, 0,8 ml PBS (Toplam 2,5 ml) PD-10 jel filtrasyon sütunu ile karışık klimalı orta 1,7 ml uygulayın. PD-10 sütunu 25 ml Ultra saf su ve 25 ml PBS ile önceden dengelenmiş.
- 3,5 mL PBS ile elute ve LRRTM2 stok olarak akış toplamak.
Not: Bu LRRTM2 stokları plakaya 'a dağıtılabilir ve uzun süreli olarak-80 °c ' de saklanır. Biyotinlenmiş LRRTM2 ifade seviyeleri bazen lot çok farklılık gösterir. Böylece, boncuklar için Konjugat LRRTM2 stok uygun hacim ilk kez LRRTM2 stok yeni bir sürü kullanıldığında, nöron topları üzerinde yeterli presynapses oluşturmak için belirlenmelidir. - Streptavidin kaplı manyetik partiküllerin (çap: 4-5 μm) mikrosantrifüjler tüpüne askıya alınmasından 20 μL alın. Neodimyum kalıcı mıknatıslar ile bağlı el yapımı bir cihaz için boncuk immobilize ve 1,5 ml mikrosantrifüjü tüpler PBS-mcbc 100 μL ile üç kez yıkayın.
Not: PBS-MCBC 5 mM MgCl2, 3 mm CAcl2, 0,1% bsa ve% 0,1 Complete EDTA-ücretsiz dahil PBS içerir. - Boncuklar tamamen PBS-MCBC kaldırdıktan sonra, LRRTM2 stok önceden belirlenmiş hacmi ekleyin (genellikle 500-1000 μL, Not 3.1.2 bakın) yıkanmış boncuklar için. 1-2 h için 4 °C ' de Rotator kullanarak karışımı kulkarın.
- 100 μL PBS-MCBC ve daha sonra 100 μL NGB orta ile boncukları iki kez yıkayın.
- Nöron Ball kültürünü uygulama için 50 μL NGB orta LRRTM2 boncuk resuspend.
- Biotinylated-LRRTM2 proteinleri ekleyerek dışında başka bir mikrosantrifüjte tüp kontrol boncukları (negatif kontrol) hazırlamak için aynı yordamları kullanın.
-
DıV 11-12 nöron topları hücre gövdeleri kaldırma ve LRRTM2 boncuk uygulama
- 4-kuyu plakasının kuyularını "hücre gövdesi (+)" ve "hücre gövdesi (-)" olarak etiketleyin.
- Daha önce stereomikoskop altında% 70 etanol ile püskürtülür (Şekil 1B) bir jilet ile 45 ° açı sarı bir ucu sonunu kesti.
- Sarı uç ucunu bir nöron topunun hücre gövdesi alanına koyun ve hücre gövdelerini emiş ile çıkarın (Şekil 1B).
- Denemenin belirtilen her koşulu tanımlamak için, kuyuları tekrar "LRRTM2 boncuklar" ve "kontrol boncukları" olarak etiketleyin.
- LRRTM2 ve kontrol boncukları nöron top kültürü üzerinde uygulayın ve plakların alt için 1 dakika Ferrit mıknatıslar kullanarak presynapse oluşumu başlatmak için alt aşağı aşağı aşağı. Bu prosedür aynı anda tüm boncuklar touchdown sağlar. Özellikle, kısa süre inkübasyon için etkili olacaktır (örneğin, 30 dk ve 1 saat) LRRTM2 boncuk ile eşzamanlı.
- Zaman kursu denemeleri yapmak için, her biri 0 dk, 30 dakika, 1 saat, 2 saat, 4 saat ve 18 saat olarak ayrı olarak etiketleyin ve belirtilen zaman aralıklarında LRRTM2 boncuk uygulayın.
- LRRTM2 boncuk eklendikten sonra, belirtilen süre için boncuklar ile nöron topu kültürü inkük (0 dk ila 18 h) presynaps oluşturmak için.
4. immünostam ve mikroskobik
Not: 4 saat sonra hücre organları yokluğunda ölmek için Aksiyon kademeli eğilimindedir gibi, hücre organları ile ve olmadan deneysel koşullarda LRRTM2 boncuklar ile inkübasyon ile dört h için hücreleri düzeltin. LRRTM2 boncuk ile zaman kursu durumunda, belirtilen süre içinde hücreleri düzeltin.
-
LRRTM2 boncuk ile presynapse oluşumu sonra nöron top kültüründe sabitleme ve boyama nöronlar
- NGB orta kaldırın ve% 4 PBS ile nöron topları düzeltmek (250 μL/Well) Oda sıcaklığında 20 dakika, ve sonra ile yıkayın 500 μL PBS 4-kez her 5 dakika.
- Sabit hücreleri TBS (Tris-tamponlu tuz: 50 mM Tris-HCl (pH 7,3) ve 150 mM NaCl) ile 5 dakikadan fazla yıkayın.
- 5 dakika boyunca% 0,3 Triton X-100 içeren TBS ile nöron top kültürünün hücrelerini/akkülerini geçirgen.
- Engelleyici tampon ile engelleme için hücreleri 1 saat tutun (0,1% Triton X-100 ve 5% NGS (normal keçi serumu) TBS).
- Hücrelerin primer antikorlar ile kulbirer; Anti-Rabbit-vGlut1 (veziküler glutamat taşıyıcı 1 (1:4000)) ve anti-Mouse-Munc18-1 (1:300) bir gecede 4 °C ' de antikor seyreltilmiş.
- 4 kez immünofluorescence (IF) tampon (0,1% Triton X-100 ve 2% BSA TBS) ile coverfları yıkayın ve fluorophore (Alexa boya) ile 30 dakika için inkübe-konjuyum 2 antikorlar; Anti-Mouse-IgG-Alexa 555 (1:500), Anti-tavşan-IgG-Alexa 488 (1:1000).
- PBS 'de 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1 μg/mL) ile 5 dakika boyunca nöronların hücre gövdelerini çekirdekleri leke.
- PBS ile coverfaları üç kez yıkayın ve ardından 167 mg/mL poli (vinil) alkol ve 6 mg/mL N-pro'lik gallate içeren montaj medyasını kullanarak cam slaytlara monte edin.
- Cam slaytları mikroskopiye kadar-20 °C ' de bir buzdolabında saklayın. Cam slaytların floresan sinyalleri, slaytlar-20 °C ' de saklanırken en az 1 yıl boyunca algılanabilir.
-
Floresan mikroskobun altında görüntü alma
- 60X yağ daldırma merceği kullanılarak soğutmalı bir CCD kamera ile ters floresan mikroskop altında diferansiyel parazit kontrastı ve If görüntülerini yakalayın. Görüntü edinme yazılımı için, bir yazılım yüklü mikroskop sistemi kullanın. Image J görüntü analiz yazılımı olarak kullanın.
- Aşağıdaki formülü kullanarak Axon içinde presynapses If yoğunluğu ölçmek; Eğer boncuklar üzerinde Ilgi bölgesi yoğunlukları (YG) – kapalı boncuk bölge yoğunluğu/axonal yoğunluğu boyunca 20 μm boncuklar – arka plan yoğunluğu. Bu oran yoğunluğu protein birikimi indeksi sağlar (Şekil 4A). Image J yazılımını kullanarak orijinal 16 bit görüntülerde ölçümleri gerçekleştirin.
- LRRTM2 boncuk ile indüklenen presynapse belirli protein birikimi seviyesini ölçmek için, her zaman uzak 2-görünüm alanı veya daha fazla mikroskop (60X) ile hücre gövdesi dışında alanı seçin.
Not: yoğun akons hücre gövdesi yakın ve nöron topu çevre tek Akon sağlayabilir gibi görüntüleme için nöron topu alan seçimi çok önemlidir. - Doğru ölçüm için 5-farklı aksonal alan (hücre gövdelerini benzer mesafe)/coverslipseçin.
- Aynı görüntüleme koşullarını farklı bir günde ve deneyler arasında tutun
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, LRRTM2 indüklenmiş nöron top kültüründe aksonal yaprak presynaptlarda presynaptik proteinlerin birikiminin temsili sonuçlarını gösteriyoruz. Presynaptik proteinler olarak, uyarıcı sinaptik vezikül proteini vGlut1 ve aktif bölge proteini Munc18-1 ' i analiz ettik. Biz de vGlut1 ve Munc18-1 birikiminin zaman ders presynapses, ve sonuç Munc18-1 hücre organları ve bir protein sentezi inhibitörü kaldırma akons kullanarak presynapses gösteren elde edildi. Son zamanlarda, biz kırılgan X zihinsel retardasyon protein (FMRP) Munc18-1 birikiminde bir rol araştırdık8presynapses. Fmrp, kırılgan X Sendromu (FXS) bir nedensel gen ürün, tercüme bastırmak için bir mRNA bağlayıcı proteindir17,18,19. Ayrıca Munc18-1 birikiminde Fmr1 gen kodlama fmrp EKSIKTIR FXS model fareler kullanarak fmrp katılımı inceledi.
Nöron topları aksların presynaplar içinde Munc18-1 DIV11 indüklenmiş birikiminde nöron top kültürü içine LRRTM2-boncuk uygulaması (Şekil 2a). Hücre gövdeleri çıkarılan akons bile, Munc18-1 birikimi hücre gövdeleri ile nöron topları akons gibi benzer boncuklar altında gözlenen (Şekil 2B). Tipik durumda, üzerinde 80% boncuk 4 h-inkübasyon nöron topları ile presynapses içinde sinaptik proteinlerin birikimi neden olabilir, boyama tarafından değerlendirilmesine Munc18-1 ve vGlut-1. Aksonlar çok kalabalık ve hücre gövdeleri yakın çakışan çünkü (Şekil 2AA, ba), aksonların bu kadar örtüşmez nerede aksonal levhalar daha periferik bölge ölçüldü (Şekil 2AB, BB, örn., 2-alan uzak periferik alan görüntü veya daha fazla mikroskop (60X)) ile hücre gövdesi dışında. Aks tabakalarının periferik bölgesi, yüksek büyütme objektif objektif (60X), vGlut1 ve Munc18-1 ' in boncuklar altında aksların basiliminde açıkça biriktiği zaman incelenmiştir (Şekil 3). Bazen, vGlut1 gibi sinaptik veziküler proteinlerin floresan sinyalleri boncuklar dışında aksonal bölgede tespit edilmesi zordur, çünkü bu sinaptik veziküler proteinler boncuklar altında çok birikir. Munc18-1 durumunda, boncuk dışında akal bölgede zayıf bir şekilde floresan sinyalleri tespit edilebilir.
LRRTM2-boncuk tarafından indüklenen presynaplarda sinaptik proteinlerin birikme seviyesini ölçmek için, boncuklar altında ve boncuk dışında akons floresan yoğunlukları ölçüldü ve daha sonra "protein birikimi Endeksi" olarak hesaplanır (Şekil 4A, ve iletişim kuralı bölümünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır). Zaman kursu deneyleri, presynapların vGlut1 birikiminin 30 dakika içinde önemli ölçüde arttığını göstermiştir (Şekil 4b). Öte yandan, Munc18-1 birikimi 2 saat içinde önemli ölçüde artmaya başladı ve 4 saat (Şekil 4c) bir plato ulaşır. Bu veriler, sinaptik vezikül protein vGlut1 aktif bölge protein Munc18-1 daha önce presynapses birikir gösterir. Fmr1-Ko nöronların presynaplarının Munc18-1 birikimi, Munc18-1 birikiminde FMRP 'nin katılımını gösteren vahşi Tıp (WT) (Figure 4c) ' den 1,5 kat daha fazla arttı. Daha sonra, hücre gövdelerini veya akonların yerel tercümesinden kaynaklanan Munc18-1 birikimini ayırt etmek için, hücre gövdelerin varlığı veya yokluğunda birikiminde protein sentezi inhibitörü anomisin etkisi incelenmiştir (Şekil 4d) . Anisomisin, Munc18-1 birikimini akons içinde önemli ölçüde bastırdı (Şekil 4d), birikiminin protein sentezi-bağımlıdır olduğunu gösterir. Hücre gövdeleri olmadan aksların presynaplar birikimi hücre gövdeleri ile önemli ölçüde farklı değildi (Şekil 4d). Bu sonuçlar, presynaplarda Munc18-1 birikiminin çoğunlukla akonlardan elde edildiğini, ancak Munc18-1 ' i hücre gövdelerini taşımaklarını ifade etmediğini göstermektedir. Sinaptik proteinlerin birikimi hücre gövdelerini kaldırarak aksların presynapında bastırılırsa, bu azalma hücre gövdelerini taşıma nedeniyle olduğu düşünülmektedir. Aslında, biz metabolize floresan boya ile etiketlenmiş toplam yeni sentezlenmiş proteinlerin birikimi incelendiğinde, hücre organları kaldırılması önemli ölçüde toplam yeni sentezlenmiş proteinlerin birikimi azalır, ile akons presynapses karşılaştırıldığında hücre gövdeleri8. Fmr1-Ko ' d a Munc18-1 birikimi WT 'ye kıyasla daha fazla artışa karşın, anisomisin WT 'e benzer seviyede birikimini bastırdı ve hücre gövdelerini çıkarma birikimi üzerinde hiçbir etkisi yoktu (Şekil 4d). Bu sonuçlar, FMRP 'nin akons içinde Munc18-1 yerel çevirisine dahil olduğunu göstermektedir.
Burada sunulan temsili sonuçlar, bu yöntemin sinaptik proteinlerin zaman kursu deneyleri ile organize bir şekilde nasıl birikeceğini araştırmak ve sinaptik proteinler kaynağını incelemek için uygun olduğunu göstermektedir (hücre organları veya yerel akons çeviri) hücre gövdeleri kaldırarak.
Şekil 1 ' de. Presynapse oluşumu ve nöron topu hücre organları kaldırılması şeması.
(A) E16 kortiplardan hazırlanan nöron top kültürünün aksları üzerinde presynaplar ikna etmek için biyotinlenmiş LRRTM2 konjuyen strektavidin boncuk kullanarak presynapse oluşumu assay. LRRTM2, bir postsinaptik protein, neurexin (NRXN) bağlar ve bir presynapse organizatör olarak hareket. Streptavidin boncuk biyotinlenmiş LRRTM2 ekstrasellüler bölgeler (LRRTM2 boncuk) için DIV11-12 ' de uygulanan olan nöron top kültürü presynapses ikna etmek için. Bu rakam önceki yayından değiştirildi8. (B) sarı uç ucu kesilmiş ve 45 ° açı nöron top kültürünün hücre gövdesi alanına yerleştirilir. Hücre gövdeleri emiş ile çıkarıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2. Munc18-1 nöron topu hücre organları varlığı ve yokluğunda presynapses birikimi.
(A) LRRTM2 boncuk ile 4 h kuluçk sonra, aktif bölge protein Munc18-1 akons indüklenen presinaptik sitelerde birikmiş (üst panel; deneysel şeması, orta; faz görüntü, düşük; Eğer Munc18-1 birikiminin görüntüleri). Görüntüler, bir nöron topu, akons ve boncuk oluşan tüm resmi görmek için 10X lens ve ara büyütme (1,5 X) kullanarak düşük büyütme görüntüleri olarak yakalandı. Kesikli kareler, boncuk doğru görüntüleme pozisyonu için nöron topu alanını gösterir. Ölçek çubuğu, 20 μm (sol; orijinal görüntü), 10 μm (sağ; büyütülmüş görüntü). (B) Munc18-1 akons indüklenen presinaptik sitelerde hücre organları yokluğunda bile çok iyi birikmiş. Bu sonuç, aksların en az 4 saat boyunca hücre gövdelerini kaldırdıktan sonra bile presynapları yaşayacağını ve oluşturmasını gösterir. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 3 ' ü. VGlut1 ve Munc18-1 akons presynapses ile ve hücre gövdeleri olmadan birikmesi.
Uyarıcı presinaptik Marker vGlut1 (yeşil) ve Munc18-1 (kırmızı) presynapses birikmiş 4 LRRTM2 boncuk eklendikten sonra h. (Üst panel; hücre gövdeleri, daha düşük; hücre gövdeleri olmadan). Görüntüler, floresan yoğunluğunu ölçmek için yüksek büyütme için 60X yağ daldırma objektifi kullanılarak yakalandı. Kesikli daire boncuk pozisyonunu özetlenmiştir. Munc18-1, presynaplar hücre organları varlığı ve yokluğunda neredeyse benzer ölçüde birikmiş ama vGlut1 birikimi hücre organları olmadan azalır8. Ölçek çubuğu, 5 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 4. If yoğunluğu ölçümü ve hücre organları kaldırma ve protein sentezi inhibitörü etkisi Munc18-1 nöron topları birikiminde prosedürü.
(A) diyagram nöron top kültürünün Axon bir indüklenmiş-presynaptic sitede If yoğunluğu ölçüme yöntemi gösterdi. Ölçek çubuğu, 5 μm. Ayrıntılar, protokol bölümünde açıklanmıştır. (B) LRRTM2 boncuklar ile indüklenen presynaplar vGlut1 birikimi zaman ders. Gösterilen veriler n = 20 için Ortalama ± SEM 'dir. Tukey 'nin çoklu karşılaştırma testi ile iki yönlü ANOVA. * *p < 0,01. (C) LRRTM2 boncuk altında WT ve Fmr1-Ko Presynapses Munc18-1 birikimi zaman ders. Gösterilen veriler n = 20 için Ortalama ± SEM, Tukey 'nin birden fazla karşılaştırma testine sahip Iki yönlü ANOVA 'dir. yok, önemli değil; * *p < 0,01, WT ve Ko arasında önemli ölçüde farklıdır. (D) Bar grafiğinde, WT ve Fmr1-Ko nöron topları ile 25 μM anisomisin (aniso) (CB +) veya olmadan (CB-) hücre gövdelerin varlığında veya yokluğunda Munc18-1 birikme seviyesi saptandı. Gösterilen veriler n = 20 için Ortalama ± SEM 'dir. Tukey 'nin çoklu karşılaştırma testi ile iki yönlü ANOVA. * *p < 0,01, s, önemli değil. # Belirtilen p < 0,01, önemli ölçüde farklı ve anisomisin olmadan. Bu rakamlar önceki yayından değiştirildi8. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 1. LRRTM2-ECR (Ekstrsellüler bölge) ve BirA ( E. coli 'den biotin ligaz) için bicystronik ifade vektörü.
LRRTM2-ECR ve BirA kodlama dizileri arasında, tek mRNA 'nın her iki proteinini de birlikte ifade etmenize olanak sağlayan bir Internal ribozomal giriş sitesi (RIS) dizisi vardır. hEF1-HTLV Organizatör sürücüler bicstronic mRNA expresson, ve her iki protein çeviri sonra sinyal peptid dizileri tarafından salgılanan. LRRTM2-ECR kodlama sırası çeşitli peptid etiket dizileri (DYKDDDDK, TEV, MYC ve onun etiketleri) ve biotin Acceptor dizisi (BAS) eklenir. BirA, DYKDDDDV etiketine bağlı. Streptavidine boncuklar bağlamak için LRRRTM2-ECR bas dizisi salgılanan bira biotinylates lizin. Şekil indirmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LRRTM2-boncuk ile nöron topu kültürünü kullanarak uyarılan presynapse oluşumunu incelemek için yeni bir yöntem geliştirdik. Şu anda, presynapse oluşumu tahlil çoğu Poly-D-Lysine içerir (PDL)-kaplamalı boncuk ve Disosiye kültür/microfluidic odası20,21,22. Bu yöntemin avantajlarından biri LRRTM2-Beads. LRRTM2, özellikle11,12,13, PDL-boncuk uyarıcı presynapses oluşturmak için neurexin ile etkileşime girer ve nonözel20uyarıcı ve inhibitör presynapses indükler. Bu yöntemle, üyeleri üzerinde 10 protein3olan diğer presynapse Organizatörler, deneysel amaca bağlı olarak biyotinlenmiş protein ekstrellüler etki değiştirerek presynaplar ikna etmek için geçerlidir.
Başka bir avantaj nöron top kültürü. Bazı durumlarda, presynapse oluşumu20analiz etmek için konvansiyonel Disosiye kültür kullanılmıştır. Ancak, ayrılmış kültür presynapses içinde sinaptik proteinlerin düşük düzeyde analiz etmek için uygun değildir, çünkü hücre organları ve dendritler ezici sinyaller presynaplar sinyalleri müdahale. Bunun yerine bazı gruplar, 2 renk21,22' de ayrı olarak kültür aksonlar ve hücre gövdeleri için özel bir aparat olan mikroakışkan odasında ayrılmış kültürü kullanır. Mikrofluidik odası kullanarak, akal levha aksal bölmeye oluşur ve hücre gövdeleri hücre gövdesi bölmesinden, nöron topu kültürüne benzer şekilde kaldırılabilecektir. Ancak, mikrofluidik Oda Özel aparattır ve sürekli kültür durumunu korumak için bazı beceriler gerektirir. Nöron top kültürü özel cihaz kullanmak için gerekli değildir ve yeni bir deneysel Yöntem olarak tanıtılacak nispeten kolaydır. Nöron topu kültürünün özü sadece cam-alt çanak/odaya nöronal hücre agregaları (nöron topları) yerleştirmek için olduğundan, kolayca diğer yöntemlerle kombine edilebilir. Örneğin, LRRTM2-Beads kullanarak nöron topu kültürünün aynı anda 10-20 boncuk alanının floresans ölçmek için yüksek içerik taraması için geçerli olduğu düşünülmektedir.
Bu protokolün kritik adımı PLL ile kaplamasıdır. PLL kaplama üniforma değilse, nöron topları akons her yönde eşit şekilde uzatmaz. Bu, presynapse oluşumunun etkili analizini rahatsız ediyor. Biz cam coverfları ve cam-alt yemekleri kullanıyoruz, ancak, cam bazen PLL ile nöronal kültür ve üniforma kaplama için temiz değildir. Bu protokolde, ilk başta cam coverjeler ve cam alt yemekler, 1-3 için nötr olmayan fosforsuz deterjan içinde ıslatılır ve sonra Ultra Saf suyla 8 kez yıkanır. Moleküler ağırlığı > 300.000, düşük istenmeyen arka plan için konsantrasyonu (15 μg/mL) azaltmak için PLL kullanıyoruz. PLL 'nin daha düşük molekül ağırlığı (Örneğin, 30000-70000) kullanıldığında, akonları genişletmek için daha yüksek konsantrasyon (100 μg/ml) gereklidir.
Bu yöntemin sınırlandırılması, nöron Ball kültürünün DIV15-16 > koruyamaz olmasıdır. DIV15-16 sonra nöron topları akons parçalanır. Parçalanmış akons LRRTM2 boncuk uygulama sonra herhangi bir presynapse üretmeyin. Bu nedenle, bu yöntem olgun nöronlar (> DIV21) analiz etmek için geçerli değildir. Ancak, çoğu durumda11,12,21,22, presynapse oluşumu assay DIV14 yılına kadar kültürlü genç nöronlar kullanır. Başka bir sınırlama, hücre organları olmadan aksonlar 4 h üzerinde hayatta olamaz. Biz şimdiye kadar presynapses 5 sinaptik proteinlerin birikimi analiz, biz kontrol tüm proteinlerin birikimi 4 h (yayınlanmamış gözlem) içinde neredeyse Plato ulaştı. Sinaptik proteinlerin (hücre gövdesi veya Akon) nereden sinaptik proteinler türetilir analiz etmek için yeterli 4 h birikir olarak kabul edilir.
LRRTM2-boncuklar ile nöron top kültürünün kombinasyonu nispeten basit ve esnek birçok deneysel platformlar adapte etmektir. Bu yöntemi, AM1-43 boya (yayınlanmamış gözlem) kullanarak presynaptik aktivite ölçmek için zaten uyguladıysanız. Bu yöntem, yüksek verimlilik taraması için uygulanabilir olarak kabul edilir. Presynapse oluşum tahlil LRRTM2-boncuk altında oluşturulan presynapses içinde sinaptik proteinler boyama tarafından yüksek içerik taraması uygulamak mümkündür. Bu yöntem nörolojik hastalığı tedavi etmek için yeni bileşikler bulmak için katkıda bulunacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, bilimsel araştırmalar için JSPS Grant-ın-Aid (KAKENHI) (C) (No. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki) tarafından kısmen desteklenmektedir. Biz Dr terukazu Nogi ve Bayan makiko neyazaki (Yokohama City Üniversitesi) nazik biyotinlenmiş LRRTM2 protein sağlamak için teşekkür ederiz. Teknik yardım için Honami Uechi ve Rie Ishii 'ye de teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) | Nunc | 176740 | |
| Complete EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| cooled CCD camera | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Deoxyribonuclease 1 (DNase I) | Wako pure chemicals | 047-26771 | |
| Expi293 Expression System | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Horse serum | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| image acquisition software | Nikon | NIS-element AR | |
| Image analysis software | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Neurobasal media | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus |
Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| Prepacked Disposable PD-10 Columns | GE healthcare | 17085101 | |
| rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diameter: 4-5 µm |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
References
- Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
- Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).
- Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).
- Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).
- Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).
- Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. , (2018).
- Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).
- Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. , (2017).
- Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).
- Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).
- Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).
- Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).
- Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).
