Summary
מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור את הדינמיקה לוקליזציה של חלבון subcellular ולנטר שינויים מורפולוגיים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה ב subtilis מקרתגו ו סטיילוולוקוקוס.
Abstract
חקירות של גורמים המשפיעים על חלוקת תאים וצורת תא בחיידקים מבוצעים בדרך כלל בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה כמו תצפיות שנעשו ברמת האוכלוסייה לא באמת לשקף את מה שמתרחש ברמת תא בודד. המיקרוסקופיה מאפשרת לחוקרים לפקח על השינויים במחלקת התאים או במבנה התא המספקים תובנות יקרות לגבי לוקליזציה תת-תאית של חלבונים ותזמון של ביטוי גנטי, כפי שקורה, כדי לסייע במענה לשאלות ביולוגיות חשובות. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו כדי לפקח על שינויים פנוטיאריים בתוך מקרתגו subtilis ו סטיילוקוקוס האורלנו באמצעות מיקרוסקופ לפירוק ברזולוציה גבוהה. מטרת דו ח זה היא לספק פרוטוקול פשוט וברור שניתן לאמץ על ידי חוקרים אחרים המעוניינים לבצע ניסויים מיקרוסקופ פלואורסצנטית ללמוד תהליכים ביולוגיים שונים בחיידקים, כמו גם אורגניזמים אחרים.
Introduction
התחום של ביולוגיה של התא בקטריאלי הופרה באופן משמעותי על ידי הפיתוחים האחרונים של טכניקות מיקרוסקופ1,2. בין השאר, מיקרוסקופים המסוגלים לבצע ניסויים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית נותרים הם כלי רב ערך. החוקרים יכולים לפקח על אירועים פיזיולוגיים שונים בזמן אמת באמצעות חלבונים פלורסנט כגון, חלבון פלורסנט ירוק (GFP) מבוסס הכתב fusions העיתונאי, פלורסנט D-אמינו חומצות (FDAA)3, או להשתמש כתמים אחרים עבור תיוג קיר התא, קרום DNA. לכן אין שום הפתעה כי מיקרוסקופ הזריחה נשאר פופולרי בקרב ביולוגים תאים מיקרוביאלית. בנוסף פשוט מציג את הפנוטיפים הסוף, מתן מידע לגבי איך פנוטיפים נצפו להתעורר באמצעות מיקרוסקופ tim, יכול להוסיף ערך משמעותי לממצאים ולהציע רמזים לגבי מה התהליכים הסלולריים מיועדים על ידי מועמדים לסמים פוטנציאליים4.
הפרוטוקולים לביצוע הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ במלואו, הפוך, הפוכה השדה הרחב (לראות את הטבלה של חומרים) מסופקים במאמר זה. פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים כדי להתאים את הצרכים של מיקרוסקופים פלואורסצנטית אחרים אשר מסוגלים לנהל מיקרוסקופ שחלוף. למרות שהתוכנה שנדונה כאן מתאימה לתוכנה הספציפית שסופקה על-ידי היצרן כפי שמצוין בטבלת החומרים, תוכנה המסופקת בדרך כלל על-ידי יצרני מיקרוסקופ אחרים או imagej5הזמינים באופן חופשי, יש כלים שווי-ערך לניתוח נתוני מיקרוסקופ. לתנאים שבהם המשך הזמן אינו תורם, ניתן לערוך ניסויים במהלך הקורס כמתואר במאמר זה. הפרוטוקולים המתוארים כאן מספקים מדריך מפורט כדי ללמוד את השינויים הפנוטיניים בשני זנים חיידקיים שונים: B. subtilis ו -S.. שנינו ראה שולחן 1 עבור זנים המשמשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תנאי גדילה כלליים
- האיחסן 2 מ ל של בינוני הצמיחה המתאים יושלם עם אנטיביוטיקה (במידת הצורך) עם מושבה אחת של הזנים (s) להיות בתמונה. לילה ב -22 ° c באינקובטור רועד.
הערה: תנאי הגדילה החיידקיים הספציפיים המשמשים במאמר זה מסופקים תחת סעיף התוצאות המייצג. - לדלל תרבויות לילה 1:20 במדיה טרייה בבקבוקון 125 mL, תוספת עם אנטיביוטיקה (כאשר נדרש).
- הגדל תרבות (ים) ב-37 ° c באינקובטור רועד עד לשלב האמצע לוגריתמי (OD600 = 0.5).
הערה: ניתן להוסיף השראה או מעכבי ישירות לתרבות הגוברת בשלב הגדילה המתאים. - מסיק תאים בתנאי התרבות הרצויים להכנה לדוגמא מיקרוסקופית כמתואר בסעיף הבא.
2. הכנה לדוגמא
- הכינו 1% agarose על-ידי שילוב 0.25 g של כיתה בביולוגיה מולקולרית, EEO נמוכה, agarose עם 25 מ ל של גידול בינוני בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה (במידת הצורך) עבור מיקרוסקופ או מים סטרילי. לחמם את התערובת בעזרת מיקרוגל עבור כ 30 s ויוצקים אותו לתוך סטרילי 100 mm x 15 מ"מ צלחת פטרי ולתת לו לגבש.
- קח 5 – 50 μL הנורית של תרבות התא בהתאם לצורך ולהכתים את התאים. כתם תאים עם צבעים מתאימים בשלב זה (למשל, להוסיף צבען פלורסנט FM4-64 (כתם ממברנה) לניסוי (איור 1)).
- פיפטה 5 μL של מדגם התרבות או דגם מוכתם כדי להיות מיוצג על החלק התחתון של 35 מ"מ זכוכית מתחת לקערת התרבות (עם קוטר 14 מ"מ למיקרוגל ולא מצופה No. 1.5 שמיכות; לראות את הטבלה של חומרים).
התראה: אין להשתמש בכיסויים של פולי-L-ליזין מצופים במיוחד עבור מיקרוסקופ מחדש כאשר הם יכולים לגרום לדפוס גדילה שונה (ראינו זאת עם פולי-D-ליזין כמו גם; נתונים לא מוצגים) ו/או להשפיע על הדינמיקה חלבון6. - כדי למזער את השימוש בצבעים, כתם 3 – 4 μL תא השעיה (שנקטפו ב-OD600 = 0.5; כ 2.7 x 107 ו 3.4 x 107 עבור B. subtilis ו -S. האורלנו בהתאמה לתרבות 1 מ ל) ישירות על המנה התחתונה זכוכית.
- המקום לוח מראש לחתוך הפרה (11 מ"מ בקוטר או של כל גודל רצוי לחפוף את האזור של coverslip; לגזור באמצעות הקצה הפתוח של צינור סטרילי או סכין גילוח) על גבי המדגם בעדינות להקיש כדי לוודא את הלוח הצמח הוא שוכב שטוח נגד coverslip.
- פיפטה 5 μL של מדגם התרבות או דגם מוכתם כדי להיות מיוצג על החלק התחתון של 35 מ"מ זכוכית מתחת לקערת התרבות (עם קוטר 14 מ"מ למיקרוגל ולא מצופה No. 1.5 שמיכות; לראות את הטבלה של חומרים).
- בעקבות הדמיה (ראה בסעיף הבא), אם מספר התאים בשדה התצוגה לא רצוי, להתאים את צפיפות התא של המדגם באמצעות דילול או ריכוז על ידי צנטריפוגה ולשנות את היחס של תאים במדגם באמצעות הצמיחה בינונית/מאגר לפי הצורך.
הערה: כדי למזער את הקרינה האוטומטית הנובעת ממדיום התרבות, ניתן לשטוף את התאים במאגר (לדוגמה בתמיסת מלח באגירה סטנדרטית של 1 x פוספט) ולהשעות מחדש את כמות המאגר המתאימה לפני ההדמיה. ייתכן כי בשלב זה תאים קטנים או שלפוחיות לא יכול להישמר לאחר צנטריפוגה ולכן יאבדו. - להוסיף מים באמצעות פיפטה (~ 5 μL) לחלל בתוך התבשיל תרבות (סביב שמיכות) כדי למנוע את משטח agarose מייבוש, וכלה לסייע לשמור על לחות במהלך רכישת תמונה, במיוחד עבור ניסויים בזמן אמת.
- אפשר מנות תרבות כדי להתמצא בטמפרטורה בתוך חדר הדגירה, תא אטום מובנה המסופק על ידי היצרן, של המיקרוסקופ עבור 15 – 20 דקות.
הערה: הפעל את אלמנט החימום והגדר את חדר הדגירה לטמפרטורה הרצויה מספר שעות לפני ההדמיה. הדבר יבטיח כי החומרה מייצבת לטמפרטורה החדשה. להדמיה ממושכת, מניחים גביע או בקבוקון עם מים בתוך תא המיקרוסקופ, הרחק מאזור העבודה, כדי לשמור על הלחות.
3. הדמיה
- , ביום הניסוי. הפעל את מערכת המיקרוסקופ הפעל את תוכנת הדימות (ראה טבלת חומרים) על-ידי לחיצה על הסמל המתאים בשולחן העבודה. אתחל את המיקרוסקופ על-ידי לחיצה על האפשרות ' אתחל מיקרוסקופ ' (כפתור המתואר במיקרוסקופ) על תיבת ההפעלה של התוכנה. ודא כי המטרה היא הורדה מלאה באמצעות התאמת מיקרוסקופ גס לפני אתחול.
הערה: לאחר אתחול שלוש תיבות דו-שיח נוספות אמורות להופיע בנוסף לתפריט ההתחלה: resolve3D, איסוף נתונים וצג המסננים. - מניחים טיפה של 1.517 (מדד השבירה) שמן על המטרה טבילה 100x שמן שסופקו על ידי היצרן (הצמצם נומרי = 1.4, מרחק עבודה = 0.12 מ"מ; ראה טבלת חומרים).
הערה: חשוב לבחור את שמן הטבילה המתאים לטמפרטורה שבה מתנהל ההדמיה. - לטעון את המנה התחתונה הזכוכית המכילה דגימה לתוך המגורים מתכת (ארון הקבורה) ולהחליק בעדינות לתוך מהדק הבמה.
- השתמש בכפתור הכוונון הגס כדי להעלות את המטרה עד שהשמן יוצר מגע עם תחתית הזכוכית של המנה. השתמש בחתיכת העין כפתור התאמה עדין כדי להביא את המדגם לפוקוס. לאחר התאים נמצאים בפוקוס להפוך את הכפתור מתוך פיסת העין למצב המצלמה על ידי הזזת מתג בורר ממוקם בחזית הגוף המיקרוסקופ משמאל.
- התחל בניסוי באמצעות תוכנת הדימות. בחלון resolve3D , בחר בסמל הניסיון/הפעל את התמונה המתוארת בבקבוקון. תיבת דו-שיח חדשה אמורה להופיע כניסוי עיצוב/הפעלה.
- הגדר את מספר המחסניות Z ואת עובי הדגימה באמצעות העיצוב ולאחר מכן החלק את הכרטיסיה בתיבת הדו של ניסוי העיצוב/הפעל .
הערה: עבור הניסויים בסעיף התוצאות המייצג, 17 Z-ערימות בשעה 200 ננומטר מרווח לתמונות סטילס וארבע הערימות ב 200 מרווח nm עבור מיקרוסקופ הזמן שימשו. - כדי למדוד את עובי התאים במדגם, התאם ידנית את מישור Z בהפרש קבוע באמצעות החצים למעלה ולמטה בתיבת הדו resolve3D . סמן היכן שהתאים מיוצאים לפוקוס כמגבלה העליונה והנמוכה ביותר עבור רכישת תמונה. יבא מידע זה לפני הפעלת הניסוי.
- כדי לסייע במזעור הרעילות והפחתת התמונות במהלך הדמיה, הפחת את מספר ה-Z-ערימות ובחר את המישור האמצע של התאים עבור רכישת תמונה.
- הגדר את מספר המחסניות Z ואת עובי הדגימה באמצעות העיצוב ולאחר מכן החלק את הכרטיסיה בתיבת הדו של ניסוי העיצוב/הפעל .
- בחר בערכת הסינון המתאימה לניסוי באמצעות העיצוב ולאחר מכן הכרטיסיה ערוצים בתיבת הדו התנסות בעיצוב/הפעלה (tritc: EX 542/27; EM 597/45; לשעבר FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
- כמו כן, בחר הפניה לאוסף של מידע POL/DIC. כוונן את שידור האחוזים (עוצמת אור) ואת משך החשיפה עבור ערוצים בודדים שנבחרו לפני הדמיה על-ידי בחירת האפשרויות המתאימות בתיבת הדו resolve3D .
הערה: בשדה בדיקה של תצוגה שאינו נחשב למבחן הניסוי הגדרות אלה כדי לזהות אם הפרמטרים שנבחרו משיגים נתוני קרינה בעלי משמעות מבלי להחסיר אות חלש או לחזק אותו. לאחר מכן יבא פרמטרים אלה עבור הערכה הניסיונית.
- כמו כן, בחר הפניה לאוסף של מידע POL/DIC. כוונן את שידור האחוזים (עוצמת אור) ואת משך החשיפה עבור ערוצים בודדים שנבחרו לפני הדמיה על-ידי בחירת האפשרויות המתאימות בתיבת הדו resolve3D .
- פתח את רשימת הנקודות על-ידי בחירה בלחצן רשימת הנקודות בתיבת הדו resolve3D . תיבת דו-שיח חדשה אמורה להופיע ברשימת נקודותזכאי. סמן מספר שדות תצוגה שישמשו בניסוי על-ידי איתור שדות התצוגה המתאימים באמצעות הפקדים של שלב המיקרוסקופ ובחירה באפשרות נקודת סימון בתיבת הדו רשימת נקודות.
הערה: יש לבחור נקודת החלפה בכל פעם שהמיקרוסקופ ממוקד מחדש בנקודה ברשימת הנקודות. ניתן לעשות זאת על-ידי התמקדות במיקרוסקופ בנקודה המתאימה ברשימה ולאחר מכן בחירה בלחצן נקודת החלפה . חשוב לא לגעת בכפתור הכוונון האנלוגי/דק כאשר מתמקדים מחדש; השתמש רק בתוכנה כדי לכוונן את המוקד. - קבע את הפרמטרים להפעלה על-ידי בחירת העיצוב ולאחר מכן הכרטיסיה מחלוף בתיבת הדו של ניסוי העיצוב/הפעלה. בחר את תיבת הסימון מחלוף. הזן את הפרמטרים המתאימים המתאים במונחים של תמונות שיעברו/הזמן הכולל.
- הגדר נקודות לדימות מרשימת הנקודות על-ידי בחירה תחילה בכרטיסיה עיצוב ולאחר מכן נקודות בתיבת הדו של ניסוי העיצוב/הפעלה. בחרו באפשרות הרשימה של נקודות הביקור והזינו נקודות לדימות בתיבת המלל בפסיקים או במקפים אם זהו רצף שלם.
- לפני תחילת הניסוי, ערוך שמות קבצים ומיקומי קבצים באמצעות הכרטיסיה הפעלה בתיבת הדו עיצוב/הפעלה. ניתן לשנות את מיקום הקובץ על-ידי בחירת לחצן ההגדרות , בחירת תיקיית הנתונים ולאחר מכן בחירת התיקיה המתאימה או יצירת מסמך חדש. שנה את שמות הקבצים על-ידי הזנת שם הקובץ החדש בתיבת הטקסט של שם קובץ התמונה.
- התחל את הניסוי על-ידי בחירה בלחצן הפעל בתיבת הדו ניסוי התחלה .
הערה: למשך הזמן, בדוק באופן תמידי את המיקוד בכל שדה של תצוגה במהלך הניסוי באמצעות הגדרת DIC (כדי למנוע הלבנת מיותרים) ולמקד מחדש ולעדכן את המידע ברשימת נקודות כאשר התאים נוטים לצאת ממוקד במשך התקופה.
4. עיבוד תמונה
- פתח את קבצי התמונה raw (R3D) הרצויים עבור יצירת איורים.
הערה: ניתן לאתר קבצים שנשמרו לאחרונה באמצעות לחצן תיקיית הנתונים בתיבת ההפעלה של תוכנת ההדמיה. - הפעל את התוכנית לפירוק, כדי להסיר החוצה של מיקוד אור זריחה7,8, על מנת לייצר קובץ תמונה D3D לפירוק. בחר את הכרטיסיה ' תהליך ' בתיבת הדו ' הפעלה ' ולאחר מכן בחר באפשרות ' פירוק'. תופיע תיבת דו-שיח חדשה שכותרתה " פירוק".
- הגדר את הפרמטרים לפירוק על-ידי גרירת מספר התמונה המתאים (ממוקם בפינה השמאלית העליונה של כל קובץ תמונה) לקלט בתיבת הדו ' פירוק נתונים '. בתיבת הדו פירוק הגדרות, בחר את לחצן אפשרויות נוספות ובטל את תיבת הסימון לאחר העיבוד של שולי גבולות החיתוך (אחרת התמונות לא יכולות להיות מונחים מעל הקובץ DIC המתאים).
- לחצו על הלחצן ' עשה זאת ' בתיבת הדו ' פירוק ' לקובץ תמונה גולמית.
הערה: ניתן לכוונן את הפרמטרים הניתנים לפירוק כפי שמצוין במדריך ההדרכה של יצרן התוכנה עבור התוצאות הרצויות.
- במקרה הצורך, בצעו הפחתת רעש ברקע ידני והתאמת בהירות/ניגודיות בכל אורך הגל (צבע). עשה זאת על-ידי בחירה בלחצן התאמת הניגודיות בקובץ התמונה החוצה.
- שמור את התמונה כקובץ TIFF על-ידי בחירה תחילה באפשרות הקובץ בראש תיבת הדו D3D . לאחר מכן בחרו ' שמור כ-TIFF ', לזהות ולבחור את המחסניות Z המתאימות (הנמצאות במוקד), לבחור או לבטל בחירה של ערכות סינון רצויות.
- בצע כימות נתונים באמצעות כל תוכנה שסופקה על-ידי היצרן או תוכניות זמינות חופשיות כגון ImageJ5.
- עבור גודל התא לחץ על כרטיסיית הכלי בקובץ התמונה D3D המתאים, ולאחר מכן בחר את האפשרות מרחקים מדידה . מדידת מרחקים על-ידי בחירת נקודות התחלה וסיום בקובץ התמונה הרצוי באמצעות העכבר דרך לחיצות שמאל.
הערה: מומלץ להגדיל את התמונה במהלך כימות התאים בגודל תא. - עבור כימות הקרינה הפלואורסצנטית להשתמש באפשרות מפקח הנתונים תחת הכרטיסייה כלי בקובץ התמונה D3D המתאים.
הערה: מומלץ להגדיל את התמונה ולקבל רק מסננים רלוונטיים שנבחרו בעת השלמת כימות הקרינה הפלואורסצנטית. - כדי לכמת את אות הזריחה, צייר תיבה עם אפשרות עמודה/שורה המוגדר לממד מסוים. בחר אזור עם האות שיש לכמת והקלט את הערך. מדדו את אות הרקע באמצעות התיבה בגודל זהה כדי לבחור אזור מחוץ לתאים. הפחת את ערך הרקע מהערך שנרשם מהאות הפלואורסצנטית שהתקבל בתוך התא.
- עבור גודל התא לחץ על כרטיסיית הכלי בקובץ התמונה D3D המתאים, ולאחר מכן בחר את האפשרות מרחקים מדידה . מדידת מרחקים על-ידי בחירת נקודות התחלה וסיום בקובץ התמונה הרצוי באמצעות העכבר דרך לחיצות שמאל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפנוטיפים של GpsB
בעבר הצגנו כי Sa-GpsB הוא חלבון חיוני כמו דלדול של GpsB באמצעות ה-RNA אנטי תחושה התוצאות לפירוק התא9. כאן אנו מתארים כיצד הופעתה של הפנוטיפים לחלוקת תאים שונים ושינויים בלוקליזציה של חלבונים ניתן ללכוד באמצעות פרוטוקול מיקרוסקופ השעון המתואר במאמר זה. למטרה זו, S. האוראוס זנים RB143 [SH1000 מחסה pEPSA5 (וקטור ריק) ו GGS8 [SH1000 מחסה PGG59 (Pxyl-gpsbantisensebla החתול)] דיווח בעבר9, גדלו כדלקמן. זנים RB143 ו GGS8 חוסנו 2 מ ל של מרק סויה טריפטי (TSB) שיושלם עם 5 μg/mL כלוראמאנרול (בקלאו) במבחנה 15 מ ל ו היו מודבטים לילה ב 22 ° צ' בעודו רועד. התרבויות לילה היו מדולל 1:20 ב 10 מ ל של טרי TSB + סין בקבוקון 125 mL גדל ב 37 ° צ' עם רעד עד לשלב באמצע לוגריתמי (OD600 = 0.5). הסליל, 1% לאבד, נוספה למדיום התרבות כדי להפעיל את הביטוי של רנ א antisense של Gpsb והתרבות גדלה עבור עוד 3 h. תאים היו מוכתמים אז צבע פלורסנט FM4-64 (כתם ממברנה), כאשר נדרש, על ידי תוספת של 0.5 μl של 10 מלאי μg/ML של FM4-64 ישירות על 5 μl ליטר של תרבות על הצלחת מיקרוסקופ כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול. כפי שמוצג באיור 1 ווידאו 1, תוספת של XYLOSE לגרום GGS8 זן הביא "חולה" תא פניטיפ, כפי שמתואר בעבר9, בעוד שליטה וקטורית ריקה (RB143) הופיע דומה השליטה שלנו-תאים גדל בהעדר הסליל.
הקבוצה שלנו דיווחה גם כי ייצור יתר של האוראוס gpsb (Sa-gpsb) החטיבה תא משבש B. subtilis9. אנו משתמשים בביטוי ביטוי יתר זה כדוגמה להמחשת הפרוטוקול המתואר כאן. למטרה זו, B. subtilis זן GG9 (amye::Phyperspank-GpsbSaspc; ftsAZ:: ftsAZ-gfpΩerm) היה בשימוש9. לוקליזציה תת-תאית של FtsZ מתויג בדגל, חלבון חלוקת תא מפתח אשר מסמן את החטיבה תא10,11, שימש לניטור הסטטוס של החטיבה תא. המדגם למיקרוסקופיה הוכן להלן. מושבה אחת של GG9 חוסנו ב 2 מ ל לוריא ברטני (LB) בינוני ו מודבטים לילה ב 22 ° c ב שייקר חממה. התרבויות של הלילה היו 1:20 ב -10 מ ל ליברות טריים, וגדלה ב-37 ° c עם טלטול עד לשלב הביניים (OD600 = 0.5). GG9 תאים (5 μL aliquot) להיות התמונה הונחו על החלק התחתון של צלחת התרבות התחתונה זכוכית מכוסה 1% agarose pad עשה עם LB בתוספת עם 250 μM (הסופי ריכוז) של איזופרופילי β-D-1-thio, topyranoside (IPTG) כדי לגרום לביטוי של Sa-gpsB (איור 2 ו- Video 2). המיקרוסקופיה וכימות התאים שנערכו כמתואר בסעיף הפרוטוקול.
עיכוב של FtsZ
FtsZ, להיות חלבון חיוני עבור חלוקת תאים, נחשב יעד סמים אטרקטיבי וקבוצות מרובות מפתחים מעכבי FtsZ כדרך לפתח אנטיביוטיקה חדשה12. דפוסי הלוקליזציה של FtsZ או אחד החלבונים המשויכים אליו, כגון ZapA, יכול לשמש ככתב ללמוד ו/או לזהות תרכובות מיקרוביאלית הרומן. אנו משתמשים בפרוטוקול המסופק כאן כדי להדגים גישה זו באמצעות S. RB197 [SH1000 מחסה PRB42 (PCd-zapaSa-gfp בלה)]9 ו -B. subtilis PE92 (ftsAZ:: ftsAZ-gfpΩerm)13 זנים. RB197 ו PE92 זנים גדלו כמתואר לעיל ב TSB (המכיל 5 μg/mL אריתרומיצין; ו 1.25 μM CdCl2 כדי לגרום לביטוי של zapa-gfp) ו LB בהתאמה. בשלב באמצע לוגריתמי, מעכבי ftsz מאופיין היטב, PC19072314,15, התווסף בריכוז 2 μg/mL והשפעתו על S. האוראוס ו B. subtilis בפיקוח באמצעות מיקרוסקופ במרווחי זמן שונים (איור 3 איור 4). הקוונפיקציה של קוטר התאים של האוראוס ואורך התא של B. subtilis בוצעה כמתואר בסעיף הפרוטוקול.
איור 1: מיקרוגרף ברזולוציה גבוהה של התאים האורבית של S. הציג פנוטיפים חולים. מיקרוגרפים פלואורסצנטית של S. האורלנו זנים מחסה וקטור ריק (שמאל; RB143) או עותק inducible של רנ א אנטי תחושה של GpsbSa (מימין; GGS8) בנוכחות והעדר של 1% הפסד (הסליל). תאים awere מוכתם בכתם ממברנה FM4-64 (המניות מומס מים סטרילי) ו התמונה באמצעות ערכת מסנן TRITC. סרגל קנה מידה: 1 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: נתונים מייצגים המציגים את מעכבות החלוקה לתא ב -B. subtilis. (א) מיקרוגרפים מסוג B. SUBTILIS זן GG9 עם תמונות שנרכשו במרווחי זמן של 20 דקות עבור 120 דקות באמצעות ערוצי DIC/fitc. נתונים של קרינה פלואורסצנטית של FtsZ-GFP (ירוק) מוצגים. חיצים לעקוב אחר תא אחד לאורך הניסוי. סרגל קנה מידה: 1 μm. (ב) כימות של אורכי תא בכל הזמן. אורך תא ממוצע עם קווי שגיאה המציין את סטיית התקן (n = 50) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: חקירת מסלול הזמן של הפילוג בתחום הקליטה בארה ב. (א) התאים באמצע לוגריתמי השלב של זן RB197 מטופל (למעלה) או מטופלים (למטה) עם מעכב FTSZ (PC190723), לאחר מכן 30 דקות צמיחה, ali ts של תרבויות גדל נלקחו כל 10 דקות עבור 90 דקות והתמונה באמצעות ערכות מסנן DIC ו-fitc. הקרינה הפלואורסצנטית מ ZapA-GFP מוצג. סרגל קנה מידה: 1 μm. (ב) כימות של נתונים מיקרוסקופית. רוחב תא ממוצע עם קווי שגיאה המציינים את סטיית התקן (n = 50) ואחוז התאים (n = 50) הצגת לוקליזציה מתאימה של ZapA-GFP (באמצע התא והפריפריה) מוצגים. נקודות נתונים של תאים המתייחסים למעכב מעכב מוצגות באדום. צורות עם חלוקה לרמות ירוקות תואמות לציר Y הימני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: חקירת חלוקת התאים באמצעות מעכבי סינתטי ב -B. subtilis. B. subtilis זן PE92 היה מטופל או מטופל עם מעכב ftsz (PC190723) בשלב לוגריתמי באמצע ו היו מנוטרים על הבאים 90 min. ali ts של תרבויות גדל נלקחו כל 10 דקות עבור מיקרוסקופ ותמונות נרכשו באמצעות הערוצים DIC/fitc. קרינה פלואורסצנטית מ FtsZ-GFP מוצג. סרגל קנה מידה: 1 μm. (ב) כימות של נתונים מיקרוסקופית. אורך תא ממוצע עם קווי שגיאה המציינים את סטיית התקן (n = 50) ואחוז התאים (n = 50) המציגים לוקליזציה של FtsZ-GFP מתאימים באמצע תא. נקודות נתונים של תאים המתייחסים למעכב מעכב מוצגות באדום. צורות עם חלוקה לרמות ירוקות תואמות לציר Y הימני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: מיקרוסקופיה של התאים האורלאוס בפיתוח פנוטיפים חולים. מאמץ GGS8 (Gpsb antisense) מטופלים עם 1% xylose אבד. תאים היו מוכתמים עם כתם FM4-64 ממברנה והתמונה ב 10 דקות מרווחי עבור 60 מינימום באמצעות ערוץ TRITC כפי שמתואר בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו 2: ביטוי יתר של Sa-gpsb מוביל לעיכוב של חלוקת התא ב -B. subtilis. וידאו מראה filamentation ושינוי ב-FtsZ-GFP לוקליזציה ב-GG9. תמונות צולמו במרווחים של 20 דקות עבור 120 דקות באמצעות ערוצי DIC ו-FITC. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
| ינים | זן | גנוטיפ | פניה | |
| הארה | RB143 | SH1000 pEPSA5, בלה, חתול | אסארה ואח, 2018 | |
| הארה | GGS8 | SH1000 pGG59 (שדרה pEPSA5) Pxyl-gpsbantisense, בלה, חתול | אסארה ואח, 2018 | |
| הארה | RB197 | SH1000 pRB42 (pJB67 שדרה) PCd-ZapaSA-gfp, בלה, חתול | אסארה ואח, 2018 | |
| ב. סובטילזה | GG9 | amyE::P היפרסטירה-gpsBSA spc; ftsAZΩftsAZ-gfp | אסארה ואח, 2018 | |
| ב. סובטילזה | PE92 | ftsAZ:: ftsAZ-gfp Ωerm | ברייצקובסקי ואח ', 2019 | |
שולחן 1: זנים המשמשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המיקרוסקופיה הייתה בעלת התווך במחקרים הנוגעים לאורגניזמים מיקרוביאלית. בהתחשב בגודל התאים שלהם בקנה מידה מיקרון, מחקרים ברמת תא יחיד הסתמאו באופן מסורתי על מיקרוסקופ אלקטרונים (EM). למרות EM הפך להיות טכניקה רבת עוצמה בשנים האחרונות, יש לו מגבלות פנימיות משלו בנוסף למשתמש מוגבל גישה16. שיפורים בטכניקות מיקרוסקופ ניאון ופיתוח של בדיקה פלואורסצנטית שונים, כגון FDAA3, סיפקו ביולוגים תאים מיקרוביאלית עם מגוון רחב של כלים כדי ללמוד תהליכים סלולריים שונים בתאים חיים. חוקרים גם בונים באופן פעיל כלי פלורסנט כדי לפקח על שינויים, למשל ברמה של מולקולות איתות כגון c-di-GMP בין היתר, בתאים חיים17,18. בנוסף, ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית מאפשר לחוקרים לפקח על שינויים כפי שהם קורים וללמוד פנוטיפים רלוונטיים.
סיפקנו פרוטוקולים מפורטים לביצוע ניסויים במיקרוסקופיה עם מיקרוסקופ של קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה (ראה טבלת חומרים). עם זאת, ניתן לשנות את השלבים בפרוטוקולים כדי להתאים את הצרכים של המשתמש ואת המיקרוסקופ בשימוש. אנו משתמשים ב- S. אורטילארה ו-B. subtilis כמו אורגניזמים המודל שלנו כדי להראות כיצד לנטר פנוטיפים חלוקת תאים שונים, לעקוב אחר השינויים בלוקליזציה של חלבונים, ולכמת את הנתונים. בנוסף, עבור מקרים שבהם הזמן אינו תורם, אנו מראים בעזרת מעכב FtsZ, כיצד להגדיר ניסוי קורס זמן.
המגבלה הטבועה עם מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית היא הפתרון שנקבע על-ידי מגבלת העקיפה, שניתן להתגבר עליה במידה מסוימת בעזרת טכניקות מיקרוסקופית ברזולוציה מתקדמת של19,20. בעיות אחרות כגון פוטורעילות ו phototoxicity לבנה ניתן להקיף על ידי איסוף פחות Z-ערימות או למזער את המשך ו/או תדירות של חשיפה לייזר. חומרי הנחיה נוספים הספציפיים למיקרוסקופיה בתאים-חיים זמינים21. חוץ מאורגניזמים גראם חיוביים B. subtilis ו -S. האוראוס, באמצעות זה להגדיר, יש לנו בהצלחה בתמונה חיידק גראם שליליים esהמנשכיה קולי, שמרים סכביסים cerevisiae ס, ו נמטודות caenorהאבדיטיס.
בנוסף לניסויים המתוארים כאן, ניתן להשתמש במתודולוגיות דומות כדי לזהות תרכובות המכוונות לתהליכים סלולאריים מסוימים בצורה של תפוקה גבוהה. אלגוריתמים האוטומטיים את תהליך הקוונפיקציה ניתן לשלב גם עבור מערכות נתונים גדולות22,23. יש צורך עצום ללמוד זנים חיידקיים שונים כדי לטפל במשבר עמידות לאנטיביוטיקה ומחקרים נוספים מחייבים להבין את המנגנונים של תהליכים ביולוגיים בסיסיים ולזהות תרכובות טיפוליות הרומן. טכניקות שונות של מיקרוסקופ קרינה השיגו את הכוח ואת המומנטום כדי לסייע לחוקרים בהתמודדות עם האתגרים האלה בין היתר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לחברי המעבדה שלנו על הערותיהם במאמר זה. עבודה זו ממומנת על ידי מענק סטארט-up מאוניברסיטת דרום פלורידה (PE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade - Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Coltharp, C., Xiao, J.
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).
- Hsu, Y. P., et al. Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls. Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).
- Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria. Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy. Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).
- Eswara, P. J., et al. An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics. Elife. 7, (2018).
- Haeusser, D. P., Margolin, W. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).
- Du, S., Lutkenhaus, J. At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring. Trends in microbiology. , (2019).
- Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).
- Brzozowski, R. S., et al. Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).
- Elsen, N. L., et al. Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity. Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).
- Haydon, D. J., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
- Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy. Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).
- Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).
- Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations. Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).
- Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).
- Yao, Z., Carballido-Lopez, R. Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules. Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).
- Ettinger, A., Wittmann, T.
- Fredborg, M., et al. Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria. BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).
- Ursell, T., et al. precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library. BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).
