Summary
Den här artikeln innehåller en steg-för-steg-guide för att undersöka protein subcellulär lokalisering dynamik och övervaka morfologiska förändringar med högupplöst fluorescens mikroskopi i Bacillus subtilis och Staphylococcus aureus.
Abstract
Undersökningar av faktorer som påverkar celldelning och cell form hos bakterier utförs vanligen tillsammans med högupplöst fluorescens-mikroskopi, eftersom observationer som gjorts på populationsnivå inte riktigt återspeglar vad som sker på en enda cellnivå. Live-cell Timelapse mikroskopi kan utredarna att övervaka förändringar i celldelning eller cellmorfologi som ger värdefulla insikter om subcellulär lokalisering av proteiner och timing av genuttryck, som det händer, till potentiellt stöd i att besvara viktiga biologiska frågor. Här, vi beskriver vårt protokoll för att övervaka fenotypiska förändringar i Bacillus subtilis och Staphylococcus aureus med hjälp av en högupplöst deconvolution Mikroskop. Syftet med denna rapport är att tillhandahålla ett enkelt och tydligt protokoll som kan antas av andra utredare som är intresserade av att bedriva fluorescensmikroskopi experiment för att studera olika biologiska processer i bakterier och andra organismer.
Introduction
Området för bakteriell cellbiologi har förbättrats avsevärt genom de senaste framstegen inom mikroskopi tekniker1,2. Bland andra instrument, Mikroskop som kan utföra Timelapse fluorescens mikroskopi experiment förblir ett värdefullt verktyg. Utredare kan övervaka olika fysiologiska händelser i realtid med hjälp av fluorescerande proteiner som, grön fluorescerande protein (GFP)-baserade transkriptionella och translationella reporter fusioner, fluorescerande D-aminosyror (FDAA)3, eller använda andra fläckar för märkning av cellväggen, membran och DNA. Det är därför ingen överraskning att fluorescensmikroskopi fortfarande är populärt bland mikrobiella cellbiologer. Förutom att bara visa slutet fenotyper, ge information om hur de observerade fenotyperna uppstår med hjälp av Timelapse mikroskopi kan tillföra betydande värde till resultaten och potentiellt ge ledtrådar om vilka cellulära processer som riktas mot potentiella läkemedelskandidater4.
Protokollen för att genomföra högupplösta bilder med hjälp av ett helt motoriserat, inverterat, brett fält fluorescens-Mikroskop (se material tabellen) finns i denna artikel. Dessa protokoll kan anpassas för att passa behoven hos andra fluorescensmikroskop som kan utföra Timelapse-mikroskopi. Även om programvaran diskuteras här motsvarar den specifika tillverkaren medföljande programvara som anges i tabellen av material, programvara som vanligen tillhandahålls av andra Mikroskop tillverkare eller fritt tillgängliga imagej5, har likvärdiga verktyg för att analysera mikroskopi data. För villkor där Timelapse inte bidrar, kan tidsförlopp experiment utföras enligt beskrivningen i denna artikel. De protokoll som beskrivs här ger en detaljerad guide för att studera fenotypiska förändringar i två olika bakteriearter: B. subtilis och S. aureus. Se tabell 1 för stammar som används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. allmänna tillväxtvillkor
- Inokulera 2 mL lämpligt odlingssubstrat kompletterat med antibiotika (om så krävs) med en enda koloni av den eller de stam (er) som skall avbildas. Inkubera dessa frö kulturer över natten vid 22 ° c i en skakande inkubator.
Anmärkning: de specifika bakterietillväxt villkor som används i denna artikel tillhandahålls under representativa resultat avsnitt. - Späd över natten kulturer 1:20 i färska medier i en 125 mL kolv, komplettera med antibiotika (om det behövs).
- Odla kultur (er) vid 37 ° c i en skakande inkubator fram till mitten av logaritmisk fas (OD600 = 0,5).
Obs: inducerare eller hämmare kan läggas direkt till odling (s) i lämplig tillväxtfas. - Skörde celler vid önskade odlingsförhållanden för mikroskopi provberedning enligt beskrivningen i följande avsnitt.
2. provberedning
- Förbered 1% aguppstod genom att kombinera 0,25 g molekylärbiologi grade, låg EEO, aguppstod med antingen 25 mL av odlingssubstrat kompletteras med lämplig antibiotika (om så krävs) för Timelapse mikroskopi eller sterilt vatten. Värm blandningen med hjälp av en mikrovågsugn för cirka 30 s och häll den i en steril 100 mm x 15 mm petriskål och låt den stelna.
- Ta en 5 – 50 μL alikvot av cellkulturen beroende på behovet och färga cellerna. Fläcka celler med lämpliga färgämnen i detta skede (t. ex. lägga till fluorescerande färgämne FM4-64 (membran fläck) för ett experiment (figur 1)).
- Pipettera över en 5 μl alikvot av odlings provet eller det färgade provet så att det avbildas på botten av en 35 mm glasbotten kultur maträtt (med 14 mm mikrobrunn diameter och obestruket nr 1,5 täckglas, se tabellen av material).
Varning: Använd inte Poly-L-lysin belagda täckband speciellt för Timelapse mikroskopi eftersom de kan inducera olika tillväxtmönster (vi har observerat detta med Poly-D-lysin också; data som inte visas) och/eller påverkar proteindynamik6. - För att minimera användningen av färgämnen, fläcken 3 – 4 μL cellsuspension (skördad vid OD600 = 0,5; cirka 2,7 x 107 och 3,4 x 107 för B. subtilis respektive S. aureus per 1 ml kultur) direkt på glasbotten skålen.
- Placera en pre-cut aguppstod Slab (11 mm i diameter eller av önskad storlek för att överlappa området av täckplattan, skär med hjälp av den öppna änden av ett sterilt rör eller ett rakblad) ovanpå provet och knacka försiktigt för att se till att Agam plattan ligger plant mot täckslip.
- Pipettera över en 5 μl alikvot av odlings provet eller det färgade provet så att det avbildas på botten av en 35 mm glasbotten kultur maträtt (med 14 mm mikrobrunn diameter och obestruket nr 1,5 täckglas, se tabellen av material).
- Efter avbildning (se följande avsnitt), om antalet celler i synfältet inte är önskvärt, justera CELLTÄTHETEN hos provet via utspädning eller koncentration genom centrifugering och ändra förhållandet mellan cellerna i provet med hjälp av odlingsmedium/buffert vid behov.
Anmärkning: för att minimera autofluorescence som utgår från odlingsmediet kan cellerna tvättas i buffert (t. ex. i standard 1x fosfatbuffertsaltlösning) och återsuspenderas i lämplig mängd buffert före avbildning. Det är möjligt att mindre celler eller blåsor i detta steg inte kan behållas efter centrifugering och kommer därför att förloras. - Tillsätt vatten med hjälp av en pipett (~ 5 μL droppar) till utrymmet inuti odlings skålen (runt täckglassen) för att förhindra att agandynan torkar, och för att bibehålla fuktigheten under bild förvärvet, särskilt för Timelapse-experiment.
- Låt kultur rätter att jämvikt till temperaturen inne i inkubationskammaren, ett inbyggt ogenomskinligt fack som tillhandahålls av tillverkaren, av mikroskopet i 15 – 20 min.
Anmärkning: slå på värmeelement och Ställ in inkubationskammaren till önskad temperatur flera timmar före avbildning. Detta kommer att säkerställa att hårdvaran stabiliseras till den nya temperaturen. För långvarig Timelapse-avbildning, placera en bägare eller kolv med vatten inuti Mikroskop kammaren, bort från arbetsområdet, för att bibehålla fuktigheten.
3. Imaging
- På experimentets dag, slå på Mikroskop systemet. Starta bildhanteringsprogrammet (se tabell över material) genom att klicka på lämplig ikon på skrivbordet. Initiera mikroskopet genom att klicka på alternativet initiera Mikroskop (knappen avbildad med ett Mikroskop på den) i programvarans start dialogruta. Se till att målet är helt sänkt med mikroskopet grovjustering före initiering.
ANMÄRKNINGAR: efter initiering tre ytterligare dialogrutor bör visas förutom Start-menyn: resolve3D, datainsamling, och filter Monitor. - Placera en droppe 1,517 (brytningsindex) olja på 100x Oil Immersion mål som tillhandahålls av tillverkaren (numerisk bländare = 1,4, arbetsavstånd = 0,12 mm; se tabell över material).
Obs: det är viktigt att välja lämplig nedsänknings olja för den temperatur vid vilken avbildning utförs. - Ladda glasbotten skålen som innehåller provet i metallhölje (Kista) och försiktigt glida in i scenen klämman.
- Använd snabb justeringsratten för att höja målet tills oljan får kontakt med glasbotten på skålen. Använd ögon stycket och fin justeringsratten för att få provet i fokus. När cellerna är i fokus Vrid ratten från ögat bit till kameraläge genom att flytta väljaren placerad på framsidan av Mikroskop kroppen till vänster.
- Börja experimentera med avbildningsprogrammet. I fönstret resolve3D väljer du ikonen designa/kör experiment som en kolv har avbildat. En ny dialogruta bör visas med titeln design/kör experiment.
- Ange antalet Z-stackar och prov tjockleken med hjälp av fliken design och sedan snittning i dialogrutan design/kör experiment .
Anmärkning: för experiment i representativa resultat avsnitt, 17 Z-stackar på 200 nm intervall för stillbilder och fyra Z-stackar på 200 nm intervall för Timelapse mikroskopi användes. - Du mäter tjockleken på cellerna i provet genom att manuellt justera Z-planet stegvis med hjälp av upp-och nedpilarna i dialogrutan resolve3D . Markera var cellerna går out-of-Focus som den övre och undre gränsen för bild förvärv. Importera den här informationen innan du kör experimentet.
- För att minimera fototoxicitet och foto blekning under Timelapse Imaging, minska antalet Z-stackar och välj mitten av planet av cellerna för bild förvärv.
- Ange antalet Z-stackar och prov tjockleken med hjälp av fliken design och sedan snittning i dialogrutan design/kör experiment .
- Välj lämplig filteruppsättning för experimentet med hjälp av fliken design och sedan kanaler i dialogrutan design/kör experiment (TRITC: ex 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
- Välj också en referens för insamling av POL/DIC-information. Justera procentuell transmission (ljusintensitet) och exponeringstid för enskilda kanaler som valts före avbildning genom att välja lämpliga alternativ i dialogrutan resolve3D .
Anmärkning: i ett test synfält som inte beaktas för experimentet testa dessa inställningar för att identifiera om de valda parametrarna få meningsfulla fluorescensdata utan att saknas svag signal eller oversaturating den. Importera sedan dessa parametrar för den experimentella uppsättningen.
- Välj också en referens för insamling av POL/DIC-information. Justera procentuell transmission (ljusintensitet) och exponeringstid för enskilda kanaler som valts före avbildning genom att välja lämpliga alternativ i dialogrutan resolve3D .
- Öppna poänglistan genom att välja knappen poänglista i dialogrutan resolve3D . En ny dialogruta bör visas med rubriken poänglista. Markera flera fält som ska användas i experimentet genom att söka efter lämpliga vyfält med hjälp av mikroskopets scen kontroller och markera alternativet Markera punkt i dialogrutan punktlista.
Anmärkning: en ersättnings punkt måste väljas varje gång mikroskopet omfokuseras på en punkt i poänglistan. Detta kan göras genom att fokusera mikroskopet på lämplig punkt i listan och sedan välja knappen Ersätt punkt . Det är viktigt att inte röra den analoga grov/finjustering ratten när omfokusering; Använd endast programvaran för att justera fokus. - Ange Timelapse-parametrar genom att först markera fliken Design och sedan Timelapse i dialogrutan design/kör experiment. Markera kryssrutan Timelapse. Ange lämpliga Timelapse parametrar i form av Timelapse bilder/total tid.
- Ange punkter som ska avbildas från poänglistan genom att först välja fliken design och sedan punkter i dialogrutan design/kör experiment. Välj alternativet besöks Poäng och ange punkter som ska avbildas i textrutan avgränsade med kommatecken eller bindestreck om det är en fullständig sekvens.
- Innan du påbörjar ett experiment redigerar du filnamn och filplatser med hjälp av fliken Kör i dialogrutan design/kör. Filplatsen kan ändras genom att välja knappen Inställningar , välja mappen data och sedan välja lämplig mapp eller skapa en ny. Ändra filnamn genom att ange det nya filnamnet i textrutan bildfilsnamn.
- Starta experimentet genom att välja knappen spela upp i dialogrutan påbörja experiment .
Obs: för Timelapse, kontinuerligt kontrollera fokus på varje synfält under hela experimentet med DIC inställning (för att undvika onödig foto blekning) och fokusera och uppdatera informationen i listan punkter som celler tenderar att gå ur fokus över tiden.
4. bildbehandling
- Öppna önskade RAW (R3D) bildfiler för generering av siffror.
Obs: nyligen sparade filer kan placeras med hjälp av knappen data-mappen i bildprogram varans start dialogruta. - Kör deconvolution programmet, för att ta bort out-of-fokus fluorescens ljus7,8, för att producera en deconvolved D3D bildfil. Välj fliken process i dialogrutan starta och välj sedan deconvolve. En ny dialogruta visas med titeln deconvolve.
- Ange parametrarna för deconvolution genom att dra rätt bildnummer (som finns i det övre vänstra hörnet i varje bildfil) till indata i dialogrutan deconvolution. I dialogrutan avfaltning väljer du knappen fler alternativ och avmarkerar kryssrutan Beskär kantlinje efter bearbetning (annars kan inte bilderna läggas ovanpå motsvarande DIC-fil).
- Klicka på knappen gör det i dialogrutan deconvolution att deconvolve Raw-bildfil.
Anmärkning: parametrarna för deconvolution kan justeras som anges av programvarutillverkarens handledning för önskade resultat.
- Om det behövs, utför manuell bakgrundsbrus subtraktion och ljusstyrka/kontrast justering i någon eller alla våglängd (färg) kanaler. Gör detta genom att välja knappen kontrast justering på bildfilen deconvolved.
- Spara bilden som en TIFF-fil genom att först markera alternativet Arkiv överst i dialogrutan D3D . Välj sedan Spara som TIFF, identifiera och Välj lämpliga Z-stackar (som är i fokus), markera eller avmarkera önskade filteruppsättningar.
- Utföra data kvantifiering med hjälp av programvara som tillhandahålls av tillverkaren eller fritt tillgängliga program som ImageJ5.
- För kvantifiering av Cellstorlek klickar du på verktygsfliken på lämplig D3D-avbildningsfil och väljer sedan alternativet Mät avstånd . Mät avstånd genom att välja Start-och slutpunkter på den önskade bildfilen med hjälp av musen genom vänsterklick.
Obs: det är bäst att zooma in på bilden vid kvantifiering av Cellstorlek. - För beräkning av fluorescenssignal Använd alternativet Datagranskare under verktygsfliken på lämplig D3D-bildfil.
Obs: det är bäst att zooma in på bilden och att endast ha relevanta filter valda när du slutför fluorescenssignalkvantifiering. - Om du vill kvantifiera fluorescenssignalen ritar du en ruta med kolumn-/radalternativ inställt på specifik dimension. Välj ett område med signal som ska kvantifieras och registrera värdet. Mät bakgrunds signalen genom att använda samma storleks ruta för att välja ett område omedelbart utanför cellerna. Subtrahera bakgrunds värdet från det värde som registrerats från fluorescenssignalen som erhålls i cellen.
- För kvantifiering av Cellstorlek klickar du på verktygsfliken på lämplig D3D-avbildningsfil och väljer sedan alternativet Mät avstånd . Mät avstånd genom att välja Start-och slutpunkter på den önskade bildfilen med hjälp av musen genom vänsterklick.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GpsB fenotyper
Tidigare har vi visat att sa-GpsB är ett viktigt protein som utarmning av GpsB med hjälp av ett antisense RNA resultat i cell lysis9. Här beskriver vi hur uppkomsten av olika cell Division fenotyper och förändringar i protein lokalisering kan fångas med hjälp av Timelapse mikroskopi protokollet som beskrivs i denna artikel. För detta ändamål, S. aureus stammar RB143 [SH1000 hyser pEPSA5 (tom vektor)] och GGS8 [SH1000 hyser pGG59 (PXYL-gpsbantisensebla Cat)] rapporterade tidigare9, odlades enligt följande. Stammar RB143 och GGS8 inokulerades i 2 mL tryptisk soja buljong (TSB) kompletterad med 5 μg/mL kloramfenikol (Chlor) i ett 15 mL provrör och inkuberades över natten vid 22 ° c under skakning. Över natten kulturerna späddes 1:20 i 10 ml färska TSB + kloralkaliindustrin i en 125 ml kolv och odlas vid 37 ° c med skakning fram till mitten av logaritmisk fas (OD600 = 0,5). Inducerare, 1% Xylose, lades till odlingsmediet för att utlösa uttrycket av antisense RNA av Gpsb och kulturen odlades för en annan 3 h. cellerna färgas sedan med fluorescerande färgämne FM4-64 (membran fläcken), där så krävs, genom tillsats av 0,5 μl av ett lager av FM4-64 på 10 μg/ml direkt på 5 μl alikvot på Mikroskop skålen enligt beskrivningen i protokoll sektionen. Som framgår av figur 1 och video 1, resulterade tillsats av xylos för att inducera GGS8 Strain i en "sjuk" cellfenotyp, som tidigare beskrivits9, medan tom vektor kontroll (RB143) verkade likna vår kontroll — celler som odlas i avsaknad av inducerare.
Vår grupp rapporterade också att överproduktion av S. aureus gpsb (sa-gpsb) stör celldelningen i B. subtilis9. Vi använder denna överuttryck fenotyp som ett exempel för att demonstrera det protokoll som beskrivs här. För detta ändamål, a B. subtilis stam GG9 (amye::Phyperspank-GpsbsaSPC; Ftsaz:: ftsaz-gfpωerm) användes9. Subcellulär lokalisering av Fluorescent-märkt FtsZ, en Nyckelcell Division protein som markerar cell Division platser10,11, användes för att övervaka status för celldelning. Provet för mikroskopi utarbetades på följande sätt. En enda koloni av GG9 inokulerades i 2 mL Luria-Bertani (LB) medium och inkuberades över natten vid 22 ° c i en inkubator shaker. Över natten kulturerna var 1:20 i 10 mL färskt LB, och odlas vid 37 ° c med skakning tills mitten av logaritmisk fas (OD600 = 0,5). GG9 celler (5 μL alikvot) som skall avbildas placerades på botten av en glasbotten kultur maträtt och täckt med en 1% aguppkom pad med LB kompletterat med 250 μM (Final isopropylβ-D-1-tiogalactopyranosid (IPTG) för att inducera uttrycket av sa-gpsB (figur 2 och video 2). Timelapse-mikroskopi och kvantifiering av cell längd utfördes enligt beskrivningen i avsnittet protokoll.
Hämning av FtsZ
FtsZ, är ett protein som är viktigt för celldelning, anses vara en attraktiv drog mål och flera grupper utvecklar FtsZ-hämmare som ett sätt att utveckla nya antibiotika12. Lokaliserings mönster av FtsZ eller ett av de proteiner som förknippas med det, såsom ZapA, kan användas som en reporter för att studera och/eller identifiera nya antimikrobiella substanser. Vi använder det protokoll som ges här för att demonstrera denna metod med hjälp av S. aureus RB197 [SH1000 hyser pRB42 (PCD-Zapasa-GFP bla ERM)]9 och B. subtilis PE92 (ftsaz:: ftsaz-gfpωerm)13 stammar. RB197 och PE92 stammar odlades som beskrivs ovan i TSB (innehållande 5 μg/mL erytromycin, och 1,25 μM CdCl2 för att inducera uttrycket av Zapa-GFP) respektive lb. Vid mitten av logaritmisk fas, en väl karaktäriserad ftsz-hämmare, PC19072314,15, lades till 2 μg/ml slutkoncentration och dess effekt på S. aureus och B. subtilis celler övervakades med hjälp av mikroskopi vid olika tidsintervall (figur 3 och figur 4). Kvantifiering av cell diametern hos S. aureus och cell längden hos B. subtilis utfördes enligt beskrivningen i protokoll sektionen.
Bild 1: högupplöst Mikrograf av S. aureus -celler som uppvisar Sick fenotyp. Fluorescensmikrografer av S. aureus stammar som hyser antingen tom vektor (vänster; RB143) eller en inducerbar kopia av antisense RNA av Gpsbsa (höger; GGS8) i närvaro och frånvaro av 1% xylos (inducerare). Celler tängdes färgade med FM4-64 membran fläck (lager upplöst i sterilt vatten) och avbildas med hjälp av TRITC Filter Set. Skalbar: 1 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa data som visar celldelning hämning i B. subtilis. A) Timelapse Mikrografer av B. SUBTILIS Strain GG9 med bilder förvärvade med 20 minuters mellanrum för 120 min med hjälp av DIC/FITC-kanalerna. Fluorescensdata för FtsZ-GFP (grön) visas. Pilarna följer en cell i experimentet. Skalbar: 1 μm.B) kvantifiering av cell längder vid alla tidpunkter. Genomsnittlig cell längd med felstaplar som indikerar standardavvikelse (n = 50) visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: tidsförlopp utredning av celldelning hämning i S. aureus. (A) mitten av logaritmiska fas celler av stam RB197 obehandlad (överst) eller behandlad (botten) med ftsz-hämmare (PC190723), efter 30 min tillväxt, alikvoter av växande kulturer togs varje 10 min för 90 min och AVBILDAS med DIC och FITC filteruppsättningar. Fluorescens från ZapA-GFP visas. Skalbar: 1 μm.Bkvantifiering av mikroskopidata. Genomsnittlig cellbredd med felstaplar som indikerar standardavvikelse (n = 50) och procentandel av celler (n = 50) som visar korrekt ZapA-GFP-lokalisering (Mid-cell och periferi) visas. Data punkter av celler som behandlats med inhibitor visas i rött. Former med grön kontur motsvarar den högra Y-axeln. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: undersökning av celldelning hämning av en syntetisk hämmare i B. subtilis. B. subtilis -stam PE92 var antingen obehandlad eller behandlad med en ftsz-hämmare (PC190723) vid mitten av logaritmisk fas och övervakades för de följande 90 min. alikvoter av odlingskulturer togs varje 10 min för mikroskopi och bilder förvärvades med hjälp av DIC/FITC kanaler. Fluorescens från FtsZ-GFP visas. Skalbar: 1 μm.Bkvantifiering av mikroskopidata. Genomsnittlig cell längd med felstaplar som indikerar standardavvikelse (n = 50) och procentandel av celler (n = 50) som visar korrekt Mid-cell FtsZ-GFP lokalisering visas. Data punkter av celler som behandlats med inhibitor visas i rött. Former med grön kontur motsvarar den högra Y-axeln. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Timelapse mikroskopi av S. aureus celler utveckla Sick fenotyp. Stam GGS8 (Gpsb antisense) som behandlats med 1% Xylose. Celler färgas med FM4-64 membran fläcken och avbildas vid 10 min intervall för 60 min med hjälp av TRITC kanal som beskrivs i protokollet. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Video 2: överuttryck av sa-gpsb leder till hämning av celldelningen i B. subtilis. Timelapse video som visar filamentation och förändring i FtsZ-GFP lokalisering i GG9. Bilder togs med 20 minuters mellanrum för 120 min med hjälp av DIC och FITC kanaler. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
| Arter | Stam | Genotyp | Referens | |
| S. aureus | RB143 | SH1000 pEPSA5, bla, katt | Eswara et al, 2018 | |
| S. aureus | GGS8 | SH1000 pGG59 (pEPSA5 stamnät) PXYL-gpsbantisense, bla, Cat | Eswara et al, 2018 | |
| S. aureus | RB197 | SH1000 pRB42 (pJB67 Backbone) PCD-Zapasa-GFP, bla, katt | Eswara et al, 2018 | |
| B. subtilis | GG9 | amyE::P hyperspank-gpsBsa SPC; ftsAZΩftsAZ-GFP ERM | Eswara et al, 2018 | |
| B. subtilis | PE92 | ftsAZ:: ftsAZ-GFP Ωerm | Brzozowski et al, 2019 | |
Tabell 1: använda stammar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroskopi har varit en stöttepelare i studier som rör mikrobiella organismer. Med tanke på deras micron skala Cellstorlek, encellig nivå studier har traditionellt förlitat sig på elektronmikroskopi (EM). Även om EM har blivit en ganska kraftfull teknik under de senaste åren har det sina egna inneboende begränsningar utöver begränsad användaråtkomst16. Förbättringar i fluorescensmikroskopi tekniker och utveckling av olika fluorescerande sonder, såsom FDAA3, har försett mikrobiella cellbiologer med ett brett spektrum av verktyg för att studera olika cellulära processer i levande celler. Forskarna bygger också aktivt fluorescerande verktyg för att övervaka förändringar, till exempel i nivån av signalmolekyler som c-di-GMP bland andra, i levande celler17,18. Dessutom ger högupplöst Timelapse fluorescens mikroskopi utredare att övervaka förändringar när de inträffar och att studera relevanta fenotyper.
Vi har tillhandahållit detaljerade protokoll för att genomföra mikroskopi experiment med en högupplöst fluorescens Mikroskop (se tabell över material). Stegen i protokollen kan dock ändras för att passa användarnas behov och det Mikroskop som används. Vi använder S. aureus och B. subtilis som våra modellorganismer för att visa hur man övervakar olika cellindelning fenotyper, spåra förändringar i protein lokalisering, och kvantifiera data. Dessutom, för fall där Timelapse inte bidrar, visar vi med hjälp av en FtsZ-hämmare, hur man ställer in en tid kurs experiment.
Den inneboende begränsningen med fluorescensmikroskopi är den upplösning som fastställts av diffraktionsgränsen, som skulle kunna övervinnas i viss utsträckning med hjälp av avancerade super-resolution mikroskopi tekniker19,20. Andra frågor såsom fototoxicitet och foto blekning kan kringgås genom att samla in färre Z-stackar eller minimera varaktigheten och/eller frekvensen av exponering för laser. Annat väglednings material som är specifikt till levande-cell mikroskopi, är tillgängligt21. Bortsett från grampositiva organismer B. subtilis och S. aureus, med hjälp av denna inrättas, har vi framgångsrikt avbildat gramnegativa bakterie Escherichia coli, jäst Saccharomyces cerevisiae, och Nematoden Caenorhabditis elegans.
Förutom de experiment som beskrivs här, liknande metoder kan användas för att identifiera föreningar som riktar specifika cellulära processer i en hög genomströmning mode. Algoritmer som automatiserar kvantifieringsprocessen kan också införlivas för stora datauppsättningar22,23. Det finns ett enormt behov av att studera olika bakteriearter för att hantera antibiotikaresistens krisen och fler studier är motiverade att förstå mekanismerna för grundläggande biologiska processer och identifiera nya terapeutiska föreningar. Olika fluorescensmikroskopi tekniker har fått kraft och dynamik för att hjälpa forskare att ta itu med dessa utmaningar bland andra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar våra labb medlemmar för deras kommentarer om den här artikeln. Detta arbete finansierades genom ett startbidrag från University of South Florida (PE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade - Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Coltharp, C., Xiao, J.
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).
- Hsu, Y. P., et al. Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls. Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).
- Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria. Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy. Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).
- Eswara, P. J., et al. An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics. Elife. 7, (2018).
- Haeusser, D. P., Margolin, W. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).
- Du, S., Lutkenhaus, J. At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring. Trends in microbiology. , (2019).
- Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).
- Brzozowski, R. S., et al. Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).
- Elsen, N. L., et al. Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity. Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).
- Haydon, D. J., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
- Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy. Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).
- Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).
- Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations. Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).
- Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).
- Yao, Z., Carballido-Lopez, R. Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules. Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).
- Ettinger, A., Wittmann, T.
- Fredborg, M., et al. Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria. BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).
- Ursell, T., et al. precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library. BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).
