Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Klargøring og karakterisering af Nanoliposomer til Indstødelse af bioaktive hydrofile Gloformede proteiner

Published: August 31, 2019 doi: 10.3791/59900
Automatic Translation
1, 1, 1
1Chemistry Institute, Federal University of Rio de Janeiro

Summary

Denne undersøgelse beskriver klassisk hydrering ved hjælp af den tynde lipid film metode til nanoliposome præparat efterfulgt af nanopartikel karakterisering. En 47 kDa-hydrophilic og kugleformet protein, Tarin, er med succes indkapslet som en strategi for at forbedre stabiliteten, undgå hurtig clearance, og fremme kontrollerede frigivelse. Metoden kan tilpasses til hydrofobe molekyler indkapsling.

Abstract

Liposome nanocapsules er blevet anvendt til mange formål i den farmaceutiske, kosmetiske og fødevareindustrien. Attributter af Liposomer omfatter deres biokompatibilitet, bionedbrydelighed, ikke-immunogenicitet, ikke-toksicitet, og evne til at indfange både hydrofile og hydrofobe forbindelser. Den klassiske hydrering af tynde lipid-film i et organisk opløsningsmiddel påføres heri som en teknik til indkapsling af Tarin, en plantelectin, i nanoliposomer. Nanoliposome størrelse, stabilitet, fastklemning effektivitet, og morfologiske karakterisering er beskrevet i detaljer. Nanoliposomer tilberedes ved hjælp af 1,2-dioleoyl-SN-glycerol-3-phosphoethanolamin (DOPE), 1,2-distearoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[amino (polyethylenglycol)-2000] (ammoniumsalt; (DSPE-MPEG 2000) og cholesterylhemisuccinat (CHEMS) som de vigtigste bestanddele. Lipider opløses først i chloroform for at opnå en tynd lipid-film, som efterfølgende rehydreres i ammoniumsulfat opløsning, der indeholder proteinet, der skal indesluttes og inkuberet natten over. Derefter anvendes sonikering og ekstruderingsteknikker til at generere nanodimensionerede af vesikler. Nanovesikles størrelse og polydispersitetsindeks bestemmes af dynamisk lysspredning, mens nanovesikel morfologi vurderes ved scanning af elektronmikroskopi. Entrapment effektivitet bestemmes af forholdet mellem mængden af uindkapslet protein til oprindelige mængde af oprindeligt indlæst protein. Homogene Liposomer opnås med en gennemsnitlig størrelse på 155 nm og polydispersitet indeksværdi af 0,168. Der opnås en høj virkningsgrad på 83%.

Introduction

Antallet af undersøgelser, som undersøger effektive lægemiddel leveringssystemer, er steget i de seneste år. Men, begrænsninger såsom hurtig clearance, dårlig Biodistribution, og opløselighed ved fysiologisk pH og utilstrækkelig cellulær optagelse stadig nødt til at blive overgået. Brugen af nanosystemer er dukket op som de seneste fremskridt inden for kræft Therapeutics, anvendes til at øge den intracellulære koncentration af lægemidler inde kræftceller samtidig minimere toksicitet i raske celler. Desuden anvendes nanopartikler fra forskellige materialer (dvs. polymerer, dendrimere, Liposomer, vira, carbonnanorør og metaller som jernoxid og guld) for øjeblikket til at forstærke anticancer effekterne og reducere systemisk toksicitet1. Liposome nanocapsules i særdeleshed har været anvendt til mange formål i den farmaceutiske, kosmetiske og fødevareindustrien. I de seneste år, forskellige nutraceutical produkter såsom vitaminer, enzymer, og urteekstrakter er blevet formuleret ved hjælp af Liposom teknologi2.

Liposomer er sfæriske vesikler bestående af en eller flere koncentriske lipid-dobbeltlag, der spontant dannes ved spredningen af phospholipider i vandig medie3,4. De polære hoveder af Fosfolipiderne er placeret på de ydre og indre overflader af membranerne, i kontakt med det vandige miljø. I modsætning hertil danner fedtsyre kæder den hydrofobe kerne af membraner og beskyttes mod vand5. Nogle egenskaber af Liposomer, der gør dem attraktive medicin leveringssystemer omfatter deres biokompatibilitet, bionedbrydelighed, ikke-immunogenicitet, ikke-toksicitet, og evne til at indfange både hydrofile og hydrofobe forbindelser6.

Liposomer kan tilberedes ved hjælp af forskellige processer trin såsom agitation, sonikering, ekstrudering, lyofilisering, frysning, og optøning. Klassiske metoder omfatter reverse fase fordampning, solvent injektion, og rengøringsmiddel dialyse. Den mest anvendte metode er tynd lipid film hydrering, også kendt som bangham metode, som bruges til at opnå vesikulære-lipid former7,8,9,10,11. Lamellaritet (antallet af phospholipid bilayers) og partikelstørrelse er klassiske parametre, der anvendes til at karakterisere Liposomer som enten 1) af vesikler (ulvs), dannet af en unik phospholipid tolags og varierende i størrelse som følger: i) lille af vesikler (SUVs, ~ 0,02-0,20 μm), II) store af vesikler (luvs, ~ 0,2-1,0 μm), og III) Giant af vesikler (guvs, > 1 μm); eller 2) multilamellar vesikler (mlvs, > 0,1 μm)3,12. Vesikel størrelse er en vigtig parameter, når man overvejer til terapeutisk brug, såsom i kræftbehandling, i hvilke størrelser af < 200 Nm er ideelle til at give nanovesikler til at krydse endotel barrieren og nå tumor væv4.

Heri, indkapsling procedure efter den klassiske hydrering af en tynd lipid filmteknik7 blev beskrevet ved hjælp af Tarin, en plante lektin karakteriseret som et hydrofile glokulært protein13,14,15 . Nanosized vesikler er fremstillet ved at medtage sonikering og ekstrudering trin i den vigtigste teknik, hvilket resulterer i stabile liposomale nanovesikler med høj fastklemning effektivitet16.

Protocol

1. fremstilling af Tarin liposomal nanocapsules16

Bemærk: alle præparater skal tilberedes i tre eksemplarer for at opnå en større mængde (7 mL) og gøre det muligt at centrifugeres i en ultracentrifuge (Se detaljer nedenfor).

  1. Vejer Liposom komponenterne ved hjælp af en analytisk balance, som vist i tabel 1.
  2. Lipid-komponenterne opløses i chloroform ved hjælp af en 250 mL målekolbe, der passer i en rotationsfordamper for at undgå tab af materiale.
  3. Blandingen omrøres med 150 rpm i 15 minutter.
  4. Fjern chloroform ved hjælp af en rotationsfordamper under følgende forhold:
    1. Justér volumetrisk kolbens mund til standardpositionen (25 °) for optimal effektivitet, mens du er i kontakt med vandet fra varme badet.
      Bemærk: udstyrs armen skal være indstillet til 25 ° for at opretholde kontakten mellem målekolben og vandbad, samtidig med at den ikke påvirker fordampnings effektiviteten eller beskadiger prøven. Standardpositionen kan variere alt efter udstyrs mærket.
    2. Indstil kondensator temperaturen til mindst 3 °C.
    3. Indstil opvarmnings badet til 40 ± 1 °C.
    4. Indstil rotationen til 120 rpm.
    5. Juster vakuum til 207 mbar og kogepunkt til 20 °C.
    6. Efter ~ 25 min, fjerne kolben og kassere fordampet opløsningsmiddel, resterende i kondensatoren, passende.
      Bemærk: en tynd og uigennemsigtig film, der består af Liposom komponenterne, dannes i dette trin og kan let visualiseres. Det fordampede opløsningsmiddel, der er tilbage i kondensatoren, skal opbevares i bortskaffelses modtagere (chlorerede), som skal håndteres af en specialiseret virksomhed med henblik på passende udsmid.
  5. Lipidfilmen for at nå en 0,01 M lipid koncentration i 0,3 M ammoniumsulfat opløsning (pH = 7,4) indeholdende Tarin på 1 mg/mL til en endelig volumen på 10 mL.
    1. Blandingen omrøres i 40 min. og Inkuber natten over ved 4 °C.
      Bemærk: dette trin kan betragtes som et stoppunkt. Natten inkubation er ikke obligatorisk.
  6. Efter inkubation, sonikering suspensionen i 1 min ved 25 °C (stuetemperatur; RT) for at reducere vesikel størrelse og undgå sammenlægning.
    Bemærk: størrelsesreduktion blev udført i en ultralydsonikator under følgende betingelser: 130 W og 40 kHz.
  7. Udfør en 12-cyklus ekstrudering gennem en 0,2 μm polycarbonat pore membran.
    Bemærk: før ekstruderingsproces, test mini-ekstrudering samling ved hjælp af vand for at undgå prøve lækage. En 0,1 μm pore membran er også velegnet. I dette tilfælde skal du forvarme mini-ekstruderen over lipid-overgangs temperaturen for at lette ekstrudering, samtidig med at de fysisk-kemiske egenskaber ved både lipider og proteiner bevares.
    1. Passer til de dele af mini ekstrudet, som beskrevet i producentens manual.
    2. Placer polykarbonat membranen mellem to præ-våde filter støtter og Placer den i holderen.
    3. Indsæt en 1 mL Tom sprøjte i enheden, fyld den anden sprøjte med den totale volumen med liposomal suspensionen, og sæt den på den modsatte side.
    4. Udfør en 12-cyklus ekstrudering gennem en 0,2 μm polycarbonat pore membran. Skub prøven fra en sprøjte til en anden, langsomt. Den ekstruderede suspension opsamles i et forkølet rør.
      Bemærk: polycarbonat membranen bør kun udskiftes, når prøveoverførsel fra en sprøjte til en anden bliver vanskelig. Liposomal suspensionen bør blive tydelig under ekstruderingsproces som følge af størrelsesreduktion på grund af dannelsen af SUVs. Ca. 0,2 mL af prøven kan gå tabt i dette trin.
  8. Separate Liposomer af ultracentrifugering.
    Bemærk: Bevar prøverne i et isbad, indtil ultracentrifuge er klar til brug. Separate Suv's fra de resterende komponenter og ammoniumsulfat ved ultracentrifugering ved hjælp af en ultracentrifuge med en swing-Bucket rotor (Se detaljer nedenfor).
    1. Prøven vejes i titanium røret, der passer til rotoren og afbalancerer rørene. Kontroller den påkrævede mindste mængde i henhold til den rotor, der anvendes til at undgå beskadigelse af rørene, og Juster om nødvendigt liposomal affjedrings volumen med ammoniumsulfat.
      Bemærk: swing spanden skal altid understøttes på stativet, når den er uden for centrifuge for at undgå at ridse "Zebra striber" (dvs. de sorte og hvide striber på bunden), som anvendes af centrifugen til at bestemme rotationshastigheden.
    2. Tænd for støvsugeren, før du bruger centrifugen, så den kan opbevares i køleskab.
    3. Monter titanium rørene i Swing spanden.
      Bemærk: løft rørene til den position, de antager, når de kører, for at sikre, at de er perfekt monteret.
    4. Frigør vakuum, Åbn Centrifugerings døren, og Placer rotoren indvendigt.
      Bemærk: Vær opmærksom på cirkel mærket på bunden af rotoren, som skal passe i den modsatte retning af samme cirkel mærke i selve centrifugen.
    5. Luk Centrifugerings døren, tryk vakuum og vent, indtil vakuum når fra 200 til < 20 mikron eller fra 26 PA til < 3 PA.
    6. Justér parametrene i ultracentrifuge-displayet til 150.000 x g (svarende til 29.600 rpm for den førnævnte swing spand) for 90 min ved 4 °c (acceleration: maks, deceleration: maks.).
      Bemærk: Konverter altid hastigheden til x g , hvis den specifikke centrifuge er indstillet i rpm. Brug centrifuge webstedet til at konvertere enheden i henhold til den anvendte rotor.
    7. Tryk på Recall, Kontroller betingelserne, og tryk på Start for at køre.
      Bemærk: Vent, indtil centrifugen når den ønskede hastighed.
    8. Efter 90 min. skal du frigøre vakuum ved at trykke på vakuum knappen og åbne Centrifugerings lågen, når vakuum når 200-700 mikroner (svarende til 26-93 PA).
    9. Sluk for centrifugen, Fjern rotoren indefra, og lad den stå på bænken med spande for at tørre.
    10. Vedligehold ultracentrifuged prøverne på is.
  9. Forsigtigt, separat supernatanten fra pellet ved at dreje røret på hovedet i et engangs 15 mL centrifugeglas for at adskille supernatanten og pellet.
    Bemærk: Opbevar supernatanten med det ikke-indkapslede protein ved 4 °C. Det vil blive brugt til at bestemme indkapsling effektivitet. Pellet fremstår som en gennemskinnelige gelé.
  10. Den pellet, der indeholder det indkapslede protein i HEPES-buffer saltvand (3 mL 1x HBS), suspenderes.
    Bemærk: HBS 2x (stamopløsning) fremstilles ved fortynding af følgende mængder af reagenser i destilleret vand: 140 mM NaCl, 1,5 mM na2HPO4, 50 mm Hepes, derefter justeres pH til 7,4 og endelige volumen til 100 ml. Na2HPO4 kan udskiftes med NaHCO3eller udelades for at undgå interferens, hvis Liposom koncentrationen skal bestemmes. HBS 2x stamopløsning skal fortyndes i destilleret vand for at opnå HBS 1x før brug.

2. indkapsling effektivitet

Bemærk: Bestem indkapsling effektivitet ved hjælp af Petersons protokol17for at undgå lipid interferens i protein kvantificering. Alle prøver (BSA standarder og Liposom supernatant) bør analyseres i tre eksemplarer. Forbered også et blankt rør.

  1. Klargøring af lager reagenser og arbejds løsninger17
    1. For lager reagenser forberedes kobber-tartrat-karbonat (CTC) ved at blande 10 mL 20% natriumcarbonat, 200 μL 0,1% kobbersulfat, 200 μL 0,2% kaliumtartrat med 9,6 mL destilleret vand. Forbered 100 mL 10% natriumdodecylsulfat (SDS) og 0,8 N natriumhydroxid (NaOH).
    2. For arbejdsopløsninger, Forbered 10 mL af 0,15% natriumdeoxycholat (DOC) og 72% trichloreddikesyre (TCA). 10 mg bovint serumalbumin (BSA) opløses i 10 mL destilleret vand for at opnå en 1 mg/mL standardopløsning. Forbered reagens A ved at tilsætte lige dele af CTC, NaOH, SDS og H2O. Forbered reagens B ved at fortynde Folin-Ciocalteu phenol reagens 1:5 i destilleret vand.
      Bemærk: reagens A kræver 1 mL for hvert reaktions slange, mens reagens B kræver 0,5 mL. For at bestemme de endelige volumener af reagenser A og B defineres først antallet af reaktions slanger, der skal anvendes, i betragtning af tre særskilte koncentrationer af BSA, blank og prøver i triplicat. Reagens A skal være godt homogeniseret før brug og kan opbevares ved 25 °C (RT) i 2 uger. Reagens B er også stabilt ved 25 °C (RT), hvis det opbevares i en ravfarvet flaske.
  2. Nedbør
    Bemærk: dette trin udføres i mikrocentrifuge glas.
    1. Den Liposom supernatanten fortyndes med vand til en endelig volumen på 1 mL indeholdende 5-100 μg protein.
      Bemærk: det blanke rør skal fyldes med 1 mL destilleret vand.
    2. Tilsæt 0,1 mL 0,15% DOC, homogeniserer ved vortexing, og Inkuber i 10 min ved RT.
    3. Tilsæt 0,1 mL 72% TCA, bland godt, og centrifuge ved 3.000 x g og rt i 15 min.
      Bemærk: DOC-TCA fremmer protein udfældning, der danner to særskilte faser. Målproteinet kan opsamles ved centrifugering og undgå lipid-interferens.
    4. Kassér forsigtigt supernatanten ved at sætte røret nedad og lægge det på et absorberende papir. Gem pellet for det efterfølgende trin.
      Bemærk: pellet kan være meget svært at se, men røret skal vendes på hovedet, selv om det ikke er synlig.
  3. Spektrofotometri
    1. Den pellet, som er fremstillet af trin 2.2.4, suspenderes i 1 mL destilleret vand. Bland grundigt for at sikre, at pellet er opløst og overføre prøven til et nyt testrør.
    2. Klargør fortyndinger af albumin (BSA)-standarderne til et endeligt volumen på 1 mL.
      Bemærk: protein normerne skal fremstilles mellem 5-100 μg/mL.
    3. 1 mL reagens A tilsættes til rørene fra trin 2.3.1 og 2.3.2 uden undtagelse, blandes godt og inkuberes i 10 minutter ved RT.
      Bemærk: SDS kan lindre mulige lipid interferenser mens medvirken i protein solubilization.
    4. Tilsæt 0,5 mL reagens B til rørene fra trin 2.3.1 og 2.3.2, bland godt, og Inkuber i 30 minutter ved RT, mens de beskyttes mod lyset.
      Bemærk: follin-Ciocalteu phenol reagens er en blanding af phosphomolybdate og phosphotungstate, der anvendes til kolorimetriske assays af nogle kvælstof-holdige forbindelser, såsom proteiner. Kobber kompleksdannelse øger reaktiviteten af phenoler mod denne reagens, der producerer et blåt/lilla kompleks efter proteinkoncentration.
    5. Bestem abscisse ved 750 nm ved hjælp af et spektrofotometer.
    6. Proteinkoncentrationen i supernatanten beregnes på grundlag af standardkurven som følger.
      1. Plot absorbans værdi (ABS) vs. BSA koncentration (mg/ml) for at opnå den kantede koefficient (k) overvejer en lineær tendenslinje.
      2. Den supernatante proteinkoncentration (C) bestemmes ved forholdet mellem absorbansværdien og vinkel koefficienten (k) og multipliceres derefter med det samlede rumfang på følgende måde:
        Equation 1
  4. Bestem indkapsling effektivitet i henhold til følgende formel:
    Equation 2
  5. hvor indlæst protein = 10 mg, ikke-indkapslet protein = værdien af C opnået i trin 2.3.6.2.
    Bemærk: i dette tilfælde anvendes i alt 10 mg Tarin opløst i ammoniumsulfat opløsning (1 mg/ml) til at udføre indkapsling proceduren, da denne koncentration er tilstrækkelig til at opnå tilfredsstillende in vitro-effekt13,16, 18.

3. fastsættelse af størrelse og stabilitet

Bemærk: størrelsesfordeling og polidispersitet Index (PdI) af liposomale præparater evalueres ved dynamisk lysspredning (DLS). En PdI tæt på 0,1 indikerer en homogen forberedelse. For at fastslå stabiliteten, Opbevar Liposomer ved 4 °C, og kontroller størrelsesfordelingen og størrelses gennemsnittet regelmæssigt.

  1. Tænd DLS-udstyret 30 min før brug for at opvarme laser lampen.
  2. Overfør liposomal præparatet opnået i trin 1,10 til en engangs størrelse cuvette.
  3. Indstil udstyrs parametrene på følgende måde: dispergeringsmiddel type = vand (Ri = 1,33); materiale = lipiderne (RI = 1,45); og RT.
  4. Tryk på start og vent, mens udstyret er færdig med at læse.
  5. Fjern kuvetten, og sluk for udstyret.
    Bemærk: du skal enten overføre prøven fra kuvetten tilbage til det engangs-15 mL centrifugeglas til efterfølgende analyser eller kassere den, hvis der er tilstrækkelig mængde til nye læsninger.

4. morfologisk karakterisering

Bemærk: Liposome karakterisering udføres i henhold til Murtey og Ramasamy19. Prøver, der indeholder nanoliposomer opnået i trin 1,10, tilberedes i tre eksemplarer.

  1. Fastgør glas dæksedlen (diameter 13 mm) i bunden af en Petri skål med dobbeltsidet tape. Skær båndet i små stykker (passende størrelse for at fastsætte dæksedlerne), Fjern det beskyttende papir nedenunder, og Fastgør det på bunden af Petri skålen. Ved hjælp af pincet, fjerne den beskyttende papir på toppen af båndet og fastgør coverglider på den.
    Bemærk: Vær forsigtig i følgende trin for ikke at frigive dæksedlerne, og brug en stærk tape.
  2. Frakke dæksedlerne med poly-L-lysin. Anbring våde filter papirer inde i Petri skålen for at opretholde fugt og inkubere i 1 time ved RT (25 °C).
  3. Efter belægning skylles dæksedlerne med destilleret vand.
  4. Fyld dæksedlerne med en dråbe prøve fra trin 1,10 og lad dem tørre i 1 time ved RT.
  5. Til at fastsætte prøverne, dække dem med 4% glutaraldehyd fremstillet i 0,1 M fosfatbuffer, pH = 7,2. Placer våde filter papirer inde i Petri skålen og forsegle skålen for at opretholde fugt niveauer. Inkuber ved 4 °C i 48 h.
  6. Skyl dæksedlerne 3x i 5 minutter med den samme fosfatbuffer.
  7. Dehydrat prøver som følger: 35% ethanol 1x i 15 min, 50% ethanol 1x for 15 min, 75% ethanol 1x for 15 min, 95% ethanol 2x for 15 min, og absolut ethanol 3x for 20 min.
  8. Kemisk tør prøverne ved nedsænkning 2x i 1 − 2 mL hexamethyldisilazan (HMDS) i 10 min.
    Bemærk: HMDS skal manipuleres omhyggeligt inde i en stinkhætte. Prøver bør have lov til at tørre natten over i en ekssikkator eller inde i røgudemhætten ved rt.
  9. De tørrede prøver monteres på en stub med et kulstof ledende klæbebånd.
  10. Sputter overfladen af dæksedlen i et vakuum med et elektrisk ledende lag (20 Nm tykkelse) af guld-Palladium.
  11. Optag billeder med et scannings elektronmikroskop (SEM) ved lav vakuum tilstand og lav spænding (20 kV).

Representative Results

Figur 1 beskriver nanoliposome præparat16,20,21. Phospholipid'er, 1,2-dioleoyl-SN-glycerol-3-phosphoethanolamin (DOPE), 1,2-distearoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[amino (polyethylenglycol)-2000] (ammoniumsalt; Dspe-MPEG 2000) og cholesterylhemisuccinat (Chems), de vigtigste Liposom bestanddele, blev først opløst i chloroform for at opnå lipid-filmen. Lipid-filmen blev derefter rehydreret i ammoniumsulfat opløsning, der indeholder det hydrofile protein (Tarin), der skal indesluttes, og inkubationen blev udført natten over. Derefter blev sonikering og ekstruderingsteknikker anvendt til at generere små af vesikler. Det ultracentrifugering trin adskilte liposomal præparatet fra frie lipider og uindkapslet protein, mens supernatanten blev brugt til bestemmelse af fastklemning effektivitet.

Nanoliposomer fremstillet ved anvendelse af førnævnte metode udviste en størrelsesfordeling fra 51 − 396 nm og en gennemsnitlig størrelse på 155 nm (tabel 2). Præparatet var homogent, da polydispersitetsindekset var 0,168. En høj indvirknings effektivitet på 83% kan nås, hvis liposomerne ekstruderes gennem en 0,2 μm porestørrelse membran (tabel 2).

Morfologiske nanoliposome egenskaber blev evalueret af SEM. figur 2A, B viser rund formede liposomale vesikler i intervallet 121 nm og analyseres ved 20 kV, hvorimod figur 2C, D udviser utilstrækkeligt Prøver. Nanoliposomer var simpelthen lufttørret uden tidligere fiksering eller anden behandling, der er beskrevet i dette studie. Som følge heraf blev der observeret større og beskadigede vesikler i intervallet 332 μm og analyseret ved 5 kV.

Figure 1
Figur 1: skematisk gengivelse af nanoliposome præparat. DOPE, peg og Chems, de vigtigste Liposom bestanddele, blev først opløst i chloroform for at opnå lipid-filmen (1, 2, 3). Lipid-filmen blev derefter rehydreret i en saltvands buffer, der indeholder det hydrofile protein (Tarin), der skal indlægges, og inkubationen blev udført natten over (4). Derefter blev sonikering og ekstruderingsteknikker anvendt til at generere SUVs (5, 6). Det ultracentrifugering trin adskilte liposomal præparatet fra frie lipider og uindkapslet protein, mens supernatanten blev anvendt til bestemmelse af indvirknings effektivitet (7). Dette tal er blevet ændret fra Correa et al.16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Nanoliposome photomicroskopi af SEM. (A, B) Billeder af runde formede liposomale vesikler i intervallet 121 nm og analyseret ved 20 kV. (C, D) Billeder af utilstrækkeligt tilberedte prøver. Mishandlede prøver tilladt til observation af større og/eller beskadigede vesikler, som ikke kan modstå vakuum-og/eller spændingsforhold ved 5 kV. Dette tal er blevet ændret fra Correa et al.16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Liposome komponenter Vægt (g) Koncentration (mM) Endelige volumen
Dope 0,0420 5,7 10 mL
MPEG 2000-DSPE 0,1059 3,8
Chems 0,0024 0,5

DOPE-1,2-dioleoyl-SN-glycerol-3-phosphoethanolamin); MPEG 2000-DSPE-1,2-distearoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[amino (polyethylenglycol)-2000] (ammoniumsalt); CHEMS-cholesterylhemisuccinate.

Tabel 1: fremstilling af Tarin liposomal nanocapsules.

Membran porestørrelse (μm) Størrelsesfordeling (nm) Gennemsnitlig størrelse (nm) Polydispersitetsindeks (PdI) Peak (nm) Entrapment effektivitet
0,2 51-396 155 0.168 94 ± 39 0,83

Størrelse og polydispersitet indeks blev evalueret af dynamisk lysspredning, mens indkapsling effektivitet blev bestemt i henhold til Peterson17.

Tabel 2: størrelse, polidispersitet indeks, og fastklemning effektivitet af nanoliposome præparat.

Discussion

Den protokol, der er beskrevet heri, blev testet af Correa et al.16 til indkaptningen af Tarin, en immunmodulerende og antitumoralsk lektin renset fra Colocasia Alaria22. Metodologien gav gode resultater og gav mulighed for at fremstilling af stabile nanoliposomer af passende størrelse til terapeutiske anvendelser. Formuleringen præsenterer kontrolleret frigivelse ved forskellige pH-niveauer under fysiologiske forhold. Det potenserer også Tarin farmakologiske egenskaber, såsom hæmning af humane glioblastoma U-87 MG og brystkræft MDA-MB-231 cellelinjer og stimulering af mus knoglemarvsceller. Den liposomale præparat udviste ingen toksiske virkninger i raske mus celler16.

Den klassiske metode, først beskrevet af bangham et al.7, giver mulighed for produktion af store multilamellar Liposom vesikler, heterogene i størrelse og form. Tilpasninger af denne metode, som rapporteret i nærværende undersøgelse, anvendes med succes ved at medtage yderligere trin såsom sonikering og ekstrudering gennem en 0,2 μm polycarbonat membran. Dette gør det muligt at fremstilling af en mere homogen dispersion med hensyn til størrelse i nanometer området16,23,24. For at sikre vellykkede resultater bør den indkapsling og liposomale formulering, der er beskrevet her, derfor følges nøje.

Nanoliposome sammensætning blev omhyggeligt udvalgt for at sikre dannelsen af en tolags membran med dope, MPEG 2000-dspe, og Chems som de vigtigste bestanddele. Disse er naturlige dyr membran tolags bestanddele og sidstnævnte kan give fluiditet til nanoliposome arkitektur, sikre bred anvendelse til bioaktive sammensatte levering i mennesker.

Nanoliposome pegylation er afgørende for at garantere Liposom struktur stabilitet. Fraværet af peg fører til størrelse udvidelse, en høj polydispersitet indeks, og lav fastklemning effektivitet. Optimale resultater kan opnås med dope som den vigtigste Liposom komponent. Men, dette er en høj pris phospholipid. De finansielle omkostninger ved nanoliposome produktion kan opnås ved at erstatte DOPE med andre lignende lipider som DOPC (1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphocholin). Chems er et kolesterol molekyle, der naturligt findes i animalske cellemembraner, som ikke bør udelukkes fra formuleringen, da det er vigtigt at sikre lipidbilayer fluiditet og formbarhed16.

Andre aspekter af indkapsling protokollen kan også tilpasses. Den chloroform, der anvendes til at opløse liposomalkomponenterne, kan let udskiftes med methanol uden påvirkning af gennemsnittet, homogeniteten og effektiviteten af indhalingen. Der kan dog forekomme en vis protein lækage ved opbevaring under 4 °C16. Natten inkubations trinnet med ammoniumsulfat opløsning indeholdende Tarin er ikke obligatorisk; for nemheds skyld kan det dog udføres uden skader på nanoliposomale biofysiske egenskaber, indkapsling eller tab af stabilitets effektivitet, som det fremgår af Correa et al.16. Ekstruderingtrinet udføres ved stuetemperatur, hvilket kan nedsætte strømningshastigheden mellem sprøjterne, hvis der anvendes en pore størrelses membran på 0,1 μm.

For at løse dette problem bør det overvejes at anvende en pore størrelses membran på 0,2 μm eller opvarmning af ekstruder holderen over lipid-overgangs temperaturen. Analytikeren skal passe på ikke at beskadige lipiderne eller proteinet, der kan inaktiveres og miste biologisk aktivitet. Alternativt kan liposomal præparat dialyseres mod HBS i stedet for ultracentrifugering, ved hjælp af en cut-off membran i henhold til protein molekylvægt. Valget af den kemiske karakter af den buffer, hvori nanoliposomer suspenderes efter ultracentrifugering, er direkte relateret til den efterfølgende anvendelse. Da perspektiverne for denne undersøgelse omfatter in vivo og in vitro assays, suspension i HEPES Buffered saltvand var tilstrækkelig til at sikre ingen cytotoksiske virkninger og et pH-interval tæt på fysiologiske forhold.

Liposomer skal behandles fint, svarende til levende celler, for at opnå højere kvalitet SEM billeder. Fikserings-og tørre procedurer er vigtige for at sikre visualisering af mindre intakte vesikler, der under vakuum betingelser understøtter værdier på over 20 kV. Figur 2 A, B viser vesikler i nanostørrelse, der er kompatible med ekstruderingsproceduren. Visualisering af vesikler, der spænder fra 51-396 nm, er muligt, hvis der udføres tilstrækkelig prøveforberedelse efter denne procedure. Trinene omfatter fiksering, tørring ved at øge ethanol koncentrationer, og kemisk dehydreringen for at undgå dannelsen af aggregater og bristede vesikler forårsaget af vakuum og elektronstråle. På den anden side, figur 2C, D viser Liposom vesikler tørret under stuetemperatur og ikke udsættes for nogen behandlinger, der er beskrevet her, hvilket betyder, at de var forberedt utilstrækkeligt. Som følge af den utilstrækkelige procedure dannes der gigantiske vesikler, selv efter ekstrudering gennem en 0,2 μm pore størrelses membran. Der observeres også rupturerede vesikler i begge paneler som følge af vakuum-og elektronstråle skader.

Nanoliposome vesikler er blevet udforsket som et indkapsling og leveringssystem for hydrofobe molekyler, herunder resveratrol (3, 5, 4 '-trihydroxystilbene), en Bioaktiv forbindelse mod kolorektal cancerceller. Indkapsling proceduren kan overvinde den ringe Opløselighed af lipofile forbindelser ud over at give biokompatibilitet, bionedbrydelighed, ikke-immunogenicitet, og ikke-toksicitet egenskaber iboende til fedtstoffer nanocapsules25. Protokol tilpasninger skal tages i betragtning afhængigt af administrationsvej og formål, såsom udvikling af nye Liposom formuleringer til oral administration.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelige for COPPE/UFRJ, elektronisk mikroskopi laboratorium, og flerbruger materialer karakterisering laboratoriefaciliteter; til Dr. Adalberto Vieyra, Dr. Jennifer Lowe og Rafael Lindoso, professorer i Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, til brug for ultracentrifuge; til Dr. Alexandre Guedes Torres og Daniel Perrone, professorer ved Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, til brug af rotationsfordamper; til professor Roland Bodmeier og Dr. Andriy Dashevskiy fra Freie Universität i Berlin, som hjalp med ressourcer, leverede nye metoder og overvågede ACNTF under et 6 måneders Erasmus + stipendium i Tyskland; til Dr. Rossana Thiré og Aline Fernandes, professor og tekniker ved Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, til brug for Zetasizer Malvern; til Bluma Guenther og Taissa Rodrigues, professor og tekniker ved Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, til brug for SEM; til Dr. Rachel Ann Hauser Davis, forsker ved Fundação Oswaldo Cruz, til fortælling. Denne undersøgelse blev delvis finansieret af Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, Brasil (CAPES)-Finans kode 001 (Grant nr. 1627392; 1811605); af Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (Grant nr. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 og E-26/202.860/2016); af Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (Grant nr. 406601/2018-6) og Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich Co A4418
Analitycal Ballance Mettler H10Tw Mettler Inc. 417870
Beckman DU-640 Spectrophotometer Beckman Coulter 8043-30-1090
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich Co 5470
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump Thermo Fischer Scientific 05-001-022PM
CHEMS (cholesterylhemisuccinate) Sigma-Aldrich Co C6512
Chloroform Sigma-Aldrich Co 48520-U CAUTION
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) Sigma-Aldrich Co 209198
Coverslips (13mm diameter) Thermo Scientific Nunc EW-01839-00
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) Lipoid GMBH 565600.1
Ethanol Absolute Sigma-Aldrich Co 32205
Folin -Ciocalteu phenol reagent Sigma-Aldrich Co F9252
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich Co G5882
HEPES Sigma-Aldrich Co H3375
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich Co 440191 CAUTION
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope JEOL LTD
Mini Extruder 7 Avanti Polar Lipids 610000
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) Lipoid GMBH 588200.1
Optima L-90k Ultracentrifuge Beckman Coulter PN LL-IM-12AB
Phosphate Buffer Sigma-Aldrich Co P3619
Poli-L-lysine Sigma-Aldrich Co P8920
Potassium L-tartrate monobasic Sigma-Aldrich Co 243531
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich Co S7795
Sodium chloride Sigma-Aldrich Co S7653
Sodium Deoxycholate (DOC) Sigma-Aldrich Co D6750
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich Co L3771
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich Co S8045
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich Co RES20908-A7
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope Tescan #657874
Trichloroacetic Acid (TCA) Sigma-Aldrich Co 91230
Zetasizer Nano ZSP Malvern Panalytical LTD
Ultrasonic cleaning bath model 2510 Branson

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, X., Wang, Y., Chen, Z. G., Shin, D. M. Advances of cancer therapy by nanotechnology. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 41 (1), 1 (2009).
  2. Keller, B. C. Liposomes in nutrition. Trends in Food Science & Technology. 12 (1), 25-31 (2001).
  3. Frézard, F., Schettini, D. A., Rocha, O. G., Demicheli, C. Lipossomas: propriedades físico-químicas e farmacológicas, aplicações na quimioterapia à base de antimônio. Quimica Nova. 28 (3), 511-518 (2005).
  4. Ferreira, D. dS., Lopes, S. C. dA., Franco, M. S., Oliveira, M. C. pH-sensitive liposomes for drug delivery in cancer treatment. Therapeutic Delivery. 4 (9), 1099-1123 (2013).
  5. Papachristos, A., Pippa, N., Ioannidis, K., Sivolapenko, G., Demetzos, C. Liposomal forms of anticancer agents beyond anthracyclines: present and future perspectives. Journal of Liposome Research. 25 (2), 166-173 (2015).
  6. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
  7. Bangham, A., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), 238-252 (1965).
  8. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4194-4198 (1978).
  9. Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 298 (4), 1015-1019 (1973).
  10. Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid/detergent mixed micelles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 640 (1), 252-262 (1981).
  11. Szebeni, J., et al. Oxidation and denaturation of hemoglobin encapsulated in liposomes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 798 (1), 60-67 (1984).
  12. Coelho, J. F., et al. Drug delivery systems: Advanced technologies potentially applicable in personalized treatments. EPMA Journal. 1 (1), 164-209 (2010).
  13. Pereira, P. R., et al. Purification and characterization of the lectin from taro (Colocasia esculenta) and its effect on mouse splenocyte proliferation in vitro and in vivo. The Protein Journal. 33 (1), 92-99 (2014).
  14. Pereira, P. R., et al. Structural analysis and binding properties of isoforms of tarin, the GNA-related lectin from Colocasia esculenta. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (1), 20-30 (2015).
  15. Pereira, P. R., et al. High-resolution crystal structures of Colocasia esculenta tarin lectin. Glycobiology. 27 (1), 50-56 (2016).
  16. Correa, A., Vericimo, M. A., Dashevskiy, A., Pereira, P. R., Paschoalin, V. M. F. Liposomal Taro Lectin Nanocapsules Control Human Glioblastoma and Mammary Adenocarcinoma Cell Proliferation. Molecules. 24 (3), 471 (2019).
  17. Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
  18. Merida, L. A., et al. Tarin stimulates granulocyte growth in bone marrow cell cultures and minimizes immunosuppression by cyclo-phosphamide in mice. PLoS ONE. 13 (11), e0206240 (2018).
  19. Murtey, M. D., Ramasamy, P. Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy - Life Sciences. Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. Janecek, M., Kral, R. , InTechOpen. (2016).
  20. Andrade, C. A., Correia, M. T., Coelho, L. C., Nascimento, S. C., Santos-Magalhães, N. S. Antitumor activity of Cratylia mollis lectin encapsulated into liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 278 (2), 435-445 (2004).
  21. dos Santos Ferreira, D., et al. Development of a bone-targeted pH-sensitive liposomal formulation containing doxorubicin: physicochemical characterization, cytotoxicity, and biodistribution evaluation in a mouse model of bone metastasis. International Journal of Nanomedicine. 11, 3737 (2016).
  22. Pereira, P. R., Corrêa, A. C. N. T. F., Vericimo, M. A., Paschoalin, V. M. F. Tarin, a Potential Immunomodulator and COX-Inhibitor Lectin Found in Taro (Colocasia esculenta). Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 17 (4), 878-891 (2018).
  23. Olson, F., Hunt, C., Szoka, F., Vail, W., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).
  24. Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods in Enzymology. 367, 3 (2003).
  25. Soo, E., et al. Enhancing delivery and cytotoxicity of resveratrol through a dual nanoencapsulation approach. Journal of Colloid and Interface Science. 462, 368-374 (2016).

Tags

Bioteknik nanopartikler størrelse stabilitet fastklemning effektivitet morfologiske karakterisering bioteknologi Tarin 47 kDa tetrameric protein
Klargøring og karakterisering af Nanoliposomer til Indstødelse af bioaktive hydrofile Gloformede proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Corrêa, A. C. N. T. F.,… More

Corrêa, A. C. N. T. F., Pereira, P. R., Paschoalin, V. M. F. Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins. J. Vis. Exp. (150), e59900, doi:10.3791/59900 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter