Summary
Este artigo fornece um guia passo a passo para investigar a dinâmica de localização subcelular de proteínas e monitorar mudanças morfológicas usando microscopia de fluorescência de alta resolução em Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.
Abstract
Investigações de fatores que influenciam a divisão celular e a forma celular em bactérias são comumente realizadas em conjunto com a microscopia de fluorescência de alta resolução, já que observações feitas em nível populacional podem não refletir verdadeiramente o que ocorre em um único nível celular. A microscopia de lapso de tempo de células vivas permite que os investigadores monitorem as mudanças na divisão celular ou na morfologia celular que fornecem insights valiosos sobre a localização subcelular de proteínas e o momento da expressão gênica, como acontece, para potencialmente ajudar a responder a importantes questões biológicas. Aqui, descrevemos nosso protocolo para monitorar mudanças phenotípicas em Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus usando um microscópio de deconvolução de alta resolução. O objetivo deste relatório é fornecer um protocolo simples e claro que possa ser adotado por outros investigadores interessados em realizar experimentos de microscopia de fluorescência para estudar diferentes processos biológicos em bactérias, bem como outros organismos.
Introduction
O campo da biologia celular bacteriana tem sido significativamente reforçada pelos avanços recentes em técnicas de microscopia1,2. Entre outros instrumentos, microscópios capazes de realizar experimentos de microscopia fluorescência de lapso de tempo continuam a ser uma ferramenta valiosa. Os investigadores podem monitorar vários eventos fisiológicos em tempo real usando proteínas fluorescentes, como, fusãos transcricionais e de repórter translacional baseadas em GFP (GFP), d-aminoácidos fluorescentes (FDAA)3,ou usar outras manchas para rotular a parede celular, membrana e DNA. Portanto, não é nenhuma surpresa que a microscopia de fluorescência permaneça popular entre os biólogos de células microbianas. Além de simplesmente mostrar os fenótipos finais, fornecer informações sobre como os fenótipos observados surgem usando microscopia timelapse poderia agregar valor significativo aos resultados e, potencialmente, oferecer pistas sobre o que os processos celulares estão sendo alvo de potenciais candidatos a medicamentos4.
Os protocolos para realizar imagens de alta resolução usando um microscópio de fluorescência totalmente motorizado, invertido e de amplo campo (ver a Tabela de Materiais)são fornecidos neste artigo. Esses protocolos poderiam ser adaptados para atender às necessidades de outros microscópios de fluorescência que são capazes de realizar microscopia timelapse. Embora o software discutido aqui corresponda ao software específico fornecido pelo fabricante, conforme indicado na Tabela de Materiais, software comumente fornecido por outros fabricantes de microscópio ou o ImageJ5livremente disponível, têm ferramentas equivalentes para analisar dados de microscopia. Para condições em que o timelapse não é propício, experimentos de curso de tempo podem ser conduzidos conforme descrito neste artigo. Os protocolos descritos aqui fornecem um guia detalhado para estudar as mudanças phenotípicas em duas espécies bacterianas diferentes: B. subtilis e S. aureus. Veja a Tabela 1 para cepas usadas.
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Protocol
1. Condições gerais de crescimento
- Inocular 2 mL de médio de crescimento adequado complementado com antibióticos (quando necessário) com uma única colônia da cepa (s) para ser imagem. Incubar essas culturas de sementes durante a noite a 22 °C em uma incubadora tremendo.
NOTA: As condições específicas de crescimento bacteriano utilizadas neste artigo são fornecidas na seção de resultados representativos. - Diluir culturas durante a noite 1:20 em novos meios de comunicação em um frasco de 125 mL, suplemento com antibióticos (quando necessário).
- Crescer a cultura (s) em 37 °C em uma incubadora tremendo até meados da fase logarítica (OD600 = 0,5).
NOTA: O indutor ou o inibidor poderiam ser adicionados diretamente à cultura crescente (s) na fase apropriada do crescimento. - Células de colheita em condições de cultura desejadas para a preparação da amostra de microscopia, conforme descrito na seção a seguir.
2. Preparação da amostra
- Prepare 1% agarose combinando 0.25g da classe da biologia molecular, do baixo EEO, agarose com os 25 mL do meio do crescimento suplementados com os antibióticos apropriados (onde necessário) para a microscopia do timelapse ou a água estéril. Aqueça a mistura com a ajuda de um microondas por aproximadamente 30 s e despeje-o em um estéril 100 mm x 15 milímetros placa de Petri e deixá-lo solidificar.
- Tome um alibamento de 5-50 μL da cultura celular, dependendo da necessidade e manchar as células. Células de mancha com corantes apropriados nesta fase (por exemplo, adicionar corante fluorescente FM4-64 (mancha de membrana) para um experimento (Figura 1)).
- Pipette um aliba de 5 μL da amostra de cultura ou amostra manchada a ser imagemna parte inferior de um prato de cultura de 35 mm de vidro inferior (com 14 mm de diâmetro de micropoço e coverslip nº 1.5 não revestido; veja a Tabela de Materiais).
CUIDADO: Não use poli-L-lisina revestido coverslips especialmente para microscopia timelapse como eles poderiam induzir padrão de crescimento diferente (temos observado isso com poli-D-lisina também; dados não mostrados) e / ou afetar a dinâmica da proteína6. - Para minimizar o uso de corantes, mancha suspensão celular de 3-4 μL (colhida em OD600 = 0,5; aproximadamente 2,7 x 107 e 3,4 x 107 para B. subtilis e S. aureus respectivamente por cultura de 1 mL) diretamente no prato inferior de vidro.
- Coloque uma laje de agarose pré-cortada (11 mm de diâmetro ou de qualquer tamanho desejado para se sobrepor à área do deslizamento de terra; corte usando a extremidade aberta de um tubo estéril ou uma lâmina de barbear) em cima da amostra e toque suavemente para se certificar de que a laje de agarose está deitada contra o coverslip.
- Pipette um aliba de 5 μL da amostra de cultura ou amostra manchada a ser imagemna parte inferior de um prato de cultura de 35 mm de vidro inferior (com 14 mm de diâmetro de micropoço e coverslip nº 1.5 não revestido; veja a Tabela de Materiais).
- Posterior à imagem (ver a seção seguinte), se o número de células no campo de visão não for desejável, ajuste a densidade celular da amostra por meio de diluição ou concentração por centrifugação e altere a proporção de células na amostra usando o crescimento médio/tampão conforme necessário.
NOTA: Para minimizar a autofluorescência que emana do meio de cultura, as células podem ser lavadas em tampão (por exemplo, na sorino tampão de fosfato padrão 1x) e resuspensas em quantidade adequada de buffer antes da imagem. É possível que nesta etapa células menores ou vesículas não podem ser mantidos após a centrífuga e, portanto, ser perdido. - Adicione a água usando uma pipeta (~5 μL gotas) ao espaço dentro do prato da cultura (em torno do coverslip) para impedir que a almofada do agarose seque, e para ajudar a manter a umidade durante a aquisição da imagem, especial para experiências do timelapse.
- Permita que os pratos de cultura equilibrem-se à temperatura dentro da câmara de incubação, um compartimento opaco embutido fornecido pelo fabricante, do microscópio por 15-20 min.
NOTA: Ligue o elemento de aquecimento e definir a câmara de incubação para uma temperatura desejada várias horas antes da imagem. Isso garantirá que o hardware se estabilize à nova temperatura. Para imagens de timelapse prolongadas, coloque um copo ou frasco com água dentro da câmara do microscópio, longe da área de trabalho, para manter a umidade.
3. Imagem
- No dia do experimento, ligue o sistema de microscópio. Inicie o software de imagem (ver Tabela de Materiais)clicando no ícone apropriado na área de trabalho. Inicialmente inicialize o microscópio clicando na opção Inicialize Microscópio (botão retratado com um microscópio sobre ele) na caixa de diálogo inicial do software. Certifique-se de que o objetivo seja totalmente reduzido usando o ajuste grosseiro do microscópio antes da inicialização.
NOTA: Após a inicialização, três caixas de diálogo adicionais devem aparecer além do menu inicial: resolve3D, coleta de dados e monitor de filtro. - Coloque uma queda de 1.517 (índice refrativo) de óleo no objetivo de imersão de óleo 100x fornecido pelo fabricante (Aperture Numerical = 1,4, Distância de Trabalho = 0,12 mm; ver Tabela de Materiais).
NOTA: É importante escolher o óleo apropriado da imersão para a temperatura em que a imagem latente é conduzida. - Carregue o prato inferior de vidro contendo amostra na carcaça do metal (caixão) e deslize delicadamente na braçadeira do estágio.
- Use o botão de ajuste grosseiro para elevar o objetivo até que o óleo faz contato com o fundo de vidro do prato. Use a parte do olho e o botão fino do ajuste para trazer a amostra no foco. Uma vez que as células estão em foco vire o botão do pedaço do olho para o modo da câmera, movendo o interruptor seletor localizado na frente do corpo do microscópio para a esquerda.
- Comece a experimentar usando o software de imagem. Na janela resolve3D, selecione o ícone da experiência do projeto/funcionamento descrito por uma garrafa. Uma nova caixa de diálogo deve aparecer intitulada experiência de design/execução.
- Defina o número de z-pilhas e espessura da amostra usando o projeto e, em seguida, a guia de secção sobre o projeto / executar a caixa de diálogo experimento.
NOTA: Para os experimentos na seção de resultados representativos, foram utilizadas 17 pilhas z a 200 nm para imagens estáticas e quatro pilhas Z a um intervalo de 200 nm para microscopia de timelapse. - Para medir a espessura das células da amostra, ajuste manualmente o plano Z incrementalmente usando as setas para cima e para baixo na caixa de diálogo resolve3D. Marque onde as células ficam fora de foco como o limite superior e inferior para a aquisição de imagem. Importe essas informações antes de executar o experimento.
- Para ajudar a minimizar a fototoxicidade e o fotobranqueamento durante a imagem de timelapse, reduza o número de pilhas Z e escolha o plano médio das células para aquisição de imagem.
- Defina o número de z-pilhas e espessura da amostra usando o projeto e, em seguida, a guia de secção sobre o projeto / executar a caixa de diálogo experimento.
- Selecione o conjunto de filtro apropriado para o experimento usando o projeto e, em seguida, canaliza a aba na caixa de diálogo de experimentos de design/execução (TRITC: EX 542/27; EM 597/45; FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).
- Além disso, selecione uma referência para a coleta de informações POL/DIC. Ajuste a transmissão percentual (intensidade de luz) e a duração da exposição para canais individuais selecionados antes da imagem, selecionando as opções apropriadas na caixa de diálogo resolve3D.
NOTA: Em um campo de visão de teste que não é considerado para o teste do experimento, essas configurações para identificar se os parâmetros selecionados obtêm dados significativos de fluorescência sem perder sinal fraco ou supersá-los. Em seguida, importe esses parâmetros para a configuração experimental.
- Além disso, selecione uma referência para a coleta de informações POL/DIC. Ajuste a transmissão percentual (intensidade de luz) e a duração da exposição para canais individuais selecionados antes da imagem, selecionando as opções apropriadas na caixa de diálogo resolve3D.
- Abra a lista de pontos selecionando o botão de lista pontos na caixa de diálogo resolve3D. Uma nova caixa de diálogo deve aparecer na lista de pontos. Marque vários campos de vista para serem usados no experimento encontrando campos de visão apropriados usando os controles de estágio do microscópio e selecionando a opção de ponto de marca na caixa de diálogo da lista de pontos.
NOTA: Um ponto de substituição terá que ser selecionado cada vez que o microscópio é redirecionado em um ponto na lista de pontos. Isso pode ser feito concentrando o microscópio no ponto apropriado na lista e, em seguida, selecionando o botão de ponto de substituição. É importante não tocar no botão de ajuste grosseiro/fino analógico ao reorientar; use apenas o software para ajustar o foco. - Defina parâmetros de timelapse selecionando primeiro o design e, em seguida, a guia timelapse na caixa de diálogo de experimentos de design/execução. Selecione a caixa de seleção de timelapse. Digite os parâmetros de lapso de tempo apropriados em termos de imagens timelapse / tempo total.
- Definir pontos a serem imageados a partir da lista de pontos, selecionando primeiro o design e, em seguida, os pontos de guia sobre o design / executar experiência dialogar. Selecione a opção de lista de pontos de visita e digite pontos para serem imagemdos na caixa de texto separados por commas ou hífens se for uma sequência completa.
- Antes de iniciar um experimento, eite nomes de arquivos e locais de arquivo usando a guia de execução na caixa de diálogo de design/execução. A localização do arquivo pode ser alterada selecionando o botão de configurações, selecionando a pasta de dados e, em seguida, selecionando a pasta apropriada ou criando uma nova. Alterar os nomes dos arquivos, inserindo o novo nome do arquivo na caixa de texto do nome do arquivo de imagem.
- Comece o experimento selecionando o botão de reprodução na caixa de diálogo do experimento começar.
NOTA: Para timelapse, verifique continuamente o foco em cada campo de visão ao longo do experimento usando configuração DIC (para evitar fotobranqueamento desnecessário) e reorientar e atualizar as informações na lista de pontos como as células tendem a sair de foco ao longo do tempo.
4. Processamento de imagem
- Abra os arquivos de imagem brutos (R3D) desejados para geração de números.
NOTA: Arquivos recentemente salvos podem ser localizados usando o botão de pasta de dados na caixa de diálogo inicial do software de imagem. - Executar o programa de desconvolução, para remover fora de foco fluorescência luz7,8, a fim de produzir um arquivo de imagem D3D desconvolved. Selecione a guia de processo na caixa de diálogo inicial e, em seguida, selecione desconvolve. Uma nova caixa de diálogo aparecerá intitulada deconvolve.
- Defina os parâmetros de desconvolturação arrastando o número de imagem apropriado (localizado no canto superior esquerdo de cada arquivo de imagem) para a entrada na caixa de diálogo de deconvolução. Na caixa de diálogo de desconvolução, selecione o botão mais opções e desselecione o rolloff de fronteira de culturas após o processamento da caixa de verificação (caso contrário, as imagens não podem ser sobrepostas sobre o arquivo DIC correspondente).
- Clique no botão faça-o na caixa de diálogo de desconvolução para desconvolve arquivo de imagem crua.
NOTA: Os parâmetros de desconvoltura poderiam ser ajustados conforme indicado pelo manual de orientação do fabricante de software para os resultados desejados.
- Se necessário, realize subtração manual de ruído de fundo e ajuste de brilho/contraste em qualquer ou qualquer canal de comprimento de onda (cor). Faça isso selecionando o botão de ajuste de contraste no arquivo de imagem desconvolved.
- Salve a imagem como um arquivo TIFF selecionando primeiro a opção de arquivo na parte superior da caixa de diálogo D3D. Em seguida, selecione salvar como TIFF, identificar e selecionar as pilhas Z apropriadas (que estão dentro do foco), selecione ou desselecione os conjuntos de filtro desejados.
- Realize a quantificação de dados usando qualquer software fornecido pelo fabricante ou programas disponíveis gratuitamente, como o ImageJ5.
- Para quantificação do tamanho da célula clique na guia da ferramenta no arquivo de imagem D3D apropriado e, em seguida, selecione a opção de distâncias de medida. Medir distâncias selecionando pontos de partida e final no arquivo de imagem desejado usando o mouse através de cliques esquerdos.
NOTA: É melhor ampliar a imagem durante a quantificação do tamanho celular. - Para quantificação do sinal de fluorescência use a opção de inspetor de dados a guia de ferramentas no arquivo de imagem D3D apropriado.
NOTA: É melhor ampliar a imagem e ter apenas filtros relevantes selecionados ao completar a quantificação do sinal de fluorescência. - Para quantificar o sinal de fluorescência, desenhe uma caixa com opção de coluna/linha definida como dimensão específica. Selecione uma área com sinal para ser quantificado e registre o valor. Medir o sinal de fundo usando a caixa do mesmo tamanho para selecionar uma área imediatamente fora das células. Subtraia o valor de fundo do valor registrado a partir do sinal de fluorescência obtido dentro da célula.
- Para quantificação do tamanho da célula clique na guia da ferramenta no arquivo de imagem D3D apropriado e, em seguida, selecione a opção de distâncias de medida. Medir distâncias selecionando pontos de partida e final no arquivo de imagem desejado usando o mouse através de cliques esquerdos.
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Representative Results
Fenótipos gpsb
Anteriormente, mostramos que o Sa-GpsB é uma proteína essencial, pois o esgotamento do GpsB usando um RNA antisenso resulta em lysiscelular 9. Aqui descrevemos como o surgimento de vários fenótipos de divisão celular e mudanças na localização de proteínas poderiam ser capturados usando o protocolo de microscopia timelapse descrito neste artigo. Para este fim, S. aureus cepas RB143 [SH1000 abrigando pEPSA5 (vetor vazio)] e GGS8 [SH1000 abrigando pGG59 (Pxyl-gpsBantisenseblacat)] relatado anteriormente9, foram cultivadas da seguinte forma. Cepas RB143 e GGS8 foram inoculadas em 2 mL de caldo de soja tripptic (TSB) complementado com 5 μg/mL chloramphenicol (clorato) em um tubo de ensaio de 15 mL e foram incubados durante a noite em 22 °C enquanto tremiam. As culturas durante a noite foram diluídas 1:20 em 10 mL de TSB fresco + cloro em um frasco de 125 mL e cultivadas a 37 °C com agitação até a fase logarítica média (OD600 = 0,5). O indutor, 1% de xilose, foi adicionado ao meio de cultura para desencadear a expressão de RNA antisenso de gpsB e a cultura foi cultivada por mais 3 h. As células foram então manchadas com corante fluorescente FM4-64 (mancha de membrana), quando necessário, pela adição de 0,5 μL de um estoque de 10 μg/mL de FM4-64 diretamente sobre o 5 μL aliquot da cultura no prato de microscópio, conforme descrito na seção. Como mostrado na Figura 1 e Vídeo 1, adição de xilose para induzir cepa GGS8 resultou em um fenótipo de célula "doente", como descrito anteriormente9, enquanto o controle vetorial vazio (RB143) parecia semelhante ao nosso controle de células cultivadas na ausência de indutor.
Nosso grupo também relatou que a superprodução de S. aureus GpsB (Sa-GpsB) interrompe a divisão celular em B. subtilis9. Usamos esse fenômeno de superexpressão como um exemplo para demonstrar o protocolo descrito aqui. Para este fim, um B. subtilis estirpe GG9(amyE::Phyperspank-gpsBSaspc; ftsAZ::ftsAZ-gfpΩerm) foi usado9. A localização subcelular do FtsZ, uma proteína chave da divisão celular que marca os locais de divisão celular10,11,foi usada para monitorar o status da divisão celular. A amostra para microscopia foi preparada da seguinte forma. Uma única colônia de GG9 foi inoculada em 2 mL Luria-Bertani (LB) médio e incubado durante a noite em 22 °C em um agitador incubadora. As culturas durante a noite foram 1:20 em 10 mL de LB fresco, e cresceu a 37 °C com agitação até a fase logarítica média (OD600 = 0,5). As células GG9 (5 μL aliquot) a serem imagemdas foram colocadas na parte inferior de um prato de cultura de fundo de vidro e cobertas com uma almofada de agarose de 1% feita com LB complementada com 250 μM (concentração final) de β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) para induzir a expressão de Sa-gpsB (Figura 2 e Vídeo 2). A microscopia timelapse e a quantificação do comprimento celular foram realizadas conforme descrito na seção protocolar.
Inibição de FtsZ
FtsZ, sendo uma proteína essencial para a divisão celular, é considerado um alvo de drogas atraente e vários grupos estão desenvolvendo inibidores FtsZ como uma forma de desenvolver novos antibióticos12. Os padrões de localização de FtsZ ou uma das proteínas associadas a ele, como o ZapA, podem ser usados como repórter para estudar e/ou identificar novos compostos antimicrobianos. Usamos o protocolo fornecido aqui para demonstrar essa abordagem usando S. aureus RB197 [SH1000 abrigando pRB42 (PCd-zapASa-gfp bla erm)]9 e B. subtilis PE92 (ftsAZ:ftsAZ-gfΩperm)13 cepas. Cepas RB197 e PE92 foram cultivadas como descrito acima no TSB (contendo eritromicina de 5 μg/mL; e 1,25 μM CdCl2 para induzir a expressão de zapA-gfp)e LB, respectivamente. Na fase mid-logathmic, um inibidor bem-caracterizado de FtsZ, PC19072314,15,foi adicionado na concentração final de 2 μg/mL e seu efeito nas pilhas do S. aureus e do B. subtilis foi monitorado usando a microscopia em intervalos de tempo diferentes (figura 3 e figura 4). A quantificação do diâmetro celular de S. aureus e o comprimento celular de B. subtilis foi realizada conforme descrito na seção protocolar.
Figura 1: Micrografia de alta resolução das células de S. aureus exibindo fenótipo doente. Micrografias de fluorescência de cepas de S. aureus abrigando um vetor vazio (à esquerda; RB143) ou uma cópia indutível de RNA antisense do gpsBSa (à direita; GGS8) na presença e ausência de 1% de xilose (indutor). As células foram manchadas com manchas de membrana FM4-64 (estoques dissolvidos em água estéril) e imagens usando conjunto de filtro TRITC. Barra de escala: 1 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Dados representativos que mostram a inibição da divisão celular em B. subtilis. (A) Micrografias timelapse de B. subtilis cepa GG9 com imagens adquiridas em intervalos de 20 minutos para 120 min usando os canais DIC / FITC. Os dados de fluorescência de FtsZ-GFP (verde) são mostrados. As setas seguem uma célula durante todo o experimento. Barra de escala: 1 μm. (B) Quantificação de comprimentos celulares em todos os pontos de tempo. O comprimento médio da pilha com barras de erro que indicam o desvio padrão (n = 50) é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Investigação do curso de tempo da inibição da divisão de pilha no aureus do S.. (A) Células de fase logarítica média de cepa RB197 não tratadas (superior) ou tratadas (inferior) com inibidor ftsz (PC190723), após 30 min crescimento, alíquotas de culturas em crescimento foram tomadas a cada 10 minutos para 90 minutos e imagem usando dic e fitc filtro conjuntos. A fluorescência de ZapA-GFP é mostrada. Barra de escala: 1 μm. (B)Quantificação de dados de microscopia. A largura média das células com barras de erro indicando desvio padrão (n = 50) e porcentagem de células (n = 50) exibindo localização zapa-GFP adequada (célula média e periferia) são mostradas. Os pontos de dados das células tratadas com inibidor são mostrados em vermelho. Formas com contorno verde correspondem ao eixo Y direito. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Investigação da inibição da divisão celular por um inibidor sintético em B. subtilis. B. cepa subtilis PE92 foi não tratada ou tratada com um inibidor ftsz (PC190723) em fase mid-logathmic e foram monitorados para os 90 min subseqüentes Aliquots de culturas crescentes foram tomadas a cada 10 minutos para microscopia e imagens foram adquiridas usando canais DIC / FITC. A fluorescência de FtsZ-GFP é mostrada. Barra de escala: 1 μm. (B)Quantificação de dados de microscopia. O comprimento médio da célula com barras de erro indicando desvio padrão (n = 50) e porcentagem de células (n = 50) exibindo localização ftsz-GFP de célula média adequada são mostrados. Os pontos de dados das células tratadas com inibidor são mostrados em vermelho. Formas com contorno verde correspondem ao eixo Y direito. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Vídeo 1: Microscopia Timelapse de células de S. aureus desenvolvendo fenótipo doente. Strain GGS8(gpsB antisense) tratado com 1% de xilose. As células foram manchadas com mancha de membrana FM4-64 e imagemdas em intervalos de 10 minutos para 60 min usando o canal TRITC, conforme descrito no protocolo. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Superexpressão de Sa-gpsB leva à inibição da divisão celular em B. subtilis. Vídeo timelapse mostrando filamentação e mudança na localização ftsz-GFP em GG9. As imagens foram tiradas em intervalos de 20 minutos por 120 min usando canais DIC e FITC. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
| Espécie | Tensão | Genótipo | Referência | |
| S. aureus S. aureus | RB143 RB143 | SH1000 pEPSA5, bla, gato | Eswara eoutros, 2018 | |
| S. aureus S. aureus | GGS8 GGS8 | SH1000 pGG59 (espinha dorsal pEPSA5) Pxyl-gpsBantisense, bla, gato | Eswara eoutros, 2018 | |
| S. aureus S. aureus | RB197 RB197 | SH1000 pRB42 (espinha dorsal pJB67) PCd-zapASA-gfp, bla, gato | Eswara eoutros, 2018 | |
| B. subtilis B. subtilis | GG9 GG9 | amyE::Phyperspank-gpsBSA spc; ftsAZΩftsAZ-gfp erm ftsAZΩftsAZ-gfp erm | Eswara eoutros, 2018 | |
| B. subtilis B. subtilis | PE92 PE92 | ftsAZ::ftsAZ-gfp Ωerm ftsAZ::ftsAZ-gfp Ωerm | Brzozowski eoutros, 2019 | |
Tabela 1: Cepas usadas.
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Discussion
A microscopia permaneceu um pilar nos estudos relativos a organismos microbianos. Dado o tamanho das células em escala de mícron, estudos de nível unicelular têm tradicionalmente invocado microscopia eletrônica (EM). Embora em tornou-se uma técnica bastante poderosa nos últimos anos, ele tem suas próprias limitações intrínsecas, além de acesso limitado ao usuário16. Melhorias nas técnicas de microscopia de fluorescência e desenvolvimento de diferentes sondas fluorescentes, como a FDAA3,forneceram aos biólogos de células microbianas uma vasta gama de ferramentas para estudar vários processos celulares em células vivas. Os pesquisadores também estão ativamente construindo ferramentas fluorescentes para monitorar mudanças, por exemplo, no nível de moléculas de sinalização, como c-di-GMP, entre outros, em células vivas17,18. Além disso, a microscopia de fluorescência de lapso de tempo de alta resolução permite que os investigadores monitorem as mudanças à medida que elas acontecem e estudem fenótipos relevantes.
Fornecemos protocolos detalhados para realizar experimentos de microscopia com um microscópio de fluorescência de alta resolução (ver Tabela de Materiais). No entanto, as etapas nos protocolos poderiam ser alteradas para atender às necessidades do usuário e do microscópio utilizado. Usamos S. aureus e B. subtilis como nossos organismos modelo para mostrar como monitorar vários fenótipos de divisão celular, acompanhar as mudanças na localização de proteínas e quantificar os dados. Além disso, para os casos em que timelapse não é propício, mostramos com a ajuda de um inibidor FtsZ, como configurar um experimento de curso de tempo.
A limitação inerente à microscopia de fluorescência é a resolução estabelecida pelo limite de difração, que poderia ser superada, em certa medida, com o auxílio de técnicas avançadas de microscopia de superresolução19,20. Outros problemas, como fototoxicidade e fotobranqueamento, podem ser contornados coletando menos pilhas z ou minimizando a duração e/ou frequência de exposição a laser. Outros materiais de orientação específicos para microscopia de células vivas estão disponíveis21. Além de gram-positivoorganismos B. subtilis e S. aureus, usando esta configuração, temos com sucesso imagem Gram-negativa bactéria Escherichia coli, levedura Saccharomyces cerevisiae, e nematode Caenorhabditis elegans.
Além dos experimentos descritos aqui, metodologias semelhantes poderiam ser usadas para identificar compostos que visam processos celulares específicos de forma de alta qualidade. Algoritmos que automatizam o processo de quantificação também podem ser incorporados para grandes conjuntos de dados22,23. Há uma imensa necessidade de estudar diferentes espécies bacterianas para enfrentar a crise de resistência aos antibióticos e mais estudos são necessários para compreender os mecanismos dos processos biológicos básicos e identificar novos compostos terapêuticos. Várias técnicas de microscopia de fluorescência ganharam o poder e o impulso para ajudar os pesquisadores a enfrentar esses desafios, entre outros.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos aos nossos membros do laboratório por seus comentários sobre este artigo. Este trabalho foi financiado por uma concessão start-up da Universidade do Sul da Flórida (PE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade - Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber - opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
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