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Bioengineering

बायोएक्टिव हाइड्रोफिलिक ग्लोबुलर प्रोटीन के जाल के लिए नानोलिपोसोम की तैयारी और विशेषता

Published: August 31, 2019 doi: 10.3791/59900
Automatic Translation
1, 1, 1
1Chemistry Institute, Federal University of Rio de Janeiro

Summary

यह अध्ययन नैनोकण अभिलक्षण के बाद नैनोलिपोसोम तैयारी के लिए पतली लिपिड फिल्म विधि का उपयोग करके शास्त्रीय जलयोजन का वर्णन करता है। एक 47 kDa-hydrophilic और गोलाकार प्रोटीन, टारिन, सफलतापूर्वक स्थिरता में सुधार करने के लिए एक रणनीति के रूप में encapsulated है, तेजी से निकासी से बचने, और नियंत्रित रिलीज को बढ़ावा देने के. विधि hydrophobic अणुओं encapsulation के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Abstract

वसासम नैनोकैप्स्यूल्स को दवा, कॉस्मेटिक और खाद्य उद्योगों में कई उद्देश्यों के लिए लागू किया गया है। liposomes के गुण उनके biocompatibility, biodegradability, गैर-प्रतिरक्षा, गैर विषैले, और दोनों हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक यौगिकों को फंसाने की क्षमता शामिल हैं. एक कार्बनिक विलायक में पतली लिपिड फिल्मों के शास्त्रीय जलयोजन एक तकनीक के रूप में यहाँ लागू किया जाता है टारिन encapsulate करने के लिए, एक संयंत्र लैक्टिन, nanoliposomes में. नानोलिपोसम आकार, स्थिरता, जालन दक्षता, और आकृतिक लक्षणीकरण का विस्तार से वर्णन किया गया है। नानोलिपोसोम 1,2-डाइलियोइल-स्न-ग्लिसरॉल-3-फॉस्फोएथेनोलमाइन (डीओपीई), 1,2-डिस्टेरॉयल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोएथेनोलेमिन-एन-जोमिनो (पॉलीथीन ग्लीकोल)-2000 (एमोनियम साल्ट; DSPE-MPEG 2000), और मुख्य घटक के रूप में cholesterylhemisuccinate (CHEMS). लिपिड को पहले क्लोरोफॉर्म में भंग कर दिया जाता है ताकि एक पतली लिपिड फिल्म प्राप्त की जा सके जिसे बाद में अमोनियम सल्फेट समाधान में पुनः हाइड्रेटेड किया जाता है जिसमें प्रोटीन को फंसाया जाता है और रात भर इनक्यूबेट किया जाता है। फिर, sonication और बाहर निकालना तकनीक नैनोसाइज़्ड unilamellar vesicles उत्पन्न करने के लिए लागू कर रहे हैं। नैनोवेसिकल्स के आकार और बहुपरिक्षेप सूचकांक गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन द्वारा निर्धारित होते हैं, जबकि नैनोवेस्कल आकारिकी का मूल्यांकन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैन करके किया जाता है। Entrapment दक्षता शुरू में भरी हुई प्रोटीन की मूल राशि के लिए unencapsulated प्रोटीन की मात्रा के अनुपात से निर्धारित होता है. होमोजीनियस लिपोसोम 0.168 के 155 एनएम और बहुपरिक्षेपिता सूचकांक मूल्य के औसत आकार के साथ प्राप्त किए जाते हैं। 83% की एक उच्च जाल क्षमता हासिल की है.

Introduction

हाल के वर्षों में कुशल दवा वितरण प्रणालियों की जांच करने वाले अध्ययनों की संख्या बढ़ी है। हालांकि, इस तरह के तेजी से निकासी के रूप में सीमाओं, गरीब biodistribution, और शारीरिक पीएच पर घुलनशीलता और अपर्याप्त सेलुलर तेज अभी भी पार करने की जरूरत है. नैनोसिस्टम्स का उपयोग कैंसर चिकित्सकीय में हाल ही में प्रगति के रूप में उभरा है, जबकि स्वस्थ कोशिकाओं में विषाक्तता को कम करते हुए कैंसर कोशिकाओं के अंदर दवाओं के intracellular एकाग्रता बढ़ाने के लिए लागू किया गया है। इसके अलावा, सामग्री की एक अलग रेंज से प्राप्त नैनोकणों (यानी, पॉलिमर, डेन्ड्रिमर, liposomes, वायरस, कार्बन नैनोट्यूब, और लौह ऑक्साइड और सोने के रूप में धातुओं) वर्तमान में कैंसर विरोधी प्रभाव को बढ़ाने और प्रणालीगत को कम करने के लिए लागू किया जा रहा है विषाक्तता1| विशेष रूप से Liposome नैनोकैप्स्यूल्स दवा, कॉस्मेटिक, और खाद्य उद्योगों में कई प्रयोजनों के लिए लागू किया गया है। हाल के वर्षों में, विटामिन, एंजाइम, और हर्बल निष्कर्षों जैसे विभिन्न न्यूरेस्यूट्यूटिकल उत्पादों liposome प्रौद्योगिकी2का उपयोग कर तैयार किया गया है।

लिपोसोम गोलाकार आशय होते हैं , जिसमें एक या अधिक संकेंद्री लिपिड द्विपरत होते हैं जो जलीय मीडिया3,4में फॉस्फोलिपिड के फैलाव से स्वत : निर्मित होते हैं . फॉस्फोलिपिड के ध्रुवीय शीर्ष झिल्ली की बाहरी और आंतरिक सतहों पर स्थित हैं, जलीय वातावरण के संपर्क में. इसके विपरीत, फैटी एसिड चेन झिल्ली के हाइड्रोफोबिक कोर का निर्माण करते हैं औरपानीसे 5 सुरक्षित होते हैं। liposomes के कुछ गुण है कि उन्हें आकर्षक दवा वितरण प्रणाली बनाने के अपने biocompatibility, biodegradability, गैर-प्रतिरक्षा, गैर विषैले, और दोनों हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक यौगिकों जाल करने की क्षमता शामिल6.

Liposomes इस तरह के आंदोलन, sonication, बाहर निकालना, lyophilization, ठंड, और thawing के रूप में विभिन्न प्रक्रियाओं चरणों का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है। शास्त्रीय तरीकों में रिवर्स वाष्पीकरण, विलायक इंजेक्शन, और डिटर्जेंट डायलिसिस शामिल हैं। सबसे अधिक अनुप्रयुक्त विधि पतली लिपिड फिल्म जलयोजन है, जिसे बंगम की विधि केरूप में भी जाना जाता है, जिसका उपयोग वेसिकुलर-लिपिड रूप 7,8,9,10,11प्राप्त करने के लिए किया जाता है। लैमेलेरिटी (फॉस्फोलिपिड बाइलेयर की संख्या) और कण आकार क्लासिकल पैरामीटर हैं जिनका उपयोग लिपोसोम की विशेषता के लिए किया जाता है 1) यूनिमेलर vesicles (ULVs), जो एक अद्वितीय फॉस्फोलिपिड द्वि परत द्वारा गठित किया जाता है और आकार में इस प्रकार अलग होता है: i) छोटे unilamellar vesicles (एसयूवी, $0.02-0.20 $m), ii) बड़े unilamellar vesicles (LUVs, $0.2-1.0 $m), और iii) विशाल unilamellar vesicles (GUVs, और gt;1 $m); या 2) बहुलैमेलर vesicles (MLVs, gt; 0.1 डिग्री मी)3,12. चिकित्सीय उपयोग के लिए विचार करते समय वेसिकल आकार एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है, जैसे कैंसर के उपचार में, जिसमें के आकार और 200 एनएम नैनोवेसिकल्स को एंडोथेलियल बाधा को पार करने और ट्यूमर ऊतकोंतकपहुंचने की अनुमति देने के लिए आदर्श होते हैं।

यहाँ, एक पतली लिपिड फिल्म तकनीक7 के शास्त्रीय जलयोजन के बाद encapsulation प्रक्रिया tarin का उपयोग कर वर्णित किया गया था, एक संयंत्र लैक्टिन एक हाइड्रोफिलिक गोलाकार प्रोटीन के रूप में विशेषता13,14,15 . Nanosized vesicles मुख्य तकनीक में sonication और बाहर निकालना कदम सहित द्वारा उत्पादित कर रहे हैं, उच्च जाल दक्षता16के साथ स्थिर liposomal नैनोवेसिकल्स में जिसके परिणामस्वरूप.

Protocol

1. टारिन लिपोसोमल नैनोकैप्स्यूल्स की तैयारी16

नोट: सभी तैयारी trilicate में तैयार किया जाना चाहिए ताकि एक बड़ी मात्रा प्राप्त करने के लिए (7 एमएल) और नमूना एक ultracentrifuge में centrifuged किया जा करने के लिए सक्षम (नीचे विवरण देखें).

  1. सारणी 1में दर्शाए गए विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करके लिपोसोम घटकों का वजन करें।
  2. क्लोरोफॉर्म में लिपिड घटकों को 250 एमएल volumetric फ्लास्क का उपयोग करके भंग करें जो सामग्री के नुकसान से बचने के लिए रोटरी वाष्पित्र में फिट बैठता है।
  3. 15 मिनट के लिए 150 आरपीएम पर मिश्रण हिलाओ.
  4. निम्नलिखित शर्तों के तहत एक रोटरी वाष्पित्र का उपयोग कर क्लोरोफॉर्म निकालें:
    1. हीटिंग स्नान से पानी के साथ संपर्क में है, जबकि इष्टतम दक्षता के लिए मानक स्थिति (25 डिग्री) के लिए volumetric फ्लास्क मुंह समायोजित करें।
      नोट: उपकरण हाथ मात्रा में फ्लास्क और पानी के स्नान के बीच संपर्क बनाए रखने के लिए 25 डिग्री पर झुका होना चाहिए, जबकि वाष्पीकरण दक्षता को प्रभावित नहीं या नमूना हानिकारक. मानक स्थिति उपकरण ब्रांड के अनुसार भिन्न हो सकते हैं.
    2. संघनित्र तापमान को न्यूनतम 3 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    3. हीटिंग बाथ तापमान को 40 डिग्री 1 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    4. 120 आरपीएम के लिए रोटेशन सेट करें।
    5. निर्वात को 207 मीटरबार और उबलते बिंदु को 20 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित करें।
    6. $ 25 मिनट के बाद, फ्लास्क को हटा दें और वाष्पित विलायक को छोड़ दें, जो उचित रूप से कंडेनसर में शेष है।
      नोट: एक पतली और अपारदर्शी फिल्म, liposome घटकों से मिलकर, इस कदम में गठन किया है और आसानी से कल्पना की जा सकती है. कंडेनसर में शेष वाष्पित विलायक को निपटान प्राप्तकर्ताओं (क्लोरिनेट) में संग्रहीत किया जाना चाहिए जिसे उचित डिस्कार्डिंग के लिए एक विशेष कंपनी द्वारा नियंत्रित किया जाना चाहिए।
  5. लिपिड फिल्म को 0ण्3 एम अमोनियम सल्फेट विलयन (पीएच जेड 7.4) में 0ण्01 एम लिपिड सांद्रता तक पहुंचने के लिए हाइड्रेट करें जिसमें 1 0 एमएल के अंतिम खंड में टारिन होता है।
    1. 40 मिनट के लिए मिश्रण हिलाओ और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
      नोट: यह चरण एक रोक बिंदु माना जा सकता है। रात भर ऊष्मायन अनिवार्य नहीं है।
  6. ऊष्मायन के बाद, 25 डिग्री सेल्सियस (कमरे के तापमान) पर 1 मिनट के लिए निलंबन sonicate; आर टी) vesicle आकार को कम करने और एकत्रीकरण से बचने के लिए.
    नोट: आकार में कमी निम्नलिखित स्थितियों के तहत एक अल्ट्रासोनिक sonicator में किया गया था: 130 डब्ल्यू और 40 kHz।
  7. एक 0.2 डिग्री पॉली कार्बोनेट छिद्र झिल्ली के माध्यम से एक 12 चक्र बाहर निकालना प्रदर्शन.
    नोट: बाहर निकालना प्रक्रिया से पहले, नमूना रिसाव से बचने के लिए पानी का उपयोग कर मिनी-एक्सट्रूडर विधानसभा का परीक्षण करें। एक 0.1 मीटर के छिद्र झिल्ली भी उपयुक्त है. इस मामले में, लिपिड संक्रमण तापमान के ऊपर मिनी-एक्सट्रूडर धारक को बाहर निकालना की सुविधा के लिए प्री-हीट करें, जबकि लिपिड और प्रोटीन दोनों की भौतिक विशेषताओं को बनाए रखें।
    1. निर्माता के मैनुअल में वर्णित के रूप में, मिनी extruder के कुछ हिस्सों फ़िट करें।
    2. दो पूर्व गीला फिल्टर का समर्थन करता है के बीच polycarbonate झिल्ली प्लेस और धारक में जगह है.
    3. डिवाइस में 1 एमएल खाली सिरिंज डालें, अन्य सिरिंज को लिपोसोमल निलंबन के साथ इसकी कुल मात्रा में भरें, और इसे विपरीत दिशा में डालें।
    4. एक 0.2 डिग्री पॉली कार्बोनेट छिद्र झिल्ली के माध्यम से एक 12 चक्र बाहर निकालना प्रदर्शन. एक सिरिंज से दूसरे करने के लिए नमूना पुश, धीरे धीरे. एक पूर्व ठंडा ट्यूब में extruded निलंबन ले लीजिए.
      नोट: पॉली कार्बोनेट झिल्ली को केवल तभी बदला जाना चाहिए जब एक सिरिंज से दूसरे में नमूना स्थानांतरण मुश्किल हो जाता है। एसयूवी के गठन के कारण आकार में कमी के परिणामस्वरूप बाहर निकालना प्रक्रिया के दौरान लिपोसोमल निलंबन स्पष्ट हो जाना चाहिए। नमूने के बारे में 0.2 एमएल इस चरण के दौरान खो सकते हैं।
  8. ultracentrifugation द्वारा अलग liposomes.
    नोट: एक बर्फ स्नान में नमूने बनाए रखने जब तक ultracentrifuge इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है. शेष घटकों से अलग एसयूवी और एक स्विंग-बकेट रोटर के साथ एक ultracentrifuge का उपयोग कर ultracentrifugation द्वारा अमोनियम सल्फेट (नीचे विवरण देखें).
    1. टाइटेनियम ट्यूब है कि रोटर फिट बैठता है और ट्यूब संतुलन में नमूना वजन. ट्यूबों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए इस्तेमाल किए गए रोटर के अनुसार आवश्यक न्यूनतम मात्रा की जांच करें, और यदि आवश्यक हो तो अमोनियम सल्फेट के साथ लिपोसोम निलंबन मात्रा को समायोजित करें।
      नोट: स्विंग बाल्टी हमेशा स्टैंड पर समर्थित किया जाना चाहिए जब सेंट्रीफ्यूज के बाहर "जेब्रा धारियों" खरोंच से बचने के लिए (यानी, तल पर काले और सफेद धारियों), जो अपकेंद्रित्र द्वारा उपयोग किया जाता है रोटेशन की गति निर्धारित करने के लिए.
    2. अपकेंद्रित्र का उपयोग करने से पहले वैक्यूम चालू करें ताकि इसे फ्रिज में रखने की अनुमति दी जा सके।
    3. स्विंग बाल्टी में टाइटेनियम ट्यूबों फिट.
      नोट: वे पूरी तरह से फिट कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए चल रहा है जब वे मान स्थिति के लिए ट्यूबों लिफ्ट.
    4. निर्वात को छोड़ें, अपकेंद्रित्र दरवाजा खोलें, और रोटर को अंदर रखें।
      नोट: रोटर के तल पर सर्कल मार्क पर ध्यान दें, जो एक ही सर्कल मार्क के विपरीत दिशा में खुद को अपकेंद्रण में फिट होना चाहिए।
    5. अपकेंद्रित्र दरवाजा बंद करें, वैक्यूम दबाएँ और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक वैक्यूम 200 से lt;20 माइक्रोन या 26 पा से lt;3 पा तक पहुंचता है।
    6. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज प्रदर्शन में पैरामीटर को 150,000 x g (ऊपर उल्लिखित स्विंग बकेट के लिए 29,600 आरपीएम के बराबर) को 4 डिग्री सेल्सियस (एक्सेलरेशन: अधिकतम, मंदी: अधिकतम) पर 90 मिनट के लिए समायोजित करें।
      नोट: विशिष्ट अपकेंद्रित्र आरपीएम में सेट किया गया है, तो हमेशा गति को x g करने के लिए परिवर्तित करें। इस्तेमाल किया रोटर के अनुसार इकाई परिवर्तित करने के लिए अपकेंद्रित्र वेबसाइट का उपयोग करें।
    7. याद दबाएँ, शर्तों की जाँच करें, और चलाने के लिए प्रारंभ करें दबाएँ।
      नोट: अपकेंद्रित्र वांछित गति तक पहुँच ता.
    8. 90 मिनट के बाद, वैक्यूम बटन दबाकर वैक्यूम जारी करें और सेंट्रीफ्यूज दरवाजा खोलें जब वैक्यूम 200-700 माइक्रोन (26-93 पा के बराबर) तक पहुंचता है।
    9. अपकेंद्रित्र बंद करें, अंदर से रोटर को हटा दें, और इसे सूखने के लिए बाल्टी के साथ बेंच पर छोड़ दें।
    10. बर्फ पर ultracentrifuged नमूने बनाए रखें.
  9. ध्यान से, सुपरनेंट और गोली को अलग करने के लिए ट्यूब को एक डिस्पोजेबल 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में उल्टा करके गोली से अलग करें।
    नोट: सुपरनेटेंट को 4 डिग्री सेल्सियस पर अनलीसेड प्रोटीन युक्त स्टोर करें। यह encapsulation दक्षता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. गोली एक पारदर्शी जेली के रूप में प्रकट होता है.
  10. HEPES बफर नमकीन में encapsulated प्रोटीन युक्त गोली निलंबित (3 एमएल 1x HBS के).
    नोट: HBS 2x (स्टॉक समाधान) आसुत पानी में अभिकर्मकों की निम्नलिखित मात्रा को कम करके तैयार किया जाता है: 140 एमएम NaCl, 1.5 m Na2HPO4, 50 mM HEPES, फिर पीएच को समायोजित करने के लिए 7.4 और अंतिम मात्रा 100 एमएल. Na2HPO4 NaHCO3द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है या हस्तक्षेप से बचने के लिए छोड़ दिया अगर liposome एकाग्रता निर्धारित किया जा करने के लिए है. HBS 2x स्टॉक समाधान उपयोग करने से पहले HBS 1x प्राप्त करने के लिए आसुत पानी में पतला किया जाना चाहिए.

2. Encapsulation दक्षता

नोट: प्रोटीन परिमाणीकरण में लिपिड हस्तक्षेप से बचने के लिए पीटरसन के प्रोटोकॉल17का उपयोग कर encapsulation दक्षता निर्धारित करते हैं। सभी नमूनों (BSA मानकों और liposome supernatant) trilicate में विश्लेषण किया जाना चाहिए. इसके अलावा एक खाली ट्यूब तैयार करते हैं।

  1. स्टॉक अभिकर्मकों और कार्य समाधानों की तैयारी17
    1. स्टॉक अभिकर्मकों के लिए, 20% सोडियम कार्बोनेट के 10 एमएल, 0.1% कॉपर सल्फेट के 200 $L, 0.2% पोटेशियम टार्टरेट के साथ 9.6 एमएल आसुत जल के साथ तांबे-टार्टेरेट कार्बोनेट (सीटीसी) तैयार करें। 10% सोडियम डोडिसिल सल्फेट (एसडीएस) और 0ण्8 एन सोडियम हाइड्रॉक्साइड (नाओएच) की 100 एमएल तैयार करें।
    2. कार्य समाधानों के लिए, 0.15% सोडियम डिऑक्सीकोलेट (डीओसी) और 72% ट्राइक्लोरोऐसीटिक एसिड (टीसीए) के 10 एमएल तैयार करें। एक मिलीग्राम/एमएल मानक समाधान प्राप्त करने के लिए आसुत जल के 10 एमएल में 10 मिलीग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) को भंग करें। सीटीसी, NaOH, एसडीएस, और एच2ओ के बराबर भागों को जोड़कर अभिकर्मक ए तैयार करें, फोलिन-सिओकैल्यू फीनॉल अभिकर्मक 1:5 को आसुत जल में कम करके एजेंट बी तैयार करें।
      नोट: अभिकर्मक ए प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए 1 एमएल की आवश्यकता है, जबकि अभिकर्मक बी 0.5 एमएल की आवश्यकता है। अभिकर्मकों ए और बी के अंतिम संस्करणों का निर्धारण करने के लिए, पहले इस्तेमाल किया जा करने के लिए प्रतिक्रिया ट्यूबों की संख्या को परिभाषित, बीएसए के तीन अलग सांद्रता पर विचार, रिक्त, और triplicate में नमूने. अभिकर्मक एक उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से homogenized होना चाहिए और 2 सप्ताह के लिए 25 डिग्री सेल्सियस (आरटी) पर संग्रहीत किया जा सकता है। अभिकर्मक बी भी 25 डिग्री सेल्सियस (आरटी) पर स्थिर है अगर एक एम्बर बोतल में संग्रहीत.
  2. वर्षण
    नोट: यह चरण microcentrifuge ट्यूबों में किया जाता है.
    1. 1 एमएल के अंतिम खंड में पानी के साथ लिपोसोम सुपरनेटेंट को पतला करें जिसमें 5-10 0 ग्राम प्रोटीन होता है।
      नोट: रिक्त ट्यूब आसुत पानी के 1 एमएल से भरा जाना चाहिए।
    2. 0.15% डॉक्टर का 0.1 एमएल जोड़ें, भंवर द्वारा homogenize, और आरटी में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. 72% टीसीए के 0.1 एमएल जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण, और 3,000 x ग्राम और 15 मिनट के लिए आर टी पर centrifuge.
      नोट: डॉक्टर-टीसीए प्रोटीन वर्षा को बढ़ावा देता है, दो अलग चरणों के गठन. लक्ष्य प्रोटीन centrifugation द्वारा बरामद किया जा सकता है, लिपिड हस्तक्षेप से बचने.
    4. ध्यान से ट्यूब नीचे की ओर verting और यह एक शोषक कागज पर बिछाने के द्वारा supernatant त्याग दें. बाद के कदम के लिए गोली सहेजें.
      नोट: गोली देखने के लिए बहुत मुश्किल हो सकता है, लेकिन ट्यूब उल्टा किया जाना चाहिए, भले ही यह दिखाई नहीं है.
  3. स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री
    1. आसुत जल के 1 एमएल में चरण 2.2.4 से प्राप्त गोली को निलंबित करें। अच्छी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करें कि गोली भंग कर दिया है और एक नया परीक्षण ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण करने के लिए।
    2. 1 एमएल के अंतिम खंड के लिए एल्बुमिन (BSA) मानकों के कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
      नोट: प्रोटीन मानकों के बीच तैयार किया जाना चाहिए 5-100 g/
    3. कदम 2.3.1 और 2.3.2 अपवाद से ट्यूबों के लिए अभिकर्मक ए के 1 एमएल जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण, और आर टी पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट.
      नोट: एसडीएस प्रोटीन solubilization में सहायता करते समय संभव लिपिड interferences को राहत देने कर सकते हैं.
    4. कदम 2.3.1 और 2.3.2 से ट्यूबों में अभिकर्मक बी के 0.5 एमएल जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण, और आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट जबकि प्रकाश से संरक्षित.
      नोट: Follin-Ciocalteu फीनॉल अभिकर्मक फॉस्फोमोलिब्डेट और फॉस्फोतुंगस्टेट का एक मिश्रण है जो कुछ नाइट्रोजन युक्त यौगिकों, जैसे प्रोटीन के रंगमितीय परख के लिए उपयोग किया जाता है। कॉपर complexation इस अभिकर्मक की ओर phenols की प्रतिक्रिया बढ़ जाती है, प्रोटीन एकाग्रता के अनुसार एक नीले /
    5. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 750 दउ पर अवशोषण निर्धारित करें।
    6. मानक वक्र के आधार पर सुपरनेट में प्रोटीन सांद्रता की गणना निम्नानुसार कीजिए।
      1. कोणीय गुणांक प्राप्त करने के लिए प्लॉट अवशोषण मान (एब्स) बनाम बीएसए सांद्रता (mg/mL)एक रैखिक प्रवृत्ति रेखा पर विचार करते हुए।
      2. अति-नाटिका प्रोटीन सांद्रता (ब्) अवशोषण मान तथा कोणीय गुणांक (k) के बीच के अनुपात द्वारा निर्धारित करें , फिर कुल आयतन से गुणा करें:
        Equation 1
  4. निम्न सूत्र के अनुसार encapsulation दक्षता निर्धारित करें:
    Equation 2
  5. जहाँ भारित प्रोटीन - 10 मिलीग्राम, गैर-संक्षिप् त प्रोटीन - चरण 2ण्3ण्6-2 में प्राप्त ब् का मान।
    नोट: इस मामले में, अमोनियम सल्फेट समाधान (1 मिलीग्राम/एमएल) में घुली कुल 10 मिलीग्राम टारिन का उपयोग एनकैप्सुलेशन प्रक्रिया को करने के लिए किया जाता है, क्योंकि यह एकाग्रता विट्रो प्रभावों में संतोषजनक प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है13,16, 18.

3. आकार और स्थिरता निर्धारण

नोट: liposomal तैयारी के आकार वितरण और polidispersity सूचकांक (पीडीआई) गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं। 0.1 के करीब एक पीडीआई एक सजातीय तैयारी इंगित करता है। स्थिरता निर्धारण के लिए, लिपोसोम को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें और नियमित रूप से आकार वितरण और आकार औसत की जांच करें।

  1. लेजर लैंप को गर्म करने के लिए उपयोग करने से पहले 30 मिनट डीएलएस उपकरण चालू करें।
  2. चरण 1.10 में प्राप्त liposomal तैयारी एक डिस्पोजेबल आकार cuvette करने के लिए स्थानांतरण.
  3. उपकरण पैरामीटर को निम्नानुसार सेट करें: परिक्षेपक प्रकार ] जल (आरआई ] 1.33); सामग्री [ लिपिड (आरआई ] 1.45); और आर टी.
  4. प्रेस प्रारंभ करें और प्रतीक्षा करें जब कि उपकरण अपनी पठन-पाठन पूरी कर लिए हैं.
  5. cuvette निकालें और उपकरण बंद कर देते हैं.
    नोट: या तो बाद के विश्लेषण के लिए डिस्पोजेबल 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए वापस cuvette से नमूना हस्तांतरण, या इसे छोड़ अगर वहाँ नए पढ़ता के लिए पर्याप्त राशि है.

4. Morphological लक्षणीकरण

नोट: Liposome विशेषता Murtey और रामसामी19के अनुसार किया जाता है. चरण 1.10 में प्राप्त नैनोलिपोसोम युक्त नमूने त्रिफला में तैयार किए जाते हैं।

  1. दो तरफा टेप के साथ एक पेट्री डिश के नीचे में ग्लास coverslips (13 मिमी व्यास) को ठीक करें। छोटे टुकड़ों में टेप कट (उपयुक्त आकार coverss को ठीक करने के लिए), नीचे सुरक्षात्मक कागज को हटाने, और पेट्री डिश के तल पर इसे ठीक. चिमटी की सहायता के साथ, टेप के शीर्ष पर सुरक्षात्मक कागज को हटाने और उस पर coverss ठीक.
    नोट: coverslips जारी नहीं करने के लिए निम्न चरणों में सावधान रहें, और एक मजबूत टेप का उपयोग करें।
  2. पॉली-एल-लाइसिन के साथ कवरलिप्स को कोट करें। आरटी (25 डिग्री सेल्सियस) में 1 एच के लिए नमी और इनक्यूबेट बनाए रखने के लिए पेट्री डिश के अंदर गीले फिल्टर पेपर रखें।
  3. कोटिंग के बाद, आसुत पानी के साथ कवरलिप कुल्ला.
  4. चरण 1.10 से नमूने की एक बूंद के साथ कवरलिप भरें और उन्हें आरटी में 1 एच के लिए सूखने की अनुमति दें।
  5. नमूनों को ठीक करने के लिए, उन्हें 0.1 एम फॉस्फेट बफर, पीएच - 7.2 में तैयार 4% ग्लूटाराल्डहाइड के साथ कवर करें। पेट्री डिश के अंदर गीला फिल्टर पेपर रखें और नमी के स्तर को बनाए रखने के लिए पकवान को सील करें। 48 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  6. एक ही फॉस्फेट बफर के साथ 5 मिनट के लिए coverss 3x कुल्ला.
  7. निर्जलित नमूने इस प्रकार हैं: 15 मिनट के लिए 35% इथेनॉल 1x, 15 मिनट के लिए 50% इथेनॉल 1x, 15 मिनट के लिए 75% इथेनॉल 1x, 15 मिनट के लिए 95% इथेनॉल 2x, और 20 मिनट के लिए निरपेक्ष इथेनॉल 3x.
  8. रासायनिक रूप से 10 मिनट के लिए हेक्सामेथिलडिस्लाज़ेन (एचएमडीएस) के 1 डिग्री 2 एमएल में विसर्जन 2x द्वारा नमूनों को सुखाने।
    नोट: HMDS ध्यान से एक धूआं हुड के अंदर हेरफेर किया जाना चाहिए. नमूने एक desiccator के अंदर या आरटी में धूआं हुड के अंदर रात भर सुखाने के लिए अनुमति दी जानी चाहिए.
  9. एक कार्बन प्रवाहकीय चिपकने वाला टेप के साथ एक स्टब पर सूखे नमूनों माउंट.
  10. सोने-पैलेडियम की एक विद्युत प्रवाहकीय परत (20 एनएम मोटाई) के साथ एक निर्वात में कवरस्लिप की सतह को उछालें।
  11. कम वैक्यूम मोड और कम वोल्टेज (20 केवी) पर स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) के साथ रिकॉर्ड छवियों।

Representative Results

चित्र 1 में नानोलिपोसोम तैयारी16,20,21का वर्णन किया गया है . फॉस्फोलिपिड्स, 1,2-डायलियोल-स्न-ग्लिसरॉल-3-फॉस्फोएथेनोलेमिन (डीओपीई), 1,2-डिस्टेरॉयल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोएनोथेनोलेमिन-एन-एमिनो (पॉलीएथिलीन ग्लाइकोल)-2000] (एमोनियम नमक; DSPE-MPEG 2000), और cholesterylhemisuccinate (CHEMS), मुख्य liposome घटकों, पहले क्लोरोफॉर्म में भंग करने के लिए लिपिड फिल्म प्राप्त कर रहे थे. लिपिड फिल्म तो अमोनियम सल्फेट समाधान में rehydrated किया गया था हाइड्रोफिलिक प्रोटीन युक्त (टारिन) को फँसाया जा करने के लिए, और ऊष्मायन रात भर किया गया था. फिर, sonication और बाहर निकालना तकनीक छोटे unilamellar vesicles उत्पन्न करने के लिए लागू किया गया. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन कदम ने लिपोसोमल तैयारी को मुक्त लिपिड और अनलिमिटेड प्रोटीन से अलग कर दिया, जबकि सुपरनेटेंट का उपयोग जाल दक्षता के निर्धारण के लिए किया गया था।

उपर्युक्त पद्धति का उपयोग करते हुए उत्पादित नानोलिपोसोममें 51-396 दउ तथा 155 दउ (सारणी2)के औसत आकार का वितरण प्रदर्शित किया गया है। तैयारी सजातीय था, क्योंकि पॉलीdispersity सूचकांक 0.168 था. यदि लिपोसोम 0ण्2 मीटर छिद्र आकार की झिल्ली (सारणी2) के माध्यम से लिपोसोम ों को बाहर निकाल दिया जाए तो 83% की उच्च जाल क्षमता तक पहुंचा जा सकता है।

Morphological nanoliposome विशेषताओं SEM द्वारा मूल्यांकन किया गया. चित्र 2A,B 121 एनएम की सीमा में गोल आकार के liposomal vesicles प्रदर्शित करता है और 20 केवी पर विश्लेषण किया, जबकि चित्र 2सी, डी अपर्याप्त रूप से तैयार प्रदर्शित करता है नमूने. Nanoliposomes बस पिछले निर्धारण या किसी अन्य उपचार इस अध्ययन में वर्णित बिना सूख हवा थे. परिणामस्वरूप, 332 डिग्री मीटर की सीमा में बड़े और क्षतिग्रस्त vesicles और 5 केवी पर विश्लेषण देखा गया.

Figure 1
चित्र 1: नानोलिपोसोम तैयारी का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। डोप, खूंटी, और CHEMS, मुख्य liposome घटक, पहले क्लोरोफॉर्म में भंग करने के लिए लिपिड फिल्म प्राप्त करने के लिए (1, 2,3). लिपिड फिल्म तो हाइड्रोफिलिक प्रोटीन युक्त एक नमकीन बफर में rehydrated किया गया था (टारिन) को फँसाया जा करने के लिए, और ऊष्मायन रात भर प्रदर्शन किया गया (4). फिर, sonication और बाहर निकालना तकनीक एसयूवी उत्पन्न करने के लिए लागू किया गया (5, 6). अतिकेंद्रीकरण कदम ने लिपोसोमल तैयारी को मुक्त लिपिड और अनलीप्ड प्रोटीन से अलग कर दिया, जबकि सुपरनेटेंट का उपयोग जालन दक्षता (7) के निर्धारण के लिए किया गया था। यह आंकड़ा Correa एट अल से संशोधित किया गया है16. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: SEM द्वारा Nanoliposome photomicroscopy. (ए, बी) 121 एनएम की रेंज में गोल आकार के लिपोसोमल vesicles की छवियाँ और 20 केवी पर विश्लेषण किया। (सी, डी) अपर्याप्त रूप से तैयार नमूनों की छवियाँ। बड़े और/या क्षतिग्रस्त vesicles के अवलोकन के लिए अनुमति दी दुर्व्यवहार नमूने, जो वैक्यूम और / यह आंकड़ा Correa एट अल से संशोधित किया गया है16. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वसाकाय घटक वजन (छ) एकाग्रता (एमएम) अंतिम मात्रा
डोप 0.0420 5.7 10 एमएल
MPEG 2000-डीएसपीई 0.1059 3.8
CHEMS 0.0024 0.5

डोप - 1,2-डायलोइल-एसएन-ग्लिसरोल-3-फॉस्फोएथेनोलैमिन; MPEG 2000-DSPE - 1,2-distearoyl-sn-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोएथेनोलमाइन-एन- [एमिनो (पॉलीथीन ग्लाइकोल)-2000] (अमोनियम नमक); CHEMS - कोलेस्टेरिलहेसिकेनेट।

तालिका 1: टारिन लिपोसोमल नैनोकैप्स्यूल्स की तैयारी।

झिल्ली के छिद्र आकार ($m) आकार वितरण (एनएम) औसत आकार (एनएम) पॉलीडिसिdispersity सूचकांक (पीडीआई) पीक (एनएम) जालनों की क्षमता
0.2 51 - 396 155 0. 168 94 ] 39 0.83

आकार और बहुपरिक्षेप सूचकांक गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन द्वारा मूल्यांकन किया गया था, जबकि encapsulation दक्षता पीटरसन17के अनुसार निर्धारित किया गया था.

तालिका 2: आकार, polidispersity सूचकांक, और nanoliposome तैयारी के जाल दक्षता.

Discussion

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का परीक्षण कोरिया एट अल 16 द्वारा किया गया था ताकि एक इम्यूनोमॉड्यूलेटरी और एटिट्यूमोरल लेक्टिन को कोलोकेसिया एस्कुलेंटा22से शुद्ध किया जा सके . पद्धति सफल परिणाम मिले, चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त आकार के स्थिर nanoliposomes के उत्पादन के लिए अनुमति देता है. निर्माण शारीरिक स्थितियों के तहत विभिन्न पीएच स्तरों पर नियंत्रित रिलीज प्रस्तुत करता है। यह भी इस तरह के मानव ग्लियोब्लास्टोमा U-87 एमजी और स्तन कैंसर एमडीए-एमबी-231 सेल लाइनों और चूहों अस्थि मज्जा कोशिकाओं की उत्तेजना के निषेध के रूप में टारिन औषधीय गुणों, potentiates। लिपोसोमल तैयारी स्वस्थ चूहों कोशिकाओं16में कोई विषाक्त प्रभाव का प्रदर्शन किया .

शास्त्रीय विधि, पहले Bangham एटअल द्वारा वर्णित 7, बड़े multilamellar liposome vesicles के उत्पादन के लिए अनुमति देता है, आकार और आकार में विषम. इस विधि के अनुकूलन, के रूप में वर्तमान अध्ययन में बताया, सफलतापूर्वक इस तरह के एक 0.2 डिग्री पॉली कार्बोनेट झिल्ली के माध्यम से sonication और बाहर निकालना के रूप में अतिरिक्त कदम शामिल करके लागू कर रहे हैं. इससे नैनोमीटर रेंज16,23,24में आकार के संबंध में अधिक सजातीय फैलाव का उत्पादन हो जाता है . इसलिए, सफल परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, encapsulation प्रोटोकॉल और liposomal तैयार यहाँ वर्णित सख्ती से पालन किया जाना चाहिए.

नानोलिपोसम संरचना सावधानी से DOPE के साथ एक bilayer झिल्ली के गठन को सुनिश्चित करने के लिए चुना गया था, MPEG 2000-DSPE, और मुख्य घटक के रूप में CHEMS. ये प्राकृतिक पशु झिल्ली द्वि परत घटक हैं और बाद nanoliposome वास्तुकला के लिए तरलता प्रदान कर सकते हैं, मनुष्य में bioactive यौगिक वितरण के लिए व्यापक आवेदन सुनिश्चित करने.

नानोलिपोसम पेगिलेशन लिपोसोम संरचना स्थिरता की गारंटी के लिए आवश्यक है। खूंटी की अनुपस्थिति आकार वृद्धि की ओर जाता है, एक उच्च polydispersity सूचकांक, और कम entrapment दक्षता. इष्टतम परिणाम मुख्य liposome घटक के रूप में DOPE के साथ प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, यह एक उच्च लागत फॉस्फोलिपिड है। नानोलिपोसोम उत्पादन की वित्तीय लागत DOPC (1,2-dioleoyl-sn-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोकोलीन) जैसे अन्य समान लिपिड के साथ DOPE की जगह द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। CHEMS एक कोलेस्ट्रॉल अणु स्वाभाविक रूप से पशु कोशिका झिल्ली में पाया जाता है, जो तैयार करने सेबाहर नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि यह लिपिड bilayer तरलता और आघात 16 सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है.

encapsulation प्रोटोकॉल के अन्य पहलुओं को भी अनुकूलित किया जा सकता है. लिपोसोमल घटकों को भंग करने के लिए उपयोग किया जाने वाला क्लोरोफॉर्म आसानी से आकार औसत, एकरूपता, और जाल दक्षता पर कोई प्रभाव के साथ मेथनॉल द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। तथापि, 4 डिग्री सेल्सियस16के अंतर्गत भंडारण पर कुछ प्रोटीन रिसाव हो सकता है। टारिन युक्त अमोनियम सल्फेट समाधान के साथ रात भर ऊष्मायन कदम अनिवार्य नहीं है; हालांकि, सुविधा के लिए यह nanoliposomal जैव भौतिक विशेषताओं, encapsulation, या स्थिरता दक्षता नुकसान के लिए कोई नुकसान के साथ किया जा सकता है, के रूप में Correa एट अल द्वारा प्रदर्शन16. बाहर निकालना कदम कमरे के तापमान पर किया जाता है, जो सिरिंजों के बीच प्रवाह दर कम कर सकते हैं अगर एक 0.1 मीटर pores आकार झिल्ली का उपयोग किया जाता है.

इस मुद्दे को दूर करने के लिए, एक 0.2 मीटर के छिद्र आकार झिल्ली या लिपिड संक्रमण तापमान के ऊपर extruder धारक के हीटिंग का उपयोग पर विचार किया जाना चाहिए. विश्लेषक लिपिड या प्रोटीन है कि निष्क्रिय किया जा सकता है और जैविक गतिविधि खो नुकसान नहीं सावधान रहना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, liposomal तैयारी अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन के बजाय HBS के खिलाफ dilyzed किया जा सकता है, प्रोटीन आणविक वजन के अनुसार एक कट-ऑफ झिल्ली का उपयोग कर. बफर की रासायनिक प्रकृति का चुनाव जिसमें अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन के बाद नैनोलिपोसोम निलंबित कर दिए जाते हैं, इसका सीधा संबंध इसके बाद के अनुप्रयोग से होता है। चूंकि इस अध्ययन के दृष्टिकोण में विवो और इन विट्रो परख में शामिल हैं, HEPES बफर ्ड लवण में निलंबन कोई साइटोटॉक्सिक प्रभाव और शारीरिक स्थितियों के करीब एक पीएच रेंज सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त था।

Liposomes पतले इलाज किया जाना चाहिए, जीवित कोशिकाओं के समान, उच्च गुणवत्ता SEM छवियों को प्राप्त करने के लिए. फिक्सेशन और सुखाने की प्रक्रिया शून्य परिस्थितियों के तहत 20 केवी से अधिक मूल्यों का समर्थन है कि छोटे बरकरार vesicles के दृश्य सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। चित्र 2 ए, बी बाहर निकालना प्रक्रिया के साथ संगत नैनोसाइज़्ड vesicles प्रदर्शित करता है। 51-396 एनएम से लेकर vesicles का दृश्य संभव है अगर इस प्रक्रिया के बाद पर्याप्त नमूना तैयारी की जाती है। कदम निर्धारण शामिल हैं, इथेनॉल सांद्रता बढ़ाने के द्वारा सुखाने, और रासायनिक निर्जलीकरण समुच्चय और टूट vesicles वैक्यूम और इलेक्ट्रॉन बीम की वजह से के गठन से बचने के लिए. दूसरी ओर, चित्र 2सी,डी कमरे के तापमान के नीचे सूख liposome vesicles से पता चलता है और किसी भी उपचार के अधीन नहीं यहाँ वर्णित है, जिसका अर्थ है कि वे अपर्याप्त तैयार किए गए थे. अपर्याप्त प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में, विशाल vesicles का गठन कर रहे हैं, यहां तक कि एक 0.2 डिग्री मीटर pores आकार झिल्ली के माध्यम से बाहर निकालना के बाद. वैक्यूम और इलेक्ट्रॉन बीम क्षति के परिणामस्वरूप दोनों पैनलों में रूपित vesicles भी पाए जाते हैं।

नानोलिपोसम vesicles एक encapsulation और hydrophobic अणुओं के लिए वितरण प्रणाली के रूप में पता लगाया गया है, resveratrol सहित (3,5,4'-trihydroxystilbene), कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ एक bioactive यौगिक. encapsulation प्रक्रिया lipophilic यौगिकों की गरीब घुलनशीलता को दूर कर सकते हैं biocompatibility प्रदान करने के अलावा, biodegradability, गैर-प्रतिरक्षा, और गैर विषैले विशेषताओं liposome नैनोकैप्स्यूल्स25के लिए निहित . प्रोटोकॉल अनुकूलन ों को प्रशासन मार्ग और उद्देश्य के आधार पर ध्यान में रखा जाना चाहिए, जैसे मौखिक प्रशासन के लिए नए लिपोसोम योगों का विकास।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों COPPE/UFRJ, इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी प्रयोगशाला, और Multiuser सामग्री विशेषता प्रयोगशाला सुविधाओं के आभारी हैं; डॉ Adalberto Vieyra, डॉ जेनिफर लोव, और राफेल Lindoso, Universidade संघीय में प्रोफेसरों रियो डी जनेरियो, UFRJ, ब्राजील, ultracentrifuge के उपयोग के लिए; डॉ Alexandre Guedes Torres और डैनियल Perrone, Universidade संघीय रियो डी जनेरियो, UFRJ, ब्राजील में प्रोफेसरों, रोटरी वाष्पित्र के उपयोग के लिए; प्रोफेसर रोलाण्ड Bodmeier और बर्लिन में Freie Universitt से डॉ Andriy Dashevskiy, जो संसाधनों के साथ मदद की, नए तरीके प्रदान की है, और जर्मनी में एक 6 महीने इरास्मस + फैलोशिप के दौरान ACNTF निरीक्षण; जेटाइजर मालवेर्न के उपयोग के लिए Universidade संघीय क्या रियो डी जनेरियो, UFRJ, ब्राजील में प्रोफेसर और तकनीशियन डॉ Rossana Thir$ और Aline फर्नांडीस के लिए; Sem के उपयोग के लिए Bluma Guenther और Taissa Rodrigues, Universidade संघीय रियो डी जनेरियो, UFRJ, ब्राजील में प्रोफेसर और तकनीशियन के लिए; डॉ राहेल एन Hauser डेविस, Fundao Oswaldo Cruz में शोधकर्ता, कथन के लिए. इस अध्ययन के भाग में Coordenazo de Aperfei-oamento de Pessoal de N$vel सुपीरियर, ब्राजील (CAPES) द्वारा वित्त पोषण किया गया था - वित्त कोड 001 (अनुदान संख्या 1627392; 1811605); द्वारा फंडाओ कार्लोस Chagas Filho de Amparo ] PesQuisa करते हैं Estado रियो डी जनेरियो (FAPERJ) (ग्रेंट नं. ई-26/202.815/2018; ई-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 और ई-26/ Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient]fico e Tecnol]gico (CNPQ) (अनुदान संख्या 406601/2018-6), और Financiadora de Estudos e Prozetos (FINEP) द्वारा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich Co A4418
Analitycal Ballance Mettler H10Tw Mettler Inc. 417870
Beckman DU-640 Spectrophotometer Beckman Coulter 8043-30-1090
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich Co 5470
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump Thermo Fischer Scientific 05-001-022PM
CHEMS (cholesterylhemisuccinate) Sigma-Aldrich Co C6512
Chloroform Sigma-Aldrich Co 48520-U CAUTION
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) Sigma-Aldrich Co 209198
Coverslips (13mm diameter) Thermo Scientific Nunc EW-01839-00
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) Lipoid GMBH 565600.1
Ethanol Absolute Sigma-Aldrich Co 32205
Folin -Ciocalteu phenol reagent Sigma-Aldrich Co F9252
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich Co G5882
HEPES Sigma-Aldrich Co H3375
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich Co 440191 CAUTION
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope JEOL LTD
Mini Extruder 7 Avanti Polar Lipids 610000
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) Lipoid GMBH 588200.1
Optima L-90k Ultracentrifuge Beckman Coulter PN LL-IM-12AB
Phosphate Buffer Sigma-Aldrich Co P3619
Poli-L-lysine Sigma-Aldrich Co P8920
Potassium L-tartrate monobasic Sigma-Aldrich Co 243531
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich Co S7795
Sodium chloride Sigma-Aldrich Co S7653
Sodium Deoxycholate (DOC) Sigma-Aldrich Co D6750
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich Co L3771
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich Co S8045
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich Co RES20908-A7
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope Tescan #657874
Trichloroacetic Acid (TCA) Sigma-Aldrich Co 91230
Zetasizer Nano ZSP Malvern Panalytical LTD
Ultrasonic cleaning bath model 2510 Branson

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Corrêa, A. C. N. T. F., Pereira, P. R., Paschoalin, V. M. F. Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins. J. Vis. Exp. (150), e59900, doi:10.3791/59900 (2019).

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