Summary
Presynapse 형성은 적절한 순서로 시 냅 스 단백질의 축적을 포함 하 여 동적 과정. 이 방법에서, presynapse 형성은 "뉴런 볼" 배양물의 축축한 시트에 presynapse 조직 단백질과 공액된 구슬에 의해 유발되므로 시냅스 단백질의 축적은 presynapse 형성 동안 분석되기 쉽습니다.
Abstract
신경 발달 도중, 시냅스 대형은 신경 회로를 설치하는 중요한 단계입니다. 시 냅 스를 형성 하기 위해, 시 냅 스 단백질 은 미성숙 시 냅 스에서 세포 체 및/또는 로컬 번역에서 전송 하 여 적절 한 순서로 공급 해야 합니다. 그러나, 그것은 완전히 이해 되지 않습니다 어떻게 시 냅 스 단백질 적절 한 순서로 시 냅 스에 축적. 여기서, 우리는 뉴런 볼 배양과 구슬의 조합을 이용하여 시냅스 전 형성을 분석하여 시냅스 전 형성을 유도하는 새로운 방법을 제시한다. 신경 세포 응집체인 뉴런 볼은 세포체와 모수석에서 멀리 떨어진 축축한 시트를 제공하므로 세포체의 압도적인 신호를 피함으로써 약한 형광 신호가 검출될 수 있습니다. 구슬은 presynapse 대형을 트리거하기 때문에, 우리는 류신이 풍부한 반복 막 간 신경 2 (LRRTM2), 흥분성 presynaptic 주최자와 결합된 구슬을 사용합니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 소포성 소포 단백질인 소포성 단백질인 소포성 단백질인 소포체 1(vGlut1)이 활성 영역 단백질인 Munc18-1보다 더 빨리 시냅스로 축적된다는 것을 입증했습니다. Munc18-1 세포 체를 제거 한 후에도 presynapse에 의존적으로 축적 된 번역. 이 발견은 세포체에서 수송되지 않는 축색에 있는 현지 번역에 의하여 Munc18-1 축적을 나타냅니다. 결론적으로,이 방법은 시 냅 스 및 시 냅 스 단백질의 소스에 시 냅 스 단백질의 축적을 분석 하는 데 적합 하다. 뉴런 볼 배양이 간단하고 특수 장치를 사용할 필요가 않기 때문에이 방법은 다른 실험 플랫폼에 적용 될 수 있습니다.
Introduction
시냅스 형성은 신경 회로 1,2,3의발달 중에 중요한 단계 중 하나입니다. 시냅스 전후로 구성된 전문 구획의 형성은 축삭과 모수석의 적절한 인식, 활성 영역 및 후발성 밀도의 형성, 그리고 적절한 정렬을 포함하는 복잡하고 다단계 과정입니다. 이온 채널 및 신경전달 물질 수용체 1,2. 각 과정에서, 시 냅 스 단백질의 많은 종류는 세포 체에서 시 냅 스 단백질을 수송 하 여 적절 한 타이밍에 이러한 전문 된 구획에 축적 및/또는 구획에 로컬 번역에 의해. 이러한 시 냅 스 단백질 기능 시 냅 스를 형성 하기 위해 조직 된 방식으로 배열 될 것으로 간주 됩니다. 시 냅 스 형성을 포함 하는 일부 시 냅스 단백질의 기능 장애 는 신경 질환 결과 4,5. 그러나, 그것은 불분명 한 방법 시 냅 스 단백질 적절 한 타이밍에 축적.
시 냅 스 단백질 조직 된 방식으로 축적 하는 방법을 조사 하기 위해, 연대순으로 시 냅 스 단백질의 축적을 검사 하는 데 필요한. 일부 보고서는 뉴런의 해리 된 문화에서 시냅스 형성을관찰하기 위해 라이브 이미징을 입증 6,7. 그러나, 그것은 단지 현미경 검사법에서 시 냅 스 형성을 시작 하는 신경 세포를 찾는 시간이 많이 걸립니다. 시 냅 스 단백질의 축적을 효율적으로 관찰 하기 위해, 시 냅 스 형성 연구원이 형성을 유도 하 고 싶은 시간에 시작 해야 합니다. 두 번째 과제는 세포체로부터의 수송 또는 시냅스의 국소 번역으로 인한 시냅스 단백질의 축적을 구별하는 것입니다. 그 목적을 위해, 번역 수준은 세포체에서 시냅스 단백질의 수송을 허용하지 않는 조건하에서 측정될 필요가 있습니다.
뉴런 볼 배양과 구슬의 조합을 이용하여 새로운 프리시냅스 형성 분석방법을 개발하여 프리시냅스 형성을 유도한다8. 뉴런 볼 배양은 세포체9,10을둘러싼 축색 시트의 형성으로 인해 축색 표현형을 검사하기 위해 개발된다. 우리는 흥분성 presynapssss를 유도하는 시냅스 조이커인 류신 풍부 한 반복 막 간 뉴런 2 (LRRTM2)와 결합 된 자기 구슬을 사용 (그림1A)11,12,13. LRRTM2 비드를 사용하여, 구슬이 적용되는 시점에서 presynapse 형성이 시작됩니다. 즉, presynapse 형성 은 동시에 뉴런 볼의 축축의 수천에서 시작, 따라서 그것은 시 냅 스 단백질의 축적의 정확한 시간 과정을 효율적으로 검사 할 수 있습니다. 또한, 뉴런 볼 배양은 세포체를 제거함으로써 소마로부터 시냅스 단백질을수송하는 것을 차단하기 쉽다(도1B)8. 우리는 이미 세포체가 없는 축세포가 생존할 수 있고 세포체 제거 후 적어도 4시간 동안 건강하다는 것을 확인했습니다. 따라서, 이 프로토콜은 시냅스 단백질이 유래되는 곳(세포체 또는 축색)과 시냅스 단백질이 조직화된 방식으로 어떻게 축적되는지 를 조사하는 데 적합합니다.
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Protocol
이 원고에 기술된 실험은 요코하마시 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 설명된 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 매달려 드롭 문화로 뉴런 볼의 준비 (시험관 내 일 (DIV) 0-3)
참고: 뉴런 볼 배양의 제조를 위해 여기에 기술된 절차는 사사키 그룹이 이전에 보고한 방법에 기초하여일부수정9,10. 우리는 또한 해리 문화14에대한 Banker 방법에서 몇 가지 절차를 채택했다.
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해부를 시작하기 전에 다음 확인
- 필요한 모든 솔루션을 준비하고 사전에 오토클레이브/여과하여 소독하십시오.
- 이 피질 뉴런 문화의 각 단계에서 사용되는 모든 악기와 재료를 준비하십시오.
- 70% 에탄올로 층류 공기 흐름 캐비닛, 해부 테이블, 스테레오 현미경, 가위 및 집게의 스테이지 플레이트를 스프레이하고 닦으하십시오.
- CO2를 적용한 후 마우스를 안락사시키고 복부를 해부하여 E16 배아를 얻습니다.
- 포셉의 미세 한 팁의 도움으로 배아에서 두뇌를 조심스럽게 제거하고 HEPES 완충 소금 용액 (HBSS)의 4 mL을 포함하는 60mm 세포 배양 접시로 옮김.
참고 : 해부 매체 HBSS는 10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.09 mM Na2HPO4,1.1 mM KH2PO4,5.6 mM D-포도당 및 5.64 μM 페놀 레드를 포함합니다. - 두피를 제거하고 후각 전구를 자르고 스테레오 현미경으로 집게의 미세 한 팁을 사용하여 각 대뇌 반구에서 피신 피질을 분리하고 신선한 HBSS를 포함하는 다른 60mm 접시로 옮김하십시오. 각 별도의 뉴런 볼 배양에 대해 적어도 3-5개의 배아를 사용한다.
- 라미나 흐름 세포 배양 후드에 미세 도해 스프링 가위로 작은 조각으로 피질자를 잘라.
- 다진 코르티제를 15 mL 튜브로 옮기고 HBSS에서 0.125% 트립신의 4 mL에서 다진 코르티크를 37°C에서 수조에서 4.5분 동안 트립시노이즈합니다.
참고: 이 트립시니화 시간은 증가하는 시간(> 4.5분)이 훨씬 더 죽은 뉴런으로 이어지기 때문에 효율적인 뉴런 문화에 매우 중요합니다. - 멸균 전사 파이펫에 의해 HBSS의 10 mL을 포함하는 새로운 15 mL 튜브로 세포 응집체를 옮기고, 37°C에서 5분 동안 배양한다.
- 글루타맥스, B27 보충제(NGB 배지), 0.01% DNase I 및 10% 말 혈청을 함유하는 2 mL의 신경기저 배지를 포함하는 새로운 15 mL 튜브로 세포 응집체를 옮니다.
- 트라이시니화 된 코르티케는 불 광택 미세 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 반복적으로 위아래로 (3-5 회) 피펫을 피펫으로 처리합니다.
참고: 불이 연마된 미세 유리 파스퇴르 피펫의 직경은 Banker방법 용지(14)에 기재된 바와 같이 매우 중요하다. 파이펫이 너무 좁아서 코르티티를 통과하지 못하면 2-3개의 다른 크기를 가진 파이펫을 준비하고 더 큰 파이펫을 사용해 보십시오. - 뉴런 볼을 준비하기 위해 위의 셀 서스펜션을 취하고 NGB 배지를 사용하여 세포 밀도를 1 x 106 셀 /mL로 조정하십시오.
- 10,000 개의 세포 / 드롭 (1 방울은 10 μL)을 포함하는 매달려 있는 방울로 피질 뉴런을 배양 10cm 배양 요리의 상부 뚜껑 내부.
- 배양 요리의 하단 부분에 인산완충 식염수(PBS) 7 mL를 첨가한 다음, 가습된 상태에서 5% CO2로 37°C에서 3일 동안 인큐베이터에 보관하여 뉴런 볼 형성을 허용합니다.
2. PLL 코팅 유리 커버립 및 문화 유지 보수에 뉴런 공을 배치 (DIV 3-11)
참고 : 유리 커버의 코팅 전에 폴리 L-리신 (PLL)로 입술, 세제를 사용하여 커버 립을 세척하는 것이 중요합니다. 유리 커버슬립은 때때로 신경 배양및 PLL을 가진 균일한 코팅을 위해 이렇게 깨끗하지 않습니다. 비균일 PLL 코팅은 뉴런 볼의 고르지 못한 축색 연장을 초래할 수 있다.
- 1/20 희석된 중성 비인성 세제에 1-3박 동안 세라믹 랙에 담그세요.
- 커버립을 초순수로 8회 세척한 다음 오븐에서 200°C에서 12시간 동안 살균합니다.
참고 : 여기에서 모든 단계는 층류 공기 흐름 세포 배양 후드에서 수행해야합니다. - 구운 커버립을 100mm 접시에 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김. 뚜껑과 바닥 접시 사이에 파라필름으로 접시를 밀봉 한 후, 구운 커버 슬립은 장기간 보관할 수 있습니다.
- (선택 사항) 커버슬립에 파라핀 점을 바하십시오. 점들은 뉴런 볼이 플라스틱 접시에 직접 접촉하여 면역 염색 중에 커버립에서 분리되는 것을 방지하기 위한 공간을 만듭니다. 약 90°C의 온수 욕조에서 적절한 병에 파라핀을 녹입니다. 파저 피펫을 파라핀에 담근 다음 빠르게 터치하여 커버슬립 가장자리 근처에 세 개의 지점을 만듭니다.
- PLL(MW > 300,000)을 PLL 용액(붕산완충제의 15 μg/mL)을 사용하여 60mm 접시에 파라핀 비드 유리 커버슬립을 바르고 CO2 인큐베이터에서 1시간 이상 유지합니다.
- PBS로 4회 세척한 후, PLL 코팅 커버슬립을 각각 350 μL의 NGB 배지를 함유하는 4웰 플레이트로 옮기고 시토신 β-D-아라비노푸라노시드 염산염(AraC, 3 μM)을 배지로 옮겨 분할 세포를 죽이도록 하였다.
- 뉴런 볼을 옮기기 전에 37°C에 도달하는 배지의 온도를 보장하기 위해CO2 인큐베이터에 PLL 코팅 커버슬립을 함유하는 이 4웰 플레이트를 적어도 20분 동안 유지한다.
- DIV 3에서 "뉴런 볼"이 아주 잘 형성되면 CO2 인큐베이터에 보관된 4웰 플레이트(5 개의 뉴런 볼/웰) 내부에 PLL 코팅 커버슬립으로 이송합니다.
- 48시간 후, 뉴런 볼 배양 배지를 신선한 AraC 프리 NGB 배지로 교체한다. 이 절차 직전에 온도가 37°C에서 준비된 층류 공기 흐름 세포 배양 후드에 핫 플레이트를 사용하십시오.
참고: 배양이 CO2 인큐베이터의 외부에 있는 시간을 줄이기 위해 핫 플레이트상에서 가능한 한 빠르게 변화하는 배지를 수행하여야 합니다. - 이 뉴런 볼 배양체를CO2 인큐베이터에서 최대 DIV 11까지 유지한다.
참고: DIV 11-12에서는 최대 1-2mm의 신경구를 확장하는 뉴런 볼이 실험에 사용됩니다.
3. 세포체 유무에 관계없이 뉴런 볼 배양에 LRRTM2 비드 적용 (DIV 11-12)
참고 : 뉴런 볼 배양에 LRRTM2 구슬을 적용하기 전에 세포체를 제거하는 것이 좋습니다. 따라서, 처음에는 LRRTM2 비드를 준비한 다음, 세포체를 제거한 다음, 나중에 LRRTM2 비드를 가능한 한 빨리 배양에 적용한다. 바이오티니어 LRRTM2는 노기 그룹(요코하마시 대학)에서 조건부 배지로 제공합니다. 이들은 E로부터의 비오틴 수용자 서열 및 비오틴 리가아제를 포함하는 발현 벡터를 사용한다. 대장균 (비라) 15세 , 도 16은 LRRTM2에 비오틴을 부착하고, 발현 벡터는 Expi293 발현 시스템에 포함된 Expi293F 세포에 형질감염된다. 벡터 정보는 추가 그림1에서 사용할 수 있습니다. 생체면역화된 LRRTM2-컨쥬게이트 스트렙타비딘 비드는 LRRTM2-Fc–컨쥬게이트 단백질 A 비드에 비해 면역염색의 배경을 크게 감소시켰으며,이는 LRRTM2 시스템 8에 사용된다.
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생체 질화된 LRRTM2 구슬의 제조
- 생체측화 된 LRRTM2를 발현하는 Expi293F 세포의 컨디셔닝 배지에서 과잉 비오틴을 제거하려면, PBS (총 2.5 mL)의 0.8 mL를 혼합한 컨디셔닝 배지의 1.7 mL을 PD-10 겔 여과 컬럼에 적용합니다. PD-10 컬럼은 25 mL의 초순수와 25 mL의 PBS로 사전 조정됩니다.
- 3.5 mL의 PBS로 용출하고 LRRTM2 주식으로 흐름을 수집합니다.
참고 : 이 LRRTM2 스톡은 aliquots에 분배하고 장기간 -80 °C에 보관 할 수 있습니다. 생체응화 LRRTM2의 발현 수준은 때때로 로트마다 다양합니다. 따라서, 비드에 컨쥬게이션하는 LRRTM2 스톡의 적정 부피는 뉴런 볼에 충분히 presynapss를 형성하도록 결정되어야 하며, LRRTM2 스톡의 새로운 많은 것이 처음에 사용될 때. - 스트렙타비딘 코팅 된 자기 입자 (직경 : 4-5 μm)의 현탁액에서 미세 원심 분리튜브로 20 μL을 가져 가라. 네오디뮴 영구 자석을 부착한 수제 장치에 구슬을 고정시키고 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에서 PBS-MCBC 100 μL로 3회 세척합니다.
참고 : PBS-MCBC는 5 mMMgCl 2, 3 mM CaCl2,0.1 % BSA 및 0.1 % 완전 EDTA 프리를 포함한 PBS를 포함합니다. - 구슬에서 완전히 PBS-MCBC를 제거한 후, 세척된 구슬에 LRRTM2 스톡(보통 500-1,000 μL, 참고 3.1.2 참조)의 미리 정해진 부피를 추가합니다. 1-2 시간 동안 4 °C에서 회전을 사용하여 혼합물을 배양합니다.
- 비드를 PBS-MCBC 100 μL로 두 번 세척하고 나중에 NGB 배지 100 μL로 세척합니다.
- 뉴런 볼 배양에 적용하기 위한 NGB 배지의 50 μL에서 LRRTM2 비드를 재중단한다.
- 생체 용 LRRTM2 단백질을 추가하는 것을 제외하고 다른 미세 원심 분리관에서 대조군 비드 (음성 대조군)를 준비하기위한 동일한 절차를 사용하십시오.
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DIV 11-12에서 뉴런 볼에서 세포 체를 제거하고 LRRTM2 구슬을 적용
- 4웰 플레이트의 우물을 "세포체(+)"와 "세포체(-)"로 표시합니다.
- 이전에 입체 현미경으로 70% 에탄올로 분무한 면도날로 노란색 팁의 결말을 45° 각도로 잘라냅니다(그림1B).
- 뉴런 볼의 세포 체 영역에 노란색 팁 끝을 넣고 흡입에의해 세포 체를 제거합니다 (도 1B).
- 실험의 각 지정된 조건을 식별하려면 웰을 다시 "LRRTM2 비드" 및 "제어 구슬"로 레이블을 지정합니다.
- LRRTM2를 적용하고 뉴런 볼 배양에 비드를 제어하고, 페릿 자석을 사용하여 1 분 동안 플레이트의 바닥에 침수하여 presynapse 형성을 시작합니다. 이 절차는 모든 구슬을 동시에 터치다운할 수 있도록 합니다. 특히, LRRTM2 비드와 함께 짧은 시간 배양(예를 들어, 30분 및 1시간)에 동기를 두어 효과적일 것이다.
- 시간 코스 실험을 수행하려면 각각 0 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간 및 18 시간동안 각각 별도의 라벨을 부착하고 표시된 시간 간격으로 LRRTM2 비드를 적용하십시오.
- LRRTM2 비드를 첨가한 후, 뉴런 볼 배양액을 지정된 시간(0 분 내지 18시간)동안 비드와 배양하여 프리시냅스를 형성한다.
4. 면역 염색 및 현미경 검사법
참고 : 축세포가 4 시간 후에 세포체가 없는 상태에서 점차적으로 죽는 경향이 있기 때문에 세포체가 유무에 관계없이 실험 조건에서 LRRTM2 비드로 배양을 통해 4 시간 동안 세포를 수정하십시오. LRRTM2 비드가있는 시간 과정의 경우 지정된 시간에 셀을 수정하십시오.
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LRRTM2 구슬로 presynapse 형성 후 뉴런 볼 배양에서 뉴런을 고정하고 염색
- NGB 배지를 제거하고 실온에서 20 분 동안 PBS (250 μL / well)에서 4 % PFA로 뉴런 볼을 고정 한 다음 5 분마다 5 00 μL씩 500 μL로 씻으하십시오.
- 고정 된 세포를 TBS (트리스 버퍼링 식염수 : 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.3) 및 150 mM NaCl)으로 5 분 이상 세척하십시오.
- 5 분 동안 0.3 % 트리톤 X-100을 포함하는 TBS로 뉴런 볼 배양세포 / 축세포를 투과시.
- 차단 버퍼 (0.1 % 트리톤 X-100 및 TBS에서 5 % NGS (일반 염소 혈청)로 차단하기 위해 세포를 1 시간 유지하십시오.
- 1 차적인 항체로 세포를 배양; 항-토끼-vGlut1 (매미 글루타민산수송기 1 (1:4000)) 및 반대로 마우스-Munc18-1 (1:300) 4°C에서 밤새 희석된 항체로 희석하였다.
- 면역형광(IF) 완충액(0.1% 트리톤 X-100 및 TBS에서 2% BSA)으로 커버립을 4회 세척하고 형광단(Alexa dye)-2차 항체로 30분 동안 배양한다; 안티 마우스 - IgG-알렉사 555 (1:500), 안티 토끼 IgG-알렉사 488 (1:1000).
- PBS에서 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌레(DAPI, 1 μg/mL)로 5분 동안 뉴런의 세포체의 핵을 염색합니다.
- 커버슬립을 PBS로 세 번 씻은 다음 167 mg/mL 폴리(비닐) 알코올과 6 mg/mL N-프로필 갈레이트가 포함된 마운팅 미디어를 사용하여 유리 슬라이드에 장착합니다.
- 유리 슬라이드를 현미경 검사법까지 -20°C의 냉장고에 보관하십시오. 슬라이드가 -20 °C에 저장될 때 유리 슬라이드의 형광 신호는 적어도 1 년 동안 감지 할 수 있습니다.
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형광 현미경으로 이미지 촬영
- 60X 오일 침지 렌즈를 사용하여 냉각된 CCD 카메라로 반전된 형광 현미경으로 차동 간섭 콘트라스트 및 IF 이미지를 캡처합니다. 이미지 수집 소프트웨어의 경우 소프트웨어 설치 현미경 시스템을 사용합니다. 이미지 J를 이미지 분석 소프트웨어로 사용합니다.
- 다음 수식을 사용하여 축축에서 전시냅스에서 IF 강도를 측정합니다. 비드에 관심 영역의 강도 경우 (ROI) – 비드 영역 강도 / 비드에서 20 μm을 따라 축색 강도 오프 – 배경 강도. 이 비율 강도는 단백질축적 지수를 제공한다(도 4A). Image J 소프트웨어를 사용하여 원래 16비트 이미지에서 측정을 수행합니다.
- LRRTM2 비드로 유도된 프리시냅스에서 특정 단백질의 축적 수준을 정량화하려면, 항상 현미경(60X)을 가진 세포체에서 2필드 또는 그 이상 떨어져 있는 영역을 선택한다.
참고 : 조밀 한 축삭이 세포 체 근처에 있고 뉴런 볼의 주변이 단일 축삭을 제공 할 수 있기 때문에 이미징을위한 뉴런 볼의 영역 선택은 매우 중요합니다. - 정확한 측정을 위해 5가지 축색 필드(전체와 유사한 거리)/커버슬립을 선택합니다.
- 다른 날과 실험 사이에 동일한 이미징 조건을 유지
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Representative Results
여기서, 우리는 신경 볼 배양액의 축사 시트의 LRRTM2 유도 전시냅스에서 시냅스 전 단백질의 축적의 대표적인 결과를 보여준다. 시냅스 전 단백질로서, 우리는 흥분성 시냅스 소포 단백질 vGlut1 및 활성 영역 단백질 Munc18-1을 분석했다. 우리는 또한 presynapses에 있는 vGlut1와 Munc18-1의 축적의 시간 과정을 검토하고, 세포 바디및 단백질 합성 억제기를 제거하는 축세포를 사용하여 presynapses에 있는 Munc18-1의 근원을 나타내는 결과를 얻었습니다. 최근, 우리는 presynapses8에서 Munc18-1의 축적에 깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질(FMRP)의 역할을 조사했다. FMRP는 깨지기 쉬운 X 증후군 (FXS)의 원인이 되는 유전자 생성물이며, 번역17,18,19를억제하는 mRNA 결합 단백질이다. 우리는 또한 FMRP를 인코딩하는 Fmr1 유전자에 결핍된 FXS 모형 마우스를 사용하여 Munc18-1 축적에 있는 FMRP의 관여를 검토했습니다.
DIV11에서 뉴런 볼 배양에 LRRTM2-비드의 적용은 뉴런 볼의 축축액의 전시냅스에서Munc18-1의 축적을 유도하였다(도 2A). 세포체가 제거된 축사에서도, Munc18-1의 축적은 세포체가 있는 뉴런 볼의 축과 유사한구슬 하에서 관찰되었다(도 2B). 전형적인 경우에, 뉴런 공을 가진 4 시간 배양 후에 구슬의 80% 이상은 Munc18-1 및 vGlut-1를 염색하여 판단된 presynapses에 있는 시냅스 단백질의 축적을 유도할 수 있습니다. 축산이 너무 붐비고 세포체 근처에서 중첩되기 때문에 (그림2Aa,Ba), 축산 시트의 더 많은 주변 영역은 축산이 너무 겹치지 않는 곳을 측정했습니다 (그림2Ab,Bb, 예를 들어, 2-필드에서 멀리 떨어진 주변 영역) 현미경 (60X)를 가진 세포 체에서 떨어져 보기 또는 더 많은. 축색 시트의 주변 영역을 고배율 대물렌즈(60X)로 분석한 경우, vGlut1 및 Munc18-1은 구슬 아래축의 전시냅스에서 명확하게 축적되었다(그림 3). 때때로, vGlut1 같이 시냅스 vesicular 단백질의 형광 신호는 구슬 의 밑에 너무 많이 축적하기 때문에, 구슬 외부 축색 지역에서 검출되기 어렵습니다. Munc18-1의 경우, 비드 외부의 축축한 영역에서 형광 신호를 약하게 감지할 수 있습니다.
LRRTM2-비드에 의해 유도된 프리시냅스에서 시냅스 단백질의 축적 수준을 정량화하기 위해, 구슬 아래와 비드 외부의 축종의 형광 강도를 측정한 다음 "단백질 축적 지수"(도4A,및 프로토콜 섹션에 자세히 설명되어 있습니다). 시간 코스 실험은 presynapsss에서 vGlut1의 축적이 30 분 (그림4B)에서현저하게 증가했다는 것을 보여주었습니다. 한편, Munc18-1 축적은 2시간에서 유의하게 증가하기 시작하여 4시간(도4C)에서고원에 도달하였다. 이들 데이터는 시냅스 소포 단백질 vGlut1이 활성 영역 단백질 Munc18-1보다 일찍 프리시냅스에서 축적되었음을 나타낸다. 프름1-KO 뉴런의 전시냅스에서 의 문크18-1 축적은 야생형(WT)(그림4C)보다1.5배 더 증가하였습니다. 다음으로, 세포체로부터의 수송 또는 축색의 국부번역으로 인한 Munc18-1 축적을 구별하기 위해, 단백질 합성 억제제 아니소마이신의 효과를 세포체의 존재 또는 부재 에서의 축적에 대해 조사하였다(도4D) . 애니소마이신은 축산에서 문크18-1 축적을 유의하게 억제(도4D)축적이 단백질 합성 의존성임을 나타낸다. 세포체가 없는 축세포의 전시냅스에서의 축적은 세포체와 크게 다르지않았다(도 4D). 이 결과는 presynapses에 있는 Munc18-1의 축적이 주로 축산에서 파생된다는 것을 건의합니다, 그러나 세포체에서 Munc18-1의 수송하지 않습니다. 시 냅 스 단백질의 축적은 세포 시체를 제거 하 여 축 세포의 presynapsss에서 억제 하는 경우, 이 감소는 세포 시체에서 전송 때문 이라고 간주 됩니다. 실제로 형광염료로 대사적으로 표지된 새로 합성된 총 단백질의 축적을 조사한 결과, 세포체를 제거하면 축세포의 프리시냅스와 비교하여 새로 합성된 총 단백질의 축적이 현저히 감소했습니다. 세포 몸8. Fmr1-KO에서의 Munc18-1 축적은 WT에 비해 더 증가되었지만, 아니소마이신은 WT와 유사한 수준에서 축적을 억제하고 세포체를 제거하는 것은 축적에 영향을 미치지 않았다(도 4D). 이러한 결과는 FMRP가 축산에서 Munc18-1의 로컬 번역에 관여한다는 것을 시사합니다.
여기에 제시된 대표적인 결과는 이 방법이 시냅스 단백질이 시간 과정 실험에 의해 조직화된 방식으로 어떻게 축적되는지 조사하고, 시냅스 단백질의 공급원(세포체 또는 국소로부터의 수송)을 조사하는 데 적합하다는 것을 입증합니다. 세포체를 제거하여 축색으로 변환합니다.
그림 1. 뉴런 볼에서 세포체의 프리시냅스 형성 및 제거 계획.
(a) 생체용 LRRTM2 를 이용한 프리시냅스 형성 분석은 E16 코르티케로부터 제조된 뉴런 볼 배양액의 축에서 전시냅스를 유도하기 위해 구슬을 공액화시켰다. LRRTM2, 포스트 냅 스 단백질, neurexin 바인딩 (NRXN) presynapse 주최자 역할을. 스트렙타비딘 비드는 생체면역 LRRTM2 세포외 영역(LRRTM2 비드)에 공액화되어 DIV11-12에서 뉴런 볼 배양에 적용하여 시냅스를 유도하였다. 이 그림은 이전 발행물8에서 수정되었습니다. (b) 노란 팁 단부는 45° 각도로 뉴런 볼 배양의 세포 체 내 영역에 절단및 배치하였다. 세포 체는 흡입에 의해 제거되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. Munc18-1 뉴런 볼의 세포체가 존재하고 없는 프리시냅스에서 축적됩니다.
(a) LRRTM2 비드와 4 시간 배양 후, 액슨에서 유도 된 시냅스 부위에 축적 된 활성 영역 단백질 Munc18-1 (상부 패널; 실험 계획, 중간; 위상 이미지, 하부; If 이미지 문크18-1 축적). 이미지는 10X 렌즈와 중간 배율(1.5X)을 사용하여 저배율 이미지로 캡처되어 뉴런 볼, 축색 및 구슬로 구성된 전체 그림을 볼 수 있습니다. 파선 사각형은 구슬의 정확한 이미징 위치를 위해 뉴런 볼의 면적을 나타냅니다. 배율 막대, 20 μm(왼쪽; 원본 이미지), 10 μm(오른쪽; 확대된 이미지). (B) Munc18-1은 축색에서 유도된 시냅스 부위에서 세포체가 없는 경우에도 매우 잘 축적되었다. 이 결과는 축세포가 생존하고 적어도 4 시간 동안 세포체를 제거 한 후에도 presynapss를 형성 할 수 있음을 나타냅니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. vGlut1 및 Munc18-1의 축적은 세포체가 유무에 관계없이 축세포의 전시냅스에서.
흥분성 전시냅스 마커 vGlut1(녹색) 및 Munc18-1(레드)은 LRRTM2 비드를 첨가한 후 4시간 동안 presynapses에 축적된다. (상부 패널; 세포 체, 하부; 세포 체 없이). 60X 오일 침지 렌즈를 사용하여 고배율을 측정하여 형광 강도를 측정하는 이미지를 캡처했습니다. 파선 원은 구슬의 위치를 설명했다. Munc18-1은 presynapses에 있는 세포 바디의 존재 그리고 부재에서 거의 유사한 넓이 축적그러나 vGlut1 축적은 세포 바디없이감소됩니다 8. 배율 표시줄, 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. IF 강도 측정 및 세포체 제거 및 단백질 합성 억제제의 IF 강도 측정 절차 는 뉴런 볼에서 Munc18-1 축적.
(a) 도면은 뉴런 볼 배양액의 축에서 유도된 시냅스 부위에서 IF 강도의 정량화 방법을 보여주었다. 스케일 바, 5 μm. 자세한 내용은 프로토콜 섹션에 설명되어 있습니다. (b) LRRTM2 비드로 유도된 프리시냅스에서 vGlut1 축적의 시간 과정. 도시된 데이터는 n = 20에 대한 평균 ± SEM입니다. Tukey의 다중 비교 테스트를 갖춘 양방향 ANOVA. **p < 0.01. (C) WT및 Fmr1-KO프리시냅스에서 문크18-1 축적의 시간 과정은 LRRTM2 비드하에. 표시된 데이터는 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 n = 20, 양방향 ANOVA에 대한 평균 ± SEM입니다. n.s., 중요하지 않음; **P < 0.01, WT와 KO 사이에 크게 다른. (D) 막대 그래프는 (CB+) 또는 (CB-) 세포체가 없는 25 μM 아니소마이신(Aniso)의 존재 또는 부재 시에 WT 및 Fmr1-KO뉴런 볼의 전시냅스에서 Munc18-1 축적 수준을 나타냈다. 도시된 데이터는 n = 20에 대한 평균 ± SEM입니다. Tukey의 다중 비교 테스트를 갖춘 양방향 ANOVA. **p < 0.01, n.s., 중요하지 않음. # 표시 p < 0.01, 크게 다른 와 아니소 마이신없이. 이 수치는 이전 발행물8에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 그림 1. LRRTM2-ECR(세포외 영역) 및 비라(대장균으로부터의 비오틴 리가제)에 대한 비시스트로닉 발현 벡터.
LRRTM2-ECR 및 BirA 코딩 서열 사이에는 단일 mRNA에서 두 단백질을 공동 발현할 수 있는 내부 리보소말 엔트리 사이트(IRES) 서열이 있습니다. hEF1-HTLV 프로모터는 빅스트로닉 mRNA를 표현하고, 두 단백질 모두 번역 후 신호 펩티드 서열에 의해 분비된다. LRRTM2-ECR 코딩 서열은 여러 펩티드 태그 서열(DYKDDDK, TEV, Myc 및 그의 태그) 및 비오틴 수용기 서열(BAS)에 부착된다. BirA는 DYKDDDV 태그에 부착되어 있습니다. 분비비다비딘 구슬에 결합하기 위해 LRRRTM2-ECR의 BAS 서열의 리신을 분비한 비라 바이오티니레이트. 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 뉴런 볼 배양을 사용하여 LRRTM2-비드로 자극된 시냅스 형성을 검사하는 새로운 방법을 개발했습니다. 현재, 대부분의 시냅스 형성 분석은 폴리-D-리신(PDL) 코팅된 비드 및 해리된 배양/미세유체챔버(20,21,22)를포함한다. 이 방법의 장점 중 하나는 LRRTM2 비드입니다. LRRTM2는 neurexin과 상호 작용하여 특히11,12,13,PDL-비드는 흥분성 및 억제 presynapses 모두 비특이적으로20을유도합니다. 이 방법에서는, 그 구성원이 10 단백질3이상인 그밖 presynapse 주최자는, 실험 목적에 따라 생체 면역화된 단백질의 세포외 도메인을 변경하여 presynapss를 유도하기 위하여 적용가능합니다.
또 다른 장점은 뉴런 볼 배양입니다. 일부 경우에, 종래의 해리배양액은 전시냅스형성(20)을분석하기 위해 사용되었다. 그러나, 해리 된 문화는 presynapses 내에서 시 냅 스 단백질의 낮은 수준을 분석 하기 위해 적합 하지 않습니다., 세포 체와 수상 돌기에서 압도적인 신호 presynapss에 신호를 방해 하기 때문에. 대신, 일부 그룹은 21,22에서축사 및 세포 체를 별도로 배양하는 특수 장치인 미세 유체 챔버에서 해리 된 배양을 사용합니다. 미세 유체 챔버를 사용하여 축축한 시트는 축색 구획에 형성되고 세포체는 뉴런 볼 배양과 유사한 세포 체실에서 제거 될 수 있습니다. 그러나, 미세유체 챔버는 특별한 장치이며, 일정한 배양 상태를 유지하기 위해 몇 가지 기술이 필요하다. 뉴런 볼 배양은 특별한 장치를 사용할 필요가 없으며, 비교적 새로운 실험 방법으로 도입되기 가 용이하다. 뉴런 볼 배양의 본질은 단지 뉴런 세포 골재 (뉴런 공)를 유리 바닥 접시 / 챔버에 배치하는 것이기 때문에 다른 방법과 쉽게 결합 될 수 있습니다. 예를 들어, LRRTM2-비드를 이용한 뉴런 볼 배양은 10-20개의 비드 영역의 형광을 동시에 측정하는 고함량 스크리닝에 적용가능하다고 여겨진다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 PLL로 코팅하는 것입니다. PLL 코팅이 균일하지 않은 경우, 뉴런 볼의 축은 모든 방향으로 균일하게 확장되지 않을 것입니다. 이것은 presynapse 대형의 능률적인 분석을 방해합니다. 우리는 유리 커버 립과 유리 바닥 접시를 사용하지만, 유리는 때때로 신경 문화와 PLL과 균일 한 코팅에 대한 너무 깨끗하지 않습니다. 이 프로토콜에서는 처음에는 유리 덮개 입술과 유리 바닥 접시를 1-3 박 동안 중성 비 인성 세제에 담근 다음 초순수로 8 번 세척합니다. 우리는 낮은 바람직하지 않은 배경을 위해 그 농도 (15 μg / mL)를 줄이기 위해 분자량 > 300,000PLL을 사용합니다. PLL (예를들어, 30,000-70,000)의 낮은 분자량을 사용하는 경우, 더 높은 농도 (100 μg / mL)는 축을 확장 할 필요가있다.
이 방법의 한계는 뉴런 볼 배양이 > DIV15-16을 유지할 수 없다는 것입니다. 뉴런 볼의 축은 DIV15-16 후에 조각화됩니다. 조각난 축색은 LRRTM2 비드 적용 후 어떠한 사전 시냅스도 생성하지 않습니다. 따라서, 이 방법은 성숙한 뉴런(> DIV21)을 분석하기에는 적용되지 않는다. 그러나, 대부분의 경우11,12,21,22,presynapse 형성 분석은 DIV14까지 배양되는 젊은 뉴런을 사용한다. 또 다른 한계는 세포체가 없는 축세포가 4시간 이상 생존할 수 없다는 것입니다. 우리는 지금까지 presynapses에 있는 5 개의 시냅스 단백질의 축적을 분석했습니다, 우리가 확인한 모든 단백질의 축적은 4 시간 안에 거의 고원에 도달했습니다 (미공개 관찰). 시 냅 스 단백질에서 파생 된 시 냅 스 단백질을 분석 하는 4 시간에 충분히 축적 간주 됩니다 (세포 또는 축 색).
LRRTM2-비드와 뉴런 볼 배양의 조합은 많은 실험 플랫폼을 적응시키기에 비교적 간단하고 유연하다. 우리는 이미 AM1-43 염료 (게시되지 않은 관찰)를 사용하여 시냅스 전 활동을 측정하기 위해이 방법을 적용했습니다. 이 방법은 높은 처리량 스크리닝에 적용 가능한 것으로 간주됩니다. Presynapse 형성 분석은 LRRTM2-비드 의 밑에 형성된 presynapses에 시냅스 단백질을 염색하여 높은 함량 의 스크리닝을 적용하는 것이 가능하다. 이 방법은 신경 질환을 치료하는 새로운 화합물을 찾는 데 기여할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 부분적으로 JSPS 과학 연구를위한 원조에 의해 지원된다 (KAKENHI) (C) (번호 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. 사사키). 노기 테루카즈 박사와 네야자키 마키코(요코하마시 립대학)에게 생물학적 LRRTM2 단백질을 친절하게 공급해 주신 것에 감사드립니다. 또한 기술 지원을 해주신 우에치 호나미와 이시이 리에 대해서도 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) | Nunc | 176740 | |
| Complete EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| cooled CCD camera | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Deoxyribonuclease 1 (DNase I) | Wako pure chemicals | 047-26771 | |
| Expi293 Expression System | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Horse serum | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| image acquisition software | Nikon | NIS-element AR | |
| Image analysis software | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Neurobasal media | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus |
Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| Prepacked Disposable PD-10 Columns | GE healthcare | 17085101 | |
| rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diameter: 4-5 µm |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
References
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