Summary
本研究では、ナノリポソーム調製の薄い脂質膜法を用いた古典的な水和を説明し、続いてナノ粒子の特性を説明する。47 kDa親水性および球状タンパク質であるタリンは、安定性を向上させ、速いクリアランスを避け、制御された放出を促進する戦略として正常にカプセル化される。この方法は、疎水性分子カプセル化に適合させることができる。
Abstract
リポソームナノカプセルは、製薬、化粧品、食品業界で多くの目的に適用されています。リポソームの属性は、その生体適合性、生分解性、非免疫原性、非毒性、および親水性化合物および疎水性化合物の両方を捕捉する能力を含む。有機溶媒中の薄脂質膜の古典的な水和は、植物レクチンであるタリンをナノリポソーム中に封入する技術として本明細に適用される。ナノリポソームサイズ、安定性、捕捉効率、および形態特性が詳細に説明される。ナノリポソームは、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)-2000](アンモニウム塩を使用して調製されます。DSPE-MPEG 2000)、及びコレステリルヘミコン酸(CHEMS)を主成分として有する。脂質は、まずクロロホルムに溶解し、その後、一晩閉じ込められ、インキュベートされるタンパク質を含む硫酸アンモニウム溶液中で水分補給される薄い脂質膜を得る。次に、超音波処理および押出技術を適用して、ナノサイズのユニラメラ小胞を生成する。ナノベシクルのサイズと多分散性指数は動的光散乱によって決定され、ナノベシクル形態は走査型電子顕微鏡によって評価される。捕捉効率は、最初にロードされたタンパク質の元の量に対するカプセル化されていないタンパク質の量の比率によって決定される。均質リポソームは、平均サイズ155nmおよび多分散性指数値0.168で得られる。83%の高い封入効率を達成する。
Introduction
近年、効率的な薬物送達システムを調査する研究が増えている。しかし、迅速なクリアランス、生体分布の悪さ、生理的pHの溶解性、細胞の取り込み不足などの限界を超える必要があります。ナノシステムの使用は、がん治療の最近の進歩として出現し、健康な細胞の毒性を最小限に抑えながら、癌細胞内の薬物の細胞内濃度を増加させるために適用される。さらに、異なる範囲の材料(ポリマー、デンドリマー、リポソーム、ウイルス、カーボンナノチューブ、酸化鉄や金などの金属)から得られるナノ粒子は、抗癌効果を高め、全身性を低下させるために現在適用されています。毒性1.特にリポソームナノカプセルは、製薬、化粧品、食品業界において多くの用途に応用されている。近年、リポソーム技術2を用いてビタミン、酵素、ハーブエキスなどの様々な栄養補助食品が配合されている。
リポソームは、水性媒体3、4におけるリン脂質の分散によって自発的に形成される1つ以上の同心性脂質二層体からなる球状小胞である。リン脂質の極性頭部は、水性環境と接触して、膜の外側および内面に位置する。対照的に、脂肪酸鎖は膜の疎水性コアを形成し、水5から保護される。それらを魅力的な薬物送達システムを作るリポソームのいくつかの属性は、それらの生体適合性、生分解性、非免疫原性、非毒性、および親水性化合物および疎水性化合物6の両方を捕捉する能力を含む。
リポソームは、攪拌、超音波処理、押出、凍結、凍結、解凍などの様々なプロセスステップを使用して調製することができます。古典的な方法は、逆相蒸発、溶媒注入、および洗剤透析を含む。最も適用される方法は、薄い脂質膜水和であり、バンガムの方法としても知られており、小胞脂質形態7、8、9、10、11を得るために使用される。ラメラリティ(リン脂質二重層の数)と粒子サイズは、リポソームを1)ユニラメラ小胞(ULV)として特徴付けるために使用される古典的なパラメータであり、ユニークなリン脂質二重層によって形成され、以下のようにサイズが変化する:i)小さなユニラメラ小胞 (SUV, ~0.02-0.20 μm), ii) 大型ユニラメラ小胞 (LUV, ~0.2-1.0 μm), iii) 巨大なユニラメラ小胞 (GUV, >1 μm);または2)マルチラメラ小胞(MML、>0.1 μm)3、12.小胞の大きさは、<200 nmのサイズが内皮バリアを横断し、腫瘍組織に到達することを可能にするのに理想的である癌治療などの治療的使用を考慮する際に重要なパラメータである4。
本明細書において、薄脂質膜技術7の古典的な水和に続く封入手順を、タリンを用いて説明した、親水性球状タンパク質13、14、15として特徴付ける植物レクチン.ナノサイズの小胞は、主な技術に超音波処理および押出工程を含むことによって産生され、その結果、高い捕捉効率を持つ安定したリポソームナノベシクルを得る16。
Protocol
1. タリンリポソームナノカプセルの調製16
注:すべての調製物は、より大きな体積(7 mL)を得て、サンプルが超遠心分離機で遠心分離されることを可能にするために三重に調製する必要があります(下記の詳細を参照)。
- 表 1に示すように、分析バランスを使用してリポソーム成分の重量を量る。
- ロータリーエバポレーターに収まる250mLの体積フラスコを使用してクロロホルムで脂質成分を溶解し、材料の損失を防ぎます。
- 150 rpmで15分間撹拌します。
- 次の条件下でロータリーエバポレータを使用してクロロホルムを除去します。
- 加熱風呂の水と接触しながら、最適な効率のために、体積フラスコ口を標準位置(25°)に調整します。
注:機器アームは、蒸発効率に影響を与えたり、サンプルを損傷したりしない間、体積フラスコと水浴の間の接触を維持するために25°で傾斜する必要があります。標準位置は、機器のブランドによって異なる場合があります。 - コンデンサー温度を最低3°Cに設定します。
- 加熱浴温を40±1°Cに設定します。
- 回転を 120 rpm に設定します。
- 真空を207mbarに調整し、沸点を20°Cに調整します。
- 約25分後、フラスコを取り出し、蒸発した溶媒を捨て、凝縮器に残り、適切に。
注:リポソーム成分からなる薄くて不透明なフィルムは、このステップで形成され、容易に視覚化することができます。凝縮器に残っている蒸発溶媒は、適切な廃棄のために専門会社が取り扱う処分受領者(塩素化)に保管する必要があります。
- 加熱風呂の水と接触しながら、最適な効率のために、体積フラスコ口を標準位置(25°)に調整します。
- 脂質フィルムを水和して、1mg/mLでタリンを含む0.3M硫酸アンモニウム溶液(pH=7.4)で0.01M脂質濃度に達し、最終体積は10mLに達する。
- 混合物を40分間撹拌し、4°Cで一晩インキュベートする。
注: このステップはストップ ポイントと見なすことができます。一晩のインキュベーションは必須ではありません。
- 混合物を40分間撹拌し、4°Cで一晩インキュベートする。
- インキュベーション後、25°C(室温)で1分間懸濁液を超音波処理します。RT)小胞のサイズを減らし、凝集を避けるために。
注:サイズの減少は、次の条件下で超音波超音波装置で行われました:130 Wと40 kHz。 - 0.2 μmのポリカーボネート細孔膜を通して12サイクルの押し出しを行います。
注:押出プロセスの前に、サンプル漏れを避けるために水を使用してミニ押出機アセンブリをテストします。0.1 μmの細孔膜も適しています。この場合、脂質とタンパク質の両方の物理化学的特性を維持しながら、押し出しを容易にするために、脂質転移温度の上にミニ押出器ホルダーを予熱する。- 製造元のマニュアルに記載されているように、ミニ押出機の部品にフィットします。
- ポリカーボネート膜を2つのプレウェットフィルターサポートの間に置き、ホルダーに入れます。
- 1 mLの空の注射器を装置に挿入し、リポソーム懸濁液で他の注射器をその総容積に充填し、反対側に挿入する。
- 0.2 μmのポリカーボネート細孔膜を通して12サイクルの押し出しを行います。サンプルを注射器から別の注射器にゆっくりと押し込みます。予おかされたチューブに押し出された懸濁液を集める。
注:ポリカーボネート膜は、あるシリンジから別のシリンジへのサンプル転移が困難になった場合にのみ交換する必要があります。リポソームサスペンションは、SUVの形成によるサイズ縮小の結果として押し出しプロセス中に明確になる必要があります。このステップでは、サンプルの約0.2 mLが失われる可能性があります。
- 超遠心分離により別々のリポソームを分離する。
注:超遠心分離機を使用する準備ができるまで、氷浴でサンプルを維持します。スイングバケットローターを備えた超遠心分離機を用いた超遠心分離による残りのコンポーネントと硫酸アンモニウムを分離します(下記の詳細を参照)。- ローターに合うチタンチューブでサンプルを計量し、チューブのバランスをとります。チューブの損傷を防ぐために使用されるローターに従って必要な最小体積を確認し、必要に応じて硫酸アンモニウムでリポソーム懸濁液量を調整します。
注:遠心分離機の外側では、回転速度を決定するために遠心分離機で使用される「シマウマストライプ」(底部の黒と白のストライプ)を傷つけないように、スイングバケットは常にスタンドでサポートする必要があります。 - 遠心分離機を使用する前に真空をオンにして、冷蔵できるようにします。
- チタンチューブをスイングバケツに取り付けます。
注:チューブを走行時に想定する位置に持ち上げて、完全にフィットしていることを確認します。 - 真空を離し、遠心分離機のドアを開け、ローターを中に入れます。
注:ローターの底面の円マークに注意してください。 - 遠心分離機のドアを閉じ、真空を押し、真空が200から<20ミクロンまたは26 Paから<3 Paに達するまで待ちます。
- 超遠心分離機ディスプレイのパラメータを150,000 x g(前述のスイングバケットの29,600 rpmに相当)に4°C(加速度:最大、減速:最大)で90分間調整します。
注: 特定の遠心分離機が rpm に設定されている場合は、常に速度を x gに変換します。遠心分離機のウェブサイトを使用して、使用するローターに従ってユニットを変換します。 - [リコール] を押し、条件を確認し、[開始] を押して実行します。
注: 遠心分離機が目的の速度に達するまで待ちます。 - 90分後、真空ボタンを押して真空を解放し、真空が200-700ミクロン(26-93 Paに相当)に達したときに遠心分離機のドアを開きます。
- 遠心分離機を切り、内側からローターを取り外し、バケツを乾かしてベンチに置きます。
- 氷の上に超遠心サンプルを維持します。
- ローターに合うチタンチューブでサンプルを計量し、チューブのバランスをとります。チューブの損傷を防ぐために使用されるローターに従って必要な最小体積を確認し、必要に応じて硫酸アンモニウムでリポソーム懸濁液量を調整します。
- 慎重に、上清とペレットを分離するために使い捨て15 mL遠心管にチューブを逆さまにすることによって、ペレットから上清を分離します。
注:封入されていないタンパク質を含む上清を4°Cに保管してください。カプセル化の効率を決定するために使用されます。ペレットは半透明のゼリーとして現れる。 - HEPES緩衝生理生理中の封入タンパク質を含むペレット(1x HBSの3mL)を中断する。
注:HBS 2x(ストック溶液)は、蒸留水中の試薬の次の量を希釈することによって調製されます:140 mM NaCl、1.5 mM Na2HPO 4、50 mM HEPES、その後、pHを7.4に調整し、最終容積を100mLにします。Na2HPO4は、リポソーム濃度が決定される場合に干渉を避けるためにNaHCO3に置換することも、干渉を避けるために省略することもできる。 HBS 2xストック溶液は、使用前にHBS 1xを得るために蒸留水中で希釈する必要があります。
2. カプセル化効率
注:タンパク質定量における脂質干渉を回避するために、Petersonのプロトコル17を使用してカプセル化効率を決定する。すべてのサンプル(BSA規格およびリポソーム上清)は三重で分析されるべきである。また、ブランクチューブを準備します。
- ストック試薬および作業ソリューションの調製17
- ストック試薬の場合は、炭酸ナトリウム20%の10mL、硫酸銅0.1%の200μL、200 μLの0.2%の硫酸カリウムを9.6mLの蒸留水で混合して、炭酸銅(CTC)を調製します。10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)および0.8N水酸化ナトリウム(NaOH)の100 mLを調出します。
- 作業溶液の場合は、デオキシコレートナトリウム(DOC)および72%トリクロロ酢酸(TCA)の10 mLを調記します。10mLの蒸留水にウシ血清アルブミン(BSA)を10mgを溶解し、1mg/mL標準溶液を得た。CTC、NaOH、SDS、およびH2 Oの等しい部分を加えて試薬Aを調製し、蒸留水中にフォリン・シオカルテウ・フェノール試薬1:5を希釈して試薬Bを調製する。
注:試薬Aは各反応管に対して1mLを必要とし、試薬Bは0.5mLを必要とする。試薬AおよびBの最終容積を決定するには、まず使用する反応管の数を定義し、三量三極内のBSA、ブランク、およびサンプルの3つの異なる濃度を考慮します。試薬Aは、使用前に十分に均質化されなければならず、25°C(RT)で2週間保存することができます。試薬Bは、琥珀色のボトルに保存した場合も25°C(RT)で安定である。
- 沈殿 物
注:このステップはマイクロ遠心管で行われる。- 5-100 μgのタンパク質を含む1 mLの最終容積に水でリポソーム上清を希釈します。
注:ブランクチューブは、蒸留水の1 mLで満たされるべきです。 - 0.15%DOCの0.1 mLを加え、渦によって均質化し、RTで10分間インキュベートする。
- 72% TCA の 0.1 mL を追加し、よく混ぜ、遠心分離機を 3,000 x gと RT で 15 分間追加します。
注:DOC-TCAはタンパク質沈殿を促進し、2つの異なる相を形成する。標的タンパク質は遠心分離によって回収することができ、脂質の干渉を回避する。 - チューブを下方に置き、吸収性の紙の上に置くことによって、慎重に上清を廃棄します。後続のステップのペレットを保存します。
注:ペレットは見えにくいかもしれませんが、目に見えない場合でもチューブを逆さまにする必要があります。
- 5-100 μgのタンパク質を含む1 mLの最終容積に水でリポソーム上清を希釈します。
- 分光光度計
- ステップ2.2.4から得られたペレットを1mLの蒸留水に吊り下します。ペレットが溶解していることを確認し、新しい試験管にサンプルを転送するために完全に混合します。
- アルブミン(BSA)規格の希釈を最終容積1mLに調剤する。
注: タンパク質規格は、5~100 μg/mLの間で調製する必要があります。 - ステップ2.3.1および2.3.2からチューブに試薬Aの1 mLを例外なく加え、よく混ぜ、RTで10分間インキュベートします。
注:SDSはタンパク質の可溶化を助けながら、可能な脂質の干渉を緩和することができます。 - ステップ2.3.1および2.3.2からチューブに試薬Bの0.5 mLを加え、よく混ぜ、光から保護しながらRTで30分間インキュベートします。
注:Follin-Ciocalteuフェノール試薬は、タンパク質などのいくつかの窒素含有化合物の着色アッセイに使用されるホスモリブデートとホスホトンステートの混合物です。銅の複雑化は、この試薬に向かってフェノールの反応性を増加させ、タンパク質濃度に応じて青/紫色の複合体を生成します。 - 分光光度計を使用して750nmの吸光度を決定します。
- 標準曲線に基づいて上清中のタンパク質濃度を以下のように算出する。
- 線形傾向線を考慮して角度係数(k)を得るために吸光度値(Abs)対BSA濃度(mg/mL)をプロットする。
- 上清タンパク質濃度(C)を吸光度値と角係数(k)の比率で決定し、次のように総体積を掛けます。
- 次の式に従ってカプセル化の効率を決定します。
- ここで、読み込まれたタンパク質=10mg、非カプセル化タンパク質=ステップ2.3.6.2で得られたCの値。
注:この場合、硫酸アンモニウム溶液に溶解した合計10mgのタリン(1mg/mL)を用いて封入手順を行い、この濃度はインビトロ効果13、16で満足のいく得られるのに十分であるので、 18.
3. サイズと安定性の決定
注:リポソーム製剤のサイズ分布およびポリ分散指数(PdI)は、動的光散乱(DLS)によって評価される。0.1 に近い PdI は、均質な調製を示します。安定性の決定のために、リポソームを4°Cで保存し、サイズ分布とサイズ平均を定期的にチェックします。
- レーザーランプをウォームアップする前に、DLS機器の電源を30分オンにします。
- ステップ1.10で得られたリポソーム製剤を使い捨てサイジングキュベットに移す。
- 装置パラメータを次のように設定します: 分散型 = 水 (RI = 1.33)。材料 = 脂質 (RI = 1.45);とRT。
- [開始] を押して、機器が読み取りを終了する間待ちます。
- キュベットを取り外し、機器の電源を切ります。
注:後続の分析のために、キュベットから使い捨て15 mL遠心チューブにサンプルを戻すか、新しい読み取りに十分な量がある場合は廃棄してください。
4. 形態学的特徴付け
注:リポソームの特徴付けは、ムルテイとラマサミー19に従って行われます。ステップ1.10で得られたナノリポソームを含む試料は、三分三で調製される。
- ガラスカバーリップ(直径13mm)を両面テープでペトリ皿の底面に固定します。テープを小さく切り(カバースリップを固定するのに適したサイズ)、下の保護紙を取り外し、ペトリ皿の底に固定します。ピンセットの助けを借りて、テープの上に保護紙を取り外し、その上にカバースリップを修正します。
注: 次の手順では、カバースリップを解放せず、強力なテープを使用しないように注意してください。 - カバーをポリL-リジンでコーティングします。水分を維持するためにペトリ皿の中に濡れフィルターペーパーを置き、RT(25°C)で1時間インキュベートします。
- コーティング後、カバースリップを蒸留水ですすいでください。
- ステップ1.10からサンプルの滴でカバーリップを充填し、RTで1時間乾燥させます。
- サンプルを固定するには、0.1 Mリン酸バッファー、pH = 7.2で調製した4%グルタルアルデヒドでそれらをカバーします。ペトリ皿の中に濡れフィルターペーパーを入れ、水分レベルを維持するために皿を密封します。4°Cで48時間インキュベートします。
- 同じリン酸バッファーでカバースリップを3x5分間すすいで下します。
- 以下のようにサンプルを脱水:35%エタノール1x15分、15分間50%エタノール1x、15分間75%エタノール1x、15分間95%エタノール2x、20分間の絶対エタノール3x。
- ヘキサメチルジラザン(HMDS)の1−2 mLに浸漬2xでサンプルを化学的に乾燥させます(HMDS)。
注:HMDSは、ヒュームフード内で慎重に操作する必要があります。サンプルは、デシケータ内またはRTのヒュームフード内で一晩乾燥させるべきです。 - 乾燥したサンプルを炭素伝導粘着テープでスタブに取り付けます。
- 金パラジウムの電気伝導層(厚さ20nm)を有する真空中のカバースリップの表面をスパッタする。
- 低真空モードおよび低電圧(20 kV)で走査型電子顕微鏡(SEM)で画像を記録します。
Representative Results
図1は、ナノリポソーム調製物16、20、21を記載する。リン脂質、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)-2000] (アンモニウム塩;DSPE-MPEG 2000)と、主なリポソーム成分であるコレステリルヘミコン酸(CHEMS)と、まずクロロホルムに溶解し、脂質膜を得た。次いで脂質膜を包入する親水性タンパク質(タリン)を含む硫酸アンモニウム溶液中に再水和し、インキュベーションを一晩行った。次に、超音波処理および押出技術を適用し、小さなユニラメラ小胞を生成した。超遠心分離工程では、リポソーム製剤をフリー脂質および封入されていないタンパク質から分離し、上清は捕捉効率の決定に使用した。
前述の方法論を用いて製造されたナノリポソームは、51−396nmおよび平均サイズ155nm(表2)の範囲のサイズ分布を示した。多分散指数は0.168であったので、調製は均質であった。リポソームが0.2 μmの細孔サイズの膜を通して押し出された場合、83%の高い捕捉効率に達することができます(表2)。
形態学的ナノリポソーム特性をSEM.図2Aで評価し、Bは121nmの範囲で円形のリポソーム小胞を表示し、20kVで分析したのに対し、図2C,Dは不十分に調製された。サンプル。ナノリポソームは、本研究に記載された以前の固定または他の治療なしに単に空気乾燥した。その結果、332μmの範囲でより大きく損傷した小胞を5kVで分析し、観察した。
図1:ナノリポソーム調製の概略表現。ドープ、PEG、およびCHEMSは、主なリポソーム成分を、まずクロロホルムに溶解し、脂質膜(1,2,3)を得た。次いで脂質膜を、閉じ込める親水性タンパク質(タリン)を含む生理塩基バッファーに再水和し、インキュベーションを一晩行った(4)。次に、超音波処理および押出技術を適用してSUV(5,6)を生成した。超遠心分離工程では、リポソーム製剤をフリー脂質および封入されていないタンパク質から分離し、一方、上清は捕捉効率の決定に用いた(7)。この図は Correa ら16から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:SEMによるナノリポソーム光顕微鏡検査。(A, B)121nmの範囲の円形リポソーム小胞の画像を20kVで分析した。(C, D)不十分に準備されたサンプルのイメージ。5kVで真空および/または電圧条件に抵抗できない大きな小胞および/または損傷した小胞の観察のために許可された不当処理されたサンプル。この図は Correa ら16から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| リポソーム成分 | 重量(g) | 濃度(mM) | 最終巻 |
| ドープ | 0.0420 | 5.7 | 10 mL |
| MPEG 2000-DSPE | 0.1059 | 3.8 | |
| ケムズ | 0.0024 | 0.5 |
DOPE - 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホエタノールアミン);MPEG 2000-DSPE - 1,2-ジステアロイル-snグリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ(ポリエチレングリコール)-2000](アンモニウム塩);CHEMS – コレステリルヘミスチン酸塩.
表1:タリンリポソームナノカプセルの調製。
| 膜細孔サイズ(μm) | サイズ分布 (nm) | 平均サイズ (nm) | 多分散指数(PdI) | ピーク (nm) | エントラップ効率 |
| 0.2 | 51 - 396 | 155 | 0. 168 | 94 ± 39 | 0.83 |
サイズおよび多分散性指数は動的光散乱によって評価され、一方、カプセル化効率はPeterson17に従って決定された。
表2:ナノリポソーム調製のサイズ、ポリ分散指数、及び捕捉効率。
Discussion
本明細書に記載のプロトコルは、コロカシア・エスキュレンタ22から精製された免疫調節および抗腫瘍レクチンを封入するためにCorreaら16によって試験された。この方法論は成功した結果をもたらし、治療用途に適したサイズの安定したナノリポソームの製造を可能にした。製剤は、生理学的条件下で異なるpHレベルで制御放出を提示する。また、ヒト神経膠芽腫U-87 MGおよび乳癌MDA-MB-231細胞株の阻害およびマウス骨髄細胞の刺激などのタリン薬理学的特性を増強する。リポソーム製剤は、健康なマウス細胞16において毒性作用を示さなかった。
Bangham et al.7によって最初に説明された古典的な方法は、大きなマルチラメラリポソーム小胞の生産を可能にし、サイズおよび形状が不均一である。本研究で報告されているように、この方法の適応は、0.2 μmのポリカーボネート膜を通る超音波処理および押出などの追加ステップを含むことで正常に適用される。これは、ナノメートルの範囲16、23、24のサイズに関するより均質な分散の生産を可能にする。したがって、成功した結果を確実にするために、ここで説明する封入プロトコルおよびリポソーム製剤は厳密に従うべきである。
ナノリポソーム組成物は、DOPE、MPEG 2000-DSPE、およびCHEMSを主成分として二層膜の形成を確実にするために慎重に選択した。これらは自然な動物膜二層成分であり、後者はナノリポソームアーキテクチャに流動性を与えることができ、ヒトにおける生理活性化合物送達のための広範な適用を保証する。
ナノリポソームペギル化は、リポソーム構造安定性を保証するために不可欠です。PEGの不在はサイズの拡大、高い多分散率および低い捕獲効率につながる。最適な結果は、主なリポソーム成分としてDOPEを使用して得ることができる。しかし、これは高コストのリン脂質である。ナノリポソーム産生の財政的コストは、DOPC(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)などの他の同様の脂質とDOPEを置き換えることによって達成することができます。CHEMSは、動物細胞膜に自然に見出されるコレステロール分子であり、これは製剤から除外してはならないが、脂質二重層の流動性および可鍛性16を確保することが重要であるからである。
カプセル化プロトコルの他の側面も適応できます。リポソーム成分を溶解するために使用されるクロロホルムは、サイズ平均、均質性、および捕捉効率に影響を与えなく、メタノールに容易に置き換えることができます。しかし、いくつかのタンパク質漏出は、4 °C16の下の貯蔵で発生する可能性があります。タリンを含む硫酸アンモニウム溶液による一晩のインキュベーションステップは必須ではありません。しかしながら、便宜上、Correaら16によって実証されるように、ナノリポソーム生物物理学的特性、カプセル化、または安定性効率の損失に損傷を与えなく行うことができる。押出工程は室温で行われ、0.1 μmの細孔サイズの膜を使用すると、シリンジ間の流量を減少させることができる。
この問題を克服するために、0.2 μmの細孔サイズの膜の使用または脂質転移温度の上の押出器ホルダーの加熱を考慮する必要があります。アナリストは、不活性化され、生物学的活性を失う可能性のある脂質やタンパク質を損傷しないように注意する必要があります。あるいは、リポソーム調製物は、超遠心分離の代わりにHBSに対して透析することができ、タンパク質分子量に応じてカットオフ膜を用いることができる。超遠心分離後にナノリポソームが懸濁されるバッファーの化学的性質の選択は、その後の適用に直接関連する。本研究の視点はインビボおよびインビトロアッセイに含まれるため、HEPES緩衝生理生理中の懸濁液は、細胞毒性作用を全く確保し、生理学的条件に近いpH範囲を確保するのに十分であった。
リポソームは、生細胞と同様に細かく処理し、より高品質のSEM画像を得る必要があります。固定および乾燥手順は、真空条件下で20kV以上の値をサポートする小さな無傷の小胞の視覚化を確保するために重要です。図 2A、Bは押し出しプロシージャと互換性があるナノサイズの小胞を表示する。この手順に従って十分なサンプル調製を行えば、51~396nmまでの小胞の可視化が可能である。ステップには、固定、エタノール濃度の増加による乾燥、真空および電子ビームによって引き起こされる凝集体および破裂した小胞の形成を避けるために化学脱水が含まれる。一方、図2C,Dは、室温下で乾燥したリポソーム小胞を示し、ここで説明する治療を受けていない、不十分に調製されたことを意味する。 不十分な手順の結果として、0.2 μmの細孔サイズの膜を押し出した後でも、巨大な小胞が形成される。破裂した小胞は、真空および電子ビーム損傷の結果として両方のパネルでも観察される。
ナノリポソーム小胞は、大腸癌細胞に対する生理活性化合物であるレスベラトロール(3,5,4'-trihydroxystilbene)を含む疎水性分子の封入および送達システムとして探索されてきた。封入手順は、生体適合性、生分解性、非免疫原性、およびリポソームナノカプセル25に固有の非毒性特性を提供することに加えて、親油性化合物の不溶解性を克服することができる。プロトコル適応は、経口投与のための新しいリポソーム製剤の開発など、投与経路および目的に応じて考慮されなければならない。
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者は、COPPE/UFRJ、電子顕微鏡検査研究所、およびマルチユーザー材料特性分類実験室施設に感謝しています。アダルベルト・ヴィエラ博士、ジェニファー・ロウ博士、ラファエル・リンドソ大学教授に対し、ブラジルのUFRJ大学の教授は、超遠心分離機の使用を行いました。アレクサンドル・ゲーデス・トーレス博士とダニエル・ペローネ博士に、ロータリーエバポレーターの使用のために、ブラジルのUFRJであるリオデジャネイロ大学の教授たち。ベルリンのフリー大学のローランド・ボドマイヤー教授とアンドリー・ダシエフスキー博士に、資源を手伝い、新しい方法論を提供し、ドイツでの6ヶ月間のエラスムス+フェローシップの間にACNTFを監督しました。ロッサナ・ティレ博士とアライン・フェルナンデス博士、ゼータサイザー・マルバーンの使用のために、ブラジルのUFRJ、リオデジャネイロ大学の教授と技術者に。ブルマ・グエンターとタイサ・ロドリゲス、ユニバーシダーデ連邦ド・リオデジャネイロ、UFRJ、ブラジルの教授と技術者に、SEMの使用のために;ナレーションのために、ファンダサン・オズワルド・クルスの研究者、レイチェル・アン・ハウザー・デイビス博士に。この研究は、一部は、Coordenaçãoデアペルフェイソアメントメントデペッソアルデニヴェルスーペリア、ブラジル(CAPES)- 財務コード001(助成金番号1627392;1811605)によって資金を調達しました。フンダサン・カルロス・シャガス・フィリョ・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・ド・リオデジャネイロ(FAPERJ)(助成金No.E-26/202.815/2018;E-26/202.815/2018;E-26/203.039/2015およびE-26/202.860/2016);コンセルホ・ナシオナル・デ・デセンボルヴィメント・シエンティフィコ・エ・テクノロジコ(CNPq)(助成金第406601/2018-6)、フィナンシアドラ・デ・エストゥトス・エ・プロジェトス(FINEP)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
| Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
| Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
| BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
| CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
| Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
| Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
| DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
| Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
| Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
| JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
| Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
| Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
| Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
| Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
| Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
| TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
| Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
| Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
| Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |
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