Summary
Denna studie beskriver klassisk hydrering med hjälp av tunn lipid film metod för nanoliposome beredning följt av nanopartiklar karakterisering. En 47 kDa-hydrofila och klotformig protein, Tarin, är framgångsrikt inkapslad som en strategi för att förbättra stabiliteten, undvika snabb clearance, och främja kontrollerad frisättning. Metoden kan anpassas till hydrofoba molekyler inkapsling.
Abstract
Liposom nanocapsules har tillämpats för många ändamål inom läkemedels-, kosmetik-och livsmedelsindustrin. Attribut av liposomer inkluderar deras biokompatibilitet, biologisk nedbrytbarhet, icke-immunogenicitet, icke-toxicitet, och förmåga att snärja både hydrofila och hydrofoba föreningar. Den klassiska hydratiseringen av tunna lipidfilmer i ett organiskt lösningsmedel appliceras häri som en teknik för att kapsla in Tarin, en växtlectin, i nanoliposomes. Nanoliposome storlek, stabilitet, Entrapment effektivitet, och morfologisk karakterisering beskrivs i detalj. De nanoliposomes bereds med 1,2-dioleoyl-SN-glycerol-3-fosfoetanolamin (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[Amino (polyetylenglykol)-2000] (ammoniumsalt; DSPE-MPEG 2000) och cholesterylhemisuccinat (CHEMS) som huvudbeståndsdelar. Lipider löses först i kloroform för att få en tunn lipidfilm som därefter återhydreras i ammoniumsulfatlösning som innehåller det protein som skall snärtas och inkuberas över natten. Sedan, ultraljudsbehandling och extrudering tekniker tillämpas för att generera nanosized små blåsor. Nanovesikelets storlek och polydispertion index bestäms av dynamisk ljusspridning, medan nanovesikler morfologi bedöms genom scanning elektronmikroskopi. Entrapment effektivitet bestäms av förhållandet mellan mängden oinkapslade protein till ursprungliga mängden initialt laddade protein. Homogena liposomer erhålls med en genomsnittlig storlek på 155 nm och polydispersitet indexvärdet 0,168. En hög Entrapment effektivitet på 83% uppnås.
Introduction
Antalet studier som undersöker effektiva system för läkemedelsleverans har stigit under de senaste åren. Men, begränsningar såsom snabb clearance, dålig biodistribution, och löslighet vid Fysiologiskt pH och otillräckligt cellulära upptag behöver fortfarande överträffas. Användningen av nanosystem har vuxit fram som de senaste framstegen i cancer Therapeutics, tillämpas för att öka den intracellulära koncentrationen av läkemedel inuti cancerceller samtidigt minimera toxicitet i friska celler. Nanopartiklar som erhålls från olika material (t. ex. polymerer, dendrimerer, liposomer, virus, kolnanorör och metaller som järnoxid och guld) används för närvarande för att förbättra anticancereffekter och minska systemisk toxicitet1. Liposome nanocapsules i synnerhet har tillämpats för många ändamål inom läkemedels-, kosmetik-och livsmedelsindustrin. Under de senaste åren, olika nutraceutical produkter såsom vitaminer, enzymer, och örtextrakt har formulerats med hjälp av Liposom teknik2.
Liposomer är sfäriska blåsor som består av en eller flera koncentriska lipidbilayers spontant bildas genom spridning av fosfolipider i vattenhaltiga medier3,4. De polära huvuden av fosfolipider är placerade på de yttre och inre ytorna av membranen, i kontakt med vattenmiljön. Fettsyra kedjor bildar däremot den hydrofoba kärnan i membranen och skyddas från vatten5. Vissa attribut av liposomer som gör dem attraktiva läkemedel leveranssystem inkluderar deras biokompatibilitet, biologisk nedbrytbarhet, icke-immunogenicitet, icke-toxicitet, och förmåga att snärja både hydrofila och hydrofoba föreningar6.
Liposomer kan förberedas med hjälp av olika processer steg såsom agitation, ultraljudsbehandling, extrudering, frystorkat, frysning, och upptinning. Klassiska metoder inkluderar omvänd fas avdunstning, lösningsmedels injektion, och tvättmedel dialys. Den mest tillämpade metoden är tunn lipid film hydrering, även känd som bangham metod, som används för att få vesikulär-lipid former7,8,9,10,11. Lamellaritet (antalet fosfolipidbilayers) och partikelstorlek är klassiska parametrar som används för att karakterisera liposomer som antingen 1) små blåsor (Ulvs), som bildas av en unik fosfolipid lipidens och varierande i storlek enligt följande: i) små små blåsor (stadsjeepar, ~ 0,02-0,20 μm), II) stora små blåsor (luvs, ~ 0,2-1,0 μm), och III) Giant små blåsor (guvs, > 1 μm); eller 2) multilamellärt blåsor (MLVs, > 0,1 μm)3,12. Vesikler storlek är en viktig parameter när man överväger för terapeutisk användning, såsom i cancerbehandling, i vilka storlekar av < 200 Nm är idealiska för att tillåta nanovesikler att korsa endotelbarriären och nå tumoral vävnader4.
Häri, inkapsling förfarande efter den klassiska hydrering av en tunn lipid film teknik7 beskrevs med hjälp av Tarin, en växt lektin kännetecknas som ett hydrofila globulära protein13,14,15 . Nanosized blåsor produceras genom att inkludera ultraljudsbehandling och extrudering steg i huvud tekniken, vilket resulterar i stabila liposomala nanovesicles med hög Entrapment effektivitet16.
Protocol
1. beredning av Tarin liposomalt nanocapsules16
Anmärkning: alla preparat skall beredas i tre exemplar för att erhålla en större volym (7 ml) och möjliggöra centrifugeringen av provet i en första (se närmare detaljer nedan).
- Väg de Liposom komponenterna med hjälp av en analytisk balans, som visas i tabell 1.
- Lös upp lipidkomponenterna i kloroform med en 250 mL mätkolv som passar i en roterande indunstare för att undvika förlust av material.
- Rör blandningen vid 150 rpm i 15 min.
- Ta bort kloroformen med en roterande indunstare under följande betingelser:
- Justera den volymetriska kolven till standardpositionen (25 °) för optimal effektivitet, medan du är i kontakt med vattnet från värme badet.
Anmärkning: utrustnings armen bör lutas vid 25 ° för att bibehålla kontakten mellan mätkolv och vattenbad, samtidigt som den inte påverkar avdunstnings effektiviteten eller skadar provet. Standardpositionen kan variera beroende på utrustnings märket. - Ställ in kondensorns temperatur till minst 3 ° c.
- Ställ in värme badtemperaturen på 40 ± 1 ° c.
- Ställ in rotationen till 120 RPM.
- Justera dammsugaren till 207 mbar och kokpunkt till 20 ° c.
- Efter ~ 25 min, ta bort kolven och kassera avdunsta lösningsmedel, kvar i kondensorn, på lämpligt sätt.
Obs: en tunn och ogenomskinlig film, bestående av Liposom komponenterna, bildas i detta steg och kan enkelt visualiseras. Det avdunsta lösningsmedlet som återstår i kondensorn skall förvaras i avfallsmottagare (klorerade) som skall hanteras av ett specialiserat företag för lämplig kassering.
- Justera den volymetriska kolven till standardpositionen (25 °) för optimal effektivitet, medan du är i kontakt med vattnet från värme badet.
- Återfukta lipidfilmen för att nå en 0,01 M lipidkoncentration i 0,3 M ammoniumsulfatlösning (pH = 7,4) som innehåller Tarin vid 1 mg/mL till en slutlig volym på 10 mL.
- Rör blandningen i 40 min och inkubera över natten vid 4 ° c.
Obs: detta steg kan betraktas som en stopp punkt. Övernattning inkubering är inte obligatoriskt.
- Rör blandningen i 40 min och inkubera över natten vid 4 ° c.
- Efter inkubering, Sonikera suspensionen för 1 min vid 25 ° c (rumstemperatur; RT) för att minska vesikelstorlek och undvika aggregering.
Obs: storleksminskning utfördes i en ultraljudsonikator under följande förhållanden: 130 W och 40 kHz. - Utför en 12-Cycle extrudering genom ett 0,2 μm polykarbonat pore membran.
Obs: innan extrudering processen, testa mini-extruder församling med vatten för att undvika prov läckage. Ett pore-membran på 0,1 μm är också lämpligt. I detta fall, pre-Heat mini-extruder innehavaren ovanför lipidövergångstemperaturen för att underlätta extrudering, samtidigt som de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos både lipider och proteiner.- Montera de delar av miniextrudern som beskrivs i tillverkarens bruksanvisning.
- Placera polykarbonatmembranet mellan två pre-Wet filter stöd och placera den i hållaren.
- Sätt i en 1 mL tom spruta i enheten, fyll den andra sprutan till sin totala volym med den liposomala suspensionen och sätt in den på motsatt sida.
- Utför en 12-Cycle extrudering genom ett 0,2 μm polykarbonat pore membran. Skjut provet från en spruta till en annan, långsamt. Samla upp den extruderade fjädringen i ett förkylt rör.
Obs: polykarbonatmembranet bör bytas ut endast när provöverföring från en spruta till en annan blir svårt. Den liposomala suspensionen bör bli klar under extrudering processen som en följd av storleksminskning på grund av bildandet av stadsjeepar. Om 0,2 mL av provet kan förloras under detta steg.
- Separata liposomer genom ultracentrifugation.
Obs: Behåll proverna i ett isbad tills första är redo att användas. Separera stadsjeepar från kvarvarande komponenter och ammoniumsulfat genom ultracentrifugering med en första med en sväng skopa rotor (se detaljer nedan).- Vägprovet i Titan röret som passar rotorn och balansera rören. Kontrollera den lägsta volym som krävs enligt rotor som används för att undvika att skada rören, och justera liposomalt suspension volym med ammoniumsulfat, om det behövs.
Obs: sväng skopan ska alltid stödjas i stativet när den är utanför centrifugen för att undvika att repa "Zebra ränder" (d.v.s. svarta och vita ränder på botten), som används av centrifugen för att bestämma rotationshastighet. - Slå på dammsugaren innan du använder centrifugen så att den kan förvaras i kylskåp.
- Montera Titan rören i sving skopan.
Obs: lyft rören till den position de antar vid löpning för att säkerställa att de är perfekt monterade. - Frigör vakuum, öppna centrifug luckan och placera rotorn inuti.
Obs: var uppmärksam på cirkeln märket på botten av rotorn, som måste passa i motsatt riktning av samma cirkel märket i centrifugen själv. - Stäng centrifugerluckan, tryck på vakuum och vänta tills dammsugaren når från 200 till < 20 mikrometer eller från 26 pa till < 3 pa.
- Justera parametrarna i första-displayen till 150 000 x g (motsvarande 29 600 RPM för den ovan nämnda Swing skopan) för 90 min vid 4 ° c (acceleration: Max, retardation: Max).
Obs: konvertera alltid hastigheten till x g om den specifika centrifugen ställs in i RPM. Använd centrifug-webbplatsen för att konvertera enheten enligt den rotor som används. - Tryck på Recall, kontrollera villkoren och tryck på Start för att köra.
Obs: vänta tills centrifugen når önskad hastighet. - Efter 90 min, frigör vakuum genom att trycka på vakuum knappen och öppna Centrifugera dörren när dammsugaren når 200-700 mikrometer (motsvarande 26-93 PA).
- Stäng av centrifugen, ta bort rotorn från insidan, och lämna den på bänken med Skoporna för att torka.
- Behåll de ultracentrifuged proverna på is.
- Vägprovet i Titan röret som passar rotorn och balansera rören. Kontrollera den lägsta volym som krävs enligt rotor som används för att undvika att skada rören, och justera liposomalt suspension volym med ammoniumsulfat, om det behövs.
- Noggrant, separat supernatanten från pelleten genom att vrida röret upp och ner i en disponibel 15 mL centrifug röret att separera supernatanten och pelleten.
Obs: Förvara supernatanten som innehåller det oinkapslade proteinet vid 4 ° c. Den kommer att användas för att bestämma inkapslingen effektivitet. Pelleten visas som en genomskinlig gelé. - Suspendera pelleten som innehåller det inkapslade proteinet i HEPES buffrad saltlösning (3 mL 1x HBS).
Anmärkning: HBS 2x (stamlösning) bereds genom utspädning av följande mängder reagenser i destillerat vatten: 140 mM NaCl, 1,5 mM na2HPO4, 50 mm Hepes, sedan justera pH till 7,4 och slutlig volym till 100 ml. Na2HPO4 kan ersättas med NaHCO3eller utelämnas för att undvika störningar om Liposom koncentration skall bestämmas. HBS 2x stamlösning ska spädas i destillerat vatten för att erhålla HBS 1x före användning.
2. inkapsling effektivitet
Notera: Bestäm inkapslingen effektivitet med Peterson protokoll17för att undvika lipid inblandning i protein kvantifiering. Alla prover (BSA-standarder och Liposom supernatant) ska analyseras i tre exemplar. Förbered också ett tomt rör.
- Beredning av lagerreagenser och arbetslösningar17
- För stam reagenser, Förbered koppartartrat-karbonat (CTC) genom att blanda 10 mL 20% natriumkarbonat, 200 μL av 0,1% kopparsulfat, 200 μL av 0,2% kaliumtartrat med 9,6 mL destillerat vatten. Bered 100 mL 10% natriumdodecylsulfat (SDS) och 0,8 N natriumhydroxid (NaOH).
- För arbetslösningar, Förbered 10 mL 0,15% natriumdeoxycholat (DOC) och 72% triklorättiksyra (TCA). Lös 10 mg bovint serumalbumin (BSA) i 10 mL destillerat vatten för att få en standardlösning på 1 mg/mL. Bered reagens A genom att lägga till lika delar av CTC, NaOH, SDS och H2O. Förbered reagensmedlet B genom att späda Folin-Ciocalteu fenolreagens 1:5 i destillerat vatten.
Anmärkning: reagens A kräver 1 mL för varje reaktionsrör, medan reagens B kräver 0,5 mL. För att bestämma de slutliga volymerna av reagenser A och B, definiera först antalet reaktionsrör som skall användas, med tanke på tre distinkta koncentrationer av BSA, blank och prover i triplicate. Reagensmedlet A måste vara väl homogeniserat före användning och kan förvaras vid 25 ° c (RT) i 2 veckor. Reagens B är också stabilt vid 25 ° c (RT) om det förvaras i en bärnstensfärgad flaska.
- Nederbörd
Anmärkning: detta steg utförs i microcentrifug rör.- Späd Liposom supernatanten med vatten till en slutlig volym på 1 mL innehållande 5-100 μg protein.
Anmärkning: det tomma röret ska fyllas med 1 mL destillerat vatten. - Tillsätt 0,1 mL 0,15% DOC, homogenisera med vortexing och inkubera i 10 minuter vid RT.
- Tillsätt 0,1 mL 72% TCA, blanda väl och centrifugera vid 3 000 x g och RT i 15 min.
Anmärkning: DOC-TCA främjar protein nederbörd, bildar två distinkta faser. Målproteinet kan återvinnas genom centrifugering, vilket undviker lipidinterferenser. - Kassera supernatanten försiktigt genom att vertera röret nedåt och lägga det på ett absorberande papper. Spara pelleten för det efterföljande steget.
Obs: pelleten kan vara mycket svårt att se, men röret bör vändas upp och ner även om det inte är synlig.
- Späd Liposom supernatanten med vatten till en slutlig volym på 1 mL innehållande 5-100 μg protein.
- Spektrofotometri
- Dra upp den pellet som erhålls från steg 2.2.4 i 1 mL destillerat vatten. Blanda noggrant för att se till att pelleten är upplöst och överför provet till ett nytt provrör.
- Bered utspädningar av albumin-standarderna (BSA) till en slutlig volym på 1 mL.
Anmärkning: protein standarder måste framställas mellan 5-100 μg/mL. - Tillsätt 1 mL reagens A till rören från steg 2.3.1 och 2.3.2 utan undantag, blanda väl och inkubera i 10 minuter vid RT.
Anmärkning: SDS kan lindra eventuella lipidinterferenser medan medhjälp i protein solubilization. - Tillsätt 0,5 mL reagens B till rören från steg 2.3.1 och 2.3.2, blanda väl och inkubera i 30 minuter vid RT medan det skyddas mot ljuset.
Notera: Follin-Ciocalteu phenolreagens är en blandning av fosforolybdat och fosfotungstat som används för kolorimetriska analyser av vissa kvävehaltiga föreningar, såsom proteiner. Kopparkomplexering ökar Reaktiviteten hos fenoler mot denna reagens och producerar ett blått/lila komplex enligt protein koncentrationen. - Bestäm absorbanserna vid 750 nm med hjälp av en spektrofotometer.
- Beräkna protein koncentrationen i supernatanten baserat på standardkurvan enligt följande.
- Plot absorbansvärde (ABS) kontra BSA-koncentration (mg/ml) för att erhålla vinkelkoefficienten (k) med tanke på en linjär tendens linje.
- Bestäm koncentrationen av supernatanten protein (C) med förhållandet mellan absorbansvärdet och vinkelkoefficienten (k), multiplicera sedan med den totala volymen enligt följande:
- Bestäm inkapslingen effektivitet enligt följande formel:
- där lastat protein = 10 mg, icke inkapslat protein = värdet av C som erhållits i steg 2.3.6.2.
Anmärkning: i detta fall används sammanlagt 10 mg Tarin upplöst i ammoniumsulfatlösning (1 mg/ml) för att utföra inkapslingsproceduren, eftersom denna koncentration är tillräcklig för att uppnå tillfredsställande in vitro-effekter13,16, 18.
3. bestämning av storlek och stabilitet
Anmärkning: storleksfördelning och polidispersitet index (PdI) av liposomalt preparat utvärderas genom dynamisk ljusspridning (DLS). En PdI nära 0,1 indikerar en homogen beredning. För stabilitets bestämning, förvara liposomer vid 4 ° c och kontrollera storleksfördelningen och storleks medelvärdet regelbundet.
- Slå på DLS-utrustningen 30 min före användning för att värma upp laser lampan.
- Överför liposomalt preparat som erhållits i steg 1,10 till en disponibel dimensionering kuvette.
- Ställ in utrustnings parametrarna enligt följande: dispergeringsmedel typ = vatten (RI = 1,33); material = lipider (RI = 1,45); och RT.
- Tryck på Start och vänta medan utrustningen avslutar sin läsning.
- Ta bort kuvette och Stäng av utrustningen.
Anmärkning: antingen överför provet från den kyvetten tillbaka till disponibel 15 ml Centrifugera röret för efterföljande analyser, eller kassera den om det finns en tillräcklig mängd för nya läsningar.
4. morfologisk karakterisering
Obs: Liposom karaktärisering utförs enligt Murtey och Ramasamy19. Prover som innehåller nanoliposomes erhållna i steg 1,10 bereds i tre exemplar.
- Fäst glas täckband (13 mm diameter) i botten av en petriskål med dubbelhäftande tejp. Skär tejpen i små bitar (lämplig storlek för att fixa täckblad), ta bort skyddande papper under, och fixa det på botten av petriskål. Med hjälp av pincett, ta bort skyddspapperet ovanpå tejpen och fäst täckblad på den.
Obs: var försiktig i följande steg för att inte släppa täckglas, och använda en stark tejp. - Täck täckglas med poly-L-lysin. Placera våta filterpapper inuti petriskål för att bibehålla fukt och inkubera i 1 h vid RT (25 ° c).
- Skölj täckglan med destillerat vatten efter beläggning.
- Fyll täckglas med en droppe av provet från steg 1,10 och låt dem torka för 1 h vid RT.
- För att fixera proverna, täck dem med 4% glutaraldehyd beredd i 0,1 M fosfatbuffert, pH = 7,2. Placera våta filterpapper inuti petriskål och försegla skålen för att bibehålla fuktnivåer. Inkubera vid 4 ° c i 48 h.
- Skölj täckglas 3x i 5 min med samma fosfatbuffert.
- Dehydrate prover enligt följande: 35% etanol 1x för 15 min, 50% etanol 1x för 15 min, 75% etanol 1x för 15 min, 95% etanol 2x för 15 min, och absolut etanol 3x för 20 min.
- Kemiskt torra proverna genom nedsänkning 2x i 1 − 2 mL av hexamethyldisilazane (HMDS) för 10 min.
Anmärkning: HMDS ska manipuleras noggrant inuti ett draghuv. Proverna bör tillåtas torka över natten inuti en exsickator eller inuti draghuv vid RT. - Montera de torkade proverna på en stub med en kolledande tejp.
- Sputter ytan på täckslip i ett vakuum med ett elektriskt ledande skikt (20 nm tjocklek) av guld-Palladium.
- Spela in bilder med ett Scanningelektronmikroskop (SEM) i lågvakuum läge och lågspänning (20 kV).
Representative Results
Figur 1 beskriver nanoliposome-preparatet16,20,21. Fosfolipider, 1,2-dioleoyl-SN-glycerol-3-fosfoetanolamin (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[Amino (polyetylenglykol)-2000] (ammoniumsalt; DSPE-MPEG 2000), och cholesterylhemisuccinate (CHEMS), de viktigaste Liposom beståndsdelarna, upplöstes först i kloroform för att få lipid filmen. Lipidfilmen återhydrerades sedan i ammoniumsulfatlösning som innehöll det hydrofila proteinet (Tarin) som skulle snärtas, och inkuberingen utfördes över en natt. Sedan, ultraljudsbehandling och extrudering tekniker tillämpades för att generera små små blåsor. Den ultracentrifugering steg separerade liposomala preparatet från fria lipider och okapslade protein, medan supernatanten användes för bestämning av Entrapment effektivitet.
Nanoliposomes som produceras med hjälp av ovannämnda metod uppvisade en storleksfördelning på mellan 51 − 396 nm och en medelstorlek på 155 nm (tabell 2). Preparatet var homogent, eftersom polydispertion index var 0,168. En hög Entrapment verkningsgrad på 83% kan nås om liposomerna extruderas genom en porstorlek på 0,2 μm (tabell 2).
Morfologiska nanoliposome egenskaper utvärderades av SEM. figur 2A, B visar rundformade liposomala blåsor i intervallet 121 nm och analyseras vid 20 kV, medan figur 2C, D uppvisar otillräckligt preparerade Prover. Nanoliposomes var helt enkelt lufttorkad utan tidigare fixering eller någon annan behandling som beskrivs i denna studie. Som ett resultat, större och skadade blåsor i intervallet 332 μm och analyseras vid 5 kV observerades.
Figur 1: schematisk representation av nanoliposome beredning. KNARK, PEG, och CHEMS, de viktigaste Liposom beståndsdelar, upplöstes först i kloroform för att få lipid filmen (1, 2, 3). Lipidfilmen återhydrerades sedan i en saltlösning som innehöll det hydrofila proteinet (Tarin) som skulle snärtas, och inkuberingen utfördes över natten (4). Sedan, ultraljudsbehandling och extrudering tekniker tillämpades för att generera stadsjeepar (5, 6). Den ultracentrifugering steg separerade liposomala preparatet från fria lipider och okapslade protein, medan supernatanten användes för bestämning av Entrapment effektivitet (7). Denna siffra har modifierats från Correa et al.16. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Nanoliposome photomicroskopi av SEM. (a, B) Bilder av runda-formade liposomala blåsor i intervallet 121 nm och analyseras vid 20 kV. (C, D) Bilder av otillräckligt preparerade prover. Felbehandlade prover som är tillåtna för observation av större och/eller skadade blåsor, som inte kan motstå vakuum-och/eller spänningsförhållanden vid 5 kV. Denna siffra har modifierats från Correa et al.16. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Liposom komponenter | Vikt (g) | Koncentration (mM) | Slutlig volym |
| Knark | 0,0420 | 5,7 | 10 mL |
| MPEG 2000-DSPE | 0,1059 | 3,8 | |
| Chems | 0,0024 | 0,5 |
DOPE-1,2-dioleoyl-SN-glycerol-3-fosfoetanolamin); MPEG 2000-DSPE-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[Amino (polyetylenglykol)-2000] (ammoniumsalt); CHEMS-cholesterylhemisuccinate.
Tabell 1: beredning av Tarin liposomalt nanocapsules.
| Membran porstorlek (μm) | Storleksfördelning (Nm) | Medelstorlek (Nm) | Polydispersity index (PdI) | Topp (Nm) | Entrapment effektivitet |
| 0,2 | 51-396 | 155 | 0.168 | 94 ± 39 | 0,83 |
Storlek och polydispertion index utvärderades av dynamisk ljusspridning, medan inkapsling effektivitet bestämdes enligt Peterson17.
Tabell 2: storlek, polidispersitet index, och Entrapment effektivitet nanoliposome beredning.
Discussion
Det protokoll som beskrivs häri testades av Correa et al.16 för att kapsla Tarin, en immunmodulerande och antitumöreffekt lektin renas från Colocasia esculenta22. Metoden gav framgångsrika resultat, vilket möjliggjorde produktion av stabila nanoliposomes av lämplig storlek för terapeutiska tillämpningar. Formuleringen presenterar kontrollerad frisättning vid olika pH-nivåer under fysiologiska förhållanden. Det potentierar också Tarin farmakologiska egenskaper, såsom hämning av humant glioblastoma U-87 MG och bröstcancer MDA-MB-231 cellinjer och stimulering av möss benmärgsceller. Den liposomala preparatet uppvisade inga toxiska effekter i friska möss celler16.
Den klassiska metoden, som först beskrevs av Bangham et al.7, möjliggör produktion av stora multilamellära Liposom blåsor, heterogena i storlek och form. Anpassningar av denna metod, som rapporterats i den aktuella studien, tillämpas framgångsrikt genom att inkludera ytterligare steg såsom ultraljudsbehandling och extrudering genom en 0,2 μm polykarbonatmembran. Detta möjliggör produktion av en mer homogen dispersion när det gäller storlek i nanometerområdet16,23,24. Därför, för att säkerställa framgångsrika resultat, inkapsling protokoll och liposomalt formulering som beskrivs här bör följas strikt.
Den nanoliposome sammansättningen var noga utvalda för att säkerställa bildandet av ett lipidens membran med knark, MPEG 2000-dspe, och Chems som de viktigaste beståndsdelarna. Dessa är naturliga djur membran lipidens beståndsdelar och den senare kan ge smidighet till nanoliposome arkitektur, säkerställa en bred tillämpning för bioaktiva sammansatta leverans i människor.
Nanoliposome pegylering är viktigt för att garantera Liposom struktur stabilitet. Avsaknaden av PEG leder till storleks utvidgning, en hög polydispersitet index, och låg Entrapment effektivitet. Optimala resultat kan erhållas med DOPE som den viktigaste Liposom komponenten. Detta är dock en hög kostnad fosfolipid. De finansiella kostnaderna för nanoliposome produktion kan uppnås genom att ersätta knark med andra liknande lipider såsom DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin). CHEMS är en kolesterol molekyl som finns naturligt i animaliska cellmembran, som inte bör uteslutas från formuleringen, eftersom det är viktigt att säkerställa lipidbilayer fluiditet och formbarhet16.
Andra aspekter av inkapsling protokollet kan också anpassas. Den kloroform som används för att lösa upp liposomala komponenter kan lätt ersättas med metanol utan effekter på storlek genomsnitt, homogenitet, och Entrapment effektivitet. Vissa Proteinläckage kan dock förekomma vid förvaring under 4 ° c16. Inkubations steget över natten med ammoniumsulfatlösning som innehåller Tarin är inte obligatoriskt. emellertid, för enkelhetens skull kan det utföras utan skador på nanoliposomala biofysiska egenskaper, inkapsling, eller stabilitet effektivitetsförluster, vilket framgår av Correa et al.16. Extrudering steg utförs vid rumstemperatur, vilket kan minska flödet mellan sprutorna om en 0,1 μm porstorlek membran används.
För att övervinna denna fråga bör användning av en 0,2 μm porstorlek membran eller uppvärmning av extruder innehavaren över lipidövergångstemperaturen övervägas. Analytikern måste vara noga med att inte skada lipider eller protein som kan inaktiveras och förlorar biologisk aktivitet. Alternativt kan liposomalt preparat dialyseras mot HBS i stället för ultracentrifugation, med hjälp av ett cut-off membran enligt proteinmolekyl vikt. Valet av kemisk typ av den buffert i vilken nanoliposomes avbryts efter ultracentrifugering är direkt relaterad till dess efterföljande tillämpning. Eftersom perspektiv av denna studie inkluderar in vivo och in vitro-analyser, suspension i HEPES buffrad saltlösning var tillräcklig för att säkerställa inga cytotoxiska effekter och ett pH-intervall nära fysiologiska förhållanden.
Liposomer bör behandlas fint, liknande levande celler, för att få högre kvalitet SEM bilder. Fixering och torkning är viktiga för att säkerställa visualisering av mindre intakta blåsor som stöder värden högre än 20 kV under vakuum förhållanden. Figur 2 A, B visar nanostora blåsor kompatibla med extrudering förfarande. Visualisering av blåsor som sträcker sig från 51-396 Nm är möjlig om adekvat provberedning efter denna procedur utförs. Stegen inkluderar fixering, torkning genom att öka etanol koncentrationer, och kemisk uttorkning för att undvika bildandet av aggregat och spruckna blåsor orsakade av vakuum och elektronstråle. Å andra sidan, figur 2C, D visar Liposom blåsor torkade under rumstemperatur och inte utsätts för någon behandling som beskrivs här, vilket innebär att de var beredda otillräckligt. Som ett resultat av det otillräckliga förfarandet bildas jätte blåsor, även efter extrudering genom ett membran med porstorlek på 0,2 μm. Spruckna blåsor observeras också i båda panelerna som ett resultat av vakuum-och elektronstråle skador.
Nanoliposome blåsor har undersökts som en inkapsling och leveranssystem för hydrofoba molekyler, inklusive resveratrol (3, 5, 4 '-trihydroxystilbene), en bioaktiva förening mot kolorektal cancerceller. Inkapslingen förfarandet kan övervinna den dåliga lösligheten av lipofila föreningar förutom att ge biokompatibilitet, biologisk nedbrytbarhet, icke-immunogenicitet, och icke-toxiska egenskaper inneboende till Liposom nanocapsules25. Protokoll anpassningar måste beaktas beroende på administreringsväg och syfte, såsom utveckling av nya Liposom formuleringar för oral administrering.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för COPPE/UFRJ, elektronisk Microscopy laboratorium, och Fleranvändarmaterial karakterisering laboratorieanläggningar; till Dr. Adalberto vieyra, Dr. Jennifer Lowe, och Rafael Lindoso, professorer vid Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, för användning av ultracentrifuge; till Dr Alexandre Guedes Torres och Daniel Perrone, professorer vid Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, för användning av Rotary indunstare; till professor Roland Bodmeier och Dr. Andriy Dashevskiy från Freie Universität i Berlin, som hjälpte till med resurser, tillhandahöll nya metoder och övervakade ACNTF under ett 6 månaders Erasmus +-stipendium i Tyskland; till Dr Rossana Thiré och Aline Fernandes, professor och tekniker vid Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, för användning av ZetaSizer Malvern; till BLUMA Guenther och Taissa Rodrigues, professor och tekniker vid Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, för användning av SEM; till Dr Rachel Ann Hauser Davis, forskare vid Fundação Oswaldo Cruz, för berättande. Denna studie finansierades delvis av Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior, Brasil (CAPES)-finans kod 001 (Grant nr 1627392; 1811605); av Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (Grant No. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 och E-26/202.860/2016); av Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (Grant nr 406601/2018-6), och Financiadora de estudos e Projetos (FINEP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
| Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
| Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
| BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
| CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
| Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
| Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
| DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
| Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
| Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
| JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
| Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
| Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
| Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
| Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
| Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
| TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
| Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
| Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
| Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |
References
- Wang, X., Wang, Y., Chen, Z. G., Shin, D. M. Advances of cancer therapy by nanotechnology. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 41 (1), 1 (2009).
- Keller, B. C. Liposomes in nutrition. Trends in Food Science & Technology. 12 (1), 25-31 (2001).
- Frézard, F., Schettini, D. A., Rocha, O. G., Demicheli, C. Lipossomas: propriedades físico-químicas e farmacológicas, aplicações na quimioterapia à base de antimônio. Quimica Nova. 28 (3), 511-518 (2005).
- Ferreira, D. dS., Lopes, S. C. dA., Franco, M. S., Oliveira, M. C. pH-sensitive liposomes for drug delivery in cancer treatment. Therapeutic Delivery. 4 (9), 1099-1123 (2013).
- Papachristos, A., Pippa, N., Ioannidis, K., Sivolapenko, G., Demetzos, C. Liposomal forms of anticancer agents beyond anthracyclines: present and future perspectives. Journal of Liposome Research. 25 (2), 166-173 (2015).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
- Bangham, A., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), 238-252 (1965).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4194-4198 (1978).
- Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 298 (4), 1015-1019 (1973).
- Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid/detergent mixed micelles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 640 (1), 252-262 (1981).
- Szebeni, J., et al. Oxidation and denaturation of hemoglobin encapsulated in liposomes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 798 (1), 60-67 (1984).
- Coelho, J. F., et al. Drug delivery systems: Advanced technologies potentially applicable in personalized treatments. EPMA Journal. 1 (1), 164-209 (2010).
- Pereira, P. R., et al. Purification and characterization of the lectin from taro (Colocasia esculenta) and its effect on mouse splenocyte proliferation in vitro and in vivo. The Protein Journal. 33 (1), 92-99 (2014).
- Pereira, P. R., et al. Structural analysis and binding properties of isoforms of tarin, the GNA-related lectin from Colocasia esculenta. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (1), 20-30 (2015).
- Pereira, P. R., et al. High-resolution crystal structures of Colocasia esculenta tarin lectin. Glycobiology. 27 (1), 50-56 (2016).
- Correa, A., Vericimo, M. A., Dashevskiy, A., Pereira, P. R., Paschoalin, V. M. F. Liposomal Taro Lectin Nanocapsules Control Human Glioblastoma and Mammary Adenocarcinoma Cell Proliferation. Molecules. 24 (3), 471 (2019).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Merida, L. A., et al. Tarin stimulates granulocyte growth in bone marrow cell cultures and minimizes immunosuppression by cyclo-phosphamide in mice. PLoS ONE. 13 (11), e0206240 (2018).
- Murtey, M. D., Ramasamy, P. Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy - Life Sciences. Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. Janecek, M., Kral, R. , InTechOpen. (2016).
- Andrade, C. A., Correia, M. T., Coelho, L. C., Nascimento, S. C., Santos-Magalhães, N. S. Antitumor activity of Cratylia mollis lectin encapsulated into liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 278 (2), 435-445 (2004).
- dos Santos Ferreira, D., et al. Development of a bone-targeted pH-sensitive liposomal formulation containing doxorubicin: physicochemical characterization, cytotoxicity, and biodistribution evaluation in a mouse model of bone metastasis. International Journal of Nanomedicine. 11, 3737 (2016).
- Pereira, P. R., Corrêa, A. C. N. T. F., Vericimo, M. A., Paschoalin, V. M. F. Tarin, a Potential Immunomodulator and COX-Inhibitor Lectin Found in Taro (Colocasia esculenta). Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 17 (4), 878-891 (2018).
- Olson, F., Hunt, C., Szoka, F., Vail, W., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).
- Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods in Enzymology. 367, 3 (2003).
- Soo, E., et al. Enhancing delivery and cytotoxicity of resveratrol through a dual nanoencapsulation approach. Journal of Colloid and Interface Science. 462, 368-374 (2016).
