Summary

Uso de ensayos de entrada viral y análisis de acoplamiento molecular para la identificación de candidatos antivirales contra el coxsackievirus A16

Published: July 15, 2019
doi:

Summary

El objetivo del protocolo es ilustrar los diferentes ensayos relacionados con la entrada viral que se pueden utilizar para identificar los inhibidores de entrada viralcandidatos.

Abstract

Los ensayos antivirales que examinan mecanísticamente la entrada viral son pertinentes para discernir en qué paso los agentes evaluados son más eficaces y permiten la identificación de los inhibidores de entrada viralcandidatos. Aquí, presentamos los enfoques experimentales para la identificación de moléculas pequeñas capaces de bloquear la infección por el coxsackievirus No envuelto A16 (CVA16) a través de la orientación a las partículas del virus o pasos específicos en la entrada viral temprana. Los ensayos incluyen el análisis de tiempo de adición de fármacos, el ensayo de unión viral basado en citometría de flujo y el ensayo de inactivación viral. También presentamos un protocolo de acoplamiento molecular que utiliza proteínas cápside de virus para predecir posibles residuos dirigidos por los compuestos antivirales. Estos ensayos deben ayudar en la identificación de agentes antivirales candidatos que actúan sobre la entrada viral. Las instrucciones futuras pueden explorar estos posibles inhibidores para el desarrollo de fármacos adicionales.

Introduction

La enfermedad de manos, pies y boca (HFMD) es una enfermedad más comúnmente causada por el coxsackievirus A16 (CVA16) y el enterovirus 71 (EV71) en niños pequeños. Recientemente en toda la región de Asia y el Pacífico, ha habido un repunte significativo en la HFMD inducida por CVA16. Si bien los síntomas pueden ser leves, pueden ocurrir complicaciones graves que afectan el cerebro y el corazón, con una posible letal1,2. En la actualidad, no hay terapias antivirales autorizadas ni vacunas disponibles para CVA16, por lo que es urgente desarrollar estrategias antivirales para frenar futuros brotes y las complicaciones asociadas.

CVA16 es un virus no envuelto que tiene una cápside icosahedral ensamblado a partir de pentámeros que contienen 4 proteínas estructurales, a saber, VP1, VP2, VP3 y VP4. Rodear cada eje de cinco veces en el pentamer es una región ‘canyon’ que se muestra como una depresión y se destaca por su papel en la unión de receptores3. En la parte inferior de este cañón se encuentra un bolsillo hidrófobo en la región de VP1 que contiene un ligando graso natural llamado esfingosina (SPH). Se ha sugerido que los receptores celulares, como el ligando de glicoproteína p -1 (PSGL-1) y el receptor carroñero de la clase B miembro 2 (SCARB2), desempeñen un papel en la unión viral desplazando este ligando que resulta en cambios conformacionales en la posterior expulsión del genoma viral en la célula huésped4,5,6. La identificación de posibles inhibidores que bloquean los sucesivos eventos en el proceso de entrada viral podría proporcionar posibles estrategias terapéuticas contra la infección por CVA16.

Los pasos en el ciclo de vida del virus se pueden diseccionar a través de enfoques experimentales como objetivos para ayudar a identificar agentes antivirales específicos del modo. Un análisis de tiempo de adición de fármacos examina el efecto del tratamiento farmacológico en diferentes momentos durante la infección viral, incluyendo la preentrada (agregada antes de la infección por el virus), la entrada (agregada simultánea a la infección por el virus) y la infección por virus)7. El impacto se puede evaluar utilizando un ensayo de placa estándar cuantificando el número de placas virales formadas en cada una de las condiciones del tratamiento. El ensayo de unión viral basado en citometría de flujo determina si el medicamento evita la unión viral a las células huésped. Esto se logra cambiando la temperatura de 37 oC, a la que se producen la mayoría de las infecciones por virus humanos, a 4 oC, donde los viriones son capaces de unirse a la superficie de la célula huésped pero no pueden entrar en las células7. Las partículas del virus unido a la membrana celular se cuantifican a través de la inmunomancha contra los antígenos virales y se evalúan mediante citometría de flujo. El ensayo de inactivación viral, por otro lado, ayuda a evaluar posibles interacciones físicas del fármaco con partículas de virus libres, ya sea protegiendo o neutralizando los viriones, o causando agregaciones o cambios de conformación que los hacen inactivos para interacciones posteriores con la superficie de la célula huésped durante la infección8,9. En este experimento, el inóculo viral se permite incubar primero con el fármaco antes de ser diluido para valorar la droga antes de infectar a la monocapa de la célula huésped y realizar un ensayo de placa estándar8. Por último, el acoplamiento molecular es una poderosa herramienta para predecir posibles sitios de interacción farmacológica en la superficie del virión, incluidas las glicoproteínas virales de los virus envueltos y las proteínas cápside virales de virus no envueltos, mediante el uso de virus computacionales Algoritmos. Esto ayuda a identificar mecanísticamente los objetivos del modo de acción de la droga y proporcionar información útil que puede ser validada aún más por ensayos posteriores.

Recientemente empleamos los métodos descritos anteriormente para identificar compuestos antivirales que bloquearon eficientemente la infección por el CVA169no envuelto. En este documento, se describen y discuten los protocolos detallados que se utilizaron.

Protocol

NOTA: Todos los cultivos celulares y las infecciones por virus deben llevarse a cabo en campanas de bioseguridad certificadas que sean adecuadas para el nivel de bioseguridad de las muestras que se manipulan. Las dos moléculas pequeñas de ácido quebulágico (CHLA) y punicalagin (PUG), quese observaron para bloquear eficientemente la infección CVA16 9, se utilizan como ejemplos de agentes inhibidores candidatos. Para los principios básicos en técnicas virológicas, propagaci?…

Representative Results

El ensayo de tiempo de adición de fármacos está indicado en la Figura 1 y muestra la influencia del tratamiento utilizando las moléculas pequeñas CHLA y PUG en la infección CVA16, ya sea la entrada previral (pretratamiento), durante la entrada viral (adición co-similar) o la entrada postviral ( post-infección). Ambas moléculas pequeñas sólo produjeron un impacto marginal contra la infectividad CVA16, ya sea en el pretratamiento de las células hué…

Discussion

En este informe, describimos los protocolos que son útiles para la identificación de candidatos antivirales que se dirigen a la entrada viral, en particular contra el CVA16 no envuelto. Los ensayos están diseñados de manera sectización de los primeros eventos durante la entrada viral, lo que es útil para aclarar el mecanismo o mecanismos de acción y los posibles objetivos de la actividad antiviral de los agentes de prueba. El “ensayo de tiempo de adición de fármacos” permite determinar ampliamente el objetivo po…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores están agradecidos al Dr. Joshua Beckham de la Universidad de Texas en Austin por el apoyo técnico con acoplamiento molecular. Este estudio fue apoyado en parte por la financiación del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MOST107-2320-B-037-002 a C.-J.L. y L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 y MOST107-2320-B-038-034-MY3 a L.-T.L.).

Materials

4% Paraformaldehyde Sigma AL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG Invitrogen A11029
Amphotericin B GIBCO 15290-018
Anti-VP1 antibody Merck-Millipore MAB979 Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter Cytometer Beckman Coulter FC500
Corina Molecular Networks GmbH
Crystal violet Sigma C3886-100G
DMEM GIBCO 11995-040
DMSO Sigma D5879
FBS GIBCO 26140-079
Formaldehyde Sigma F8775
Graphpad Prism GraphPad
Heparin sodium salt Sigma H3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
Methylcellulose Sigma M0512-100G
PBS pH 7.4 GIBCO 10010023
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
PyMol Schrödinger
UCSF Chimera University of California, San Francisco

References

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Wang, J. Y., Lin, C., Liu, C., Lin, L. Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16. J. Vis. Exp. (149), e59920, doi:10.3791/59920 (2019).

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