Summary
L'obiettivo del protocollo è quello di illustrare i diversi saggi relativi all'ingresso virale che possono essere utilizzati per identificare gli inibitori di ingresso virale candidati.
Abstract
I test antivirali che esaminano meccanicamente l'ingresso virale sono pertinenti a discernere a quale passo gli agenti valutati sono più efficaci e consentono l'identificazione degli inibitori di ingresso virale candidati. Qui presentiamo gli approcci sperimentali per l'identificazione di piccole molecole in grado di bloccare l'infezione da parte del coxsackievirus non avvolto A16 (CVA16) attraverso il targeting delle particelle di virus o passaggi specifici nell'inserimento virale precoce. I saggi includono l'analisi del tempo di aggiunta della droga, il saggio di legame virale basato sulla citometria del flusso e l'analisi dell'inattivazione virale. Presentiamo anche un protocollo di attracco molecolare che utilizza proteine di capside virus per prevedere i potenziali residui presi di mira dai composti antivirali. Questi saggi dovrebbero aiutare nell'identificazione degli agenti antivirali candidati che agiscono sull'ingresso virale. Le direzioni future possono esplorare questi possibili inibitori per un ulteriore sviluppo di farmaci.
Introduction
La malattia della mano, dell'afta epizootica e della bocca (HFMD) è una malattia più comunemente causata dal coxsackievirus A16 (CVA16) e dall'enterovirus 71 (EV71) nei bambini piccoli. Recentemente in tutta la regione Asia-Pacifico, c'è stato un significativo aumento dell'HFMD indotto da CVA16. Mentre i sintomi possono essere lievi, possono verificarsi gravi complicazioni che colpiscono il cervello e il cuore, con potenziale fatalità1,2. Attualmente non sono disponibili terapie antivirali o vaccinazioni autorizzate per CVA16, per cui è urgente sviluppare strategie antivirali per frenare i futuri focolai e le relative complicanze.
CVA16 è un virus non inviluppo che ha un capside icosaedrio assemblato da pentamers che contengono ciascuno 4 proteine strutturali vale a dire VP1, VP2, VP3 e VP4. Intorno ad ogni asse di cinque volte nel pentamer è una regione 'canyon' che mostra come una depressione ed è nota per il suo ruolo nel legame recettore3. In fondo a questo canyon si trova una tasca idrofobica nella regione VP1 che contiene un ligando grasso naturale chiamato sphingosine (SPH). I recettori cellulari, come il ligando umano P selectin glicoprotein a 1 (PSGL-1) e il membro di classe B (SCARB2) del recettore scaventro, sono stati suggeriti per svolgere un ruolo nell'associazione virale spostando questo ligando che si traduce in cambiamenti conformazionali al successiva espulsione del genoma virale nella cellula ospite4,5,6. L'identificazione di possibili inibitori che bloccano gli eventi successivi nel processo di ingresso virale potrebbe fornire potenziali strategie terapeutiche contro l'infezione da CVA16.
Le fasi del ciclo di vita del virus possono essere sezionate attraverso approcci sperimentali come obiettivi per aiutare a identificare agenti antivirali specifici della modalità. Un'analisi del tempo di aggiunta di droga esamina l'effetto del trattamento farmacologico in momenti diversi durante l'infezione virale, tra cui l'ingresso preliminare (aggiunto prima dell'infezione da virus), l'ingresso (aggiunto in concomitanza all'infezione da virus) e il post-ingresso (aggiunto a seguito della infezione da virus)7. L'impatto può essere valutato utilizzando un saggio standard della placca quantificando il numero di placche virali formate in ciascuna delle condizioni di trattamento. L'andetto di legame virale basato sulla citometria del flusso determina se il farmaco impedisce l'attaccamento virale alle cellule ospiti. Ciò si ottiene spostando la temperatura da 37 gradi centigradi, alla quale si verifica la maggior parte delle infezioni da virus umani, a 4 gradi centigradi, dove i virioni sono in grado di legarsi alla superficie della cellula ospite ma non sono in grado di entrare nelle cellule7. Le particelle di virus legate alla membrana cellulare vengono quindi quantificate attraverso l'immunostaining contro gli antigeni virali e valutate in base alla citometria di flusso. L'analisi dell'inattivazione virale, d'altra parte, aiuta a valutare le potenziali interazioni fisiche del farmaco con particelle di virus libere, schermaturando o neutralizzando i virioni, o causando aggregazioni o cambiamenti conformazionali che li rendono inattivi per successive interazioni con la superficie della cellula ospite durante l'infezione8,9. In questo esperimento, l'inoculo virale è permesso di incubare prima con il farmaco prima di essere diluito per titolare il farmaco prima di infettare il monostrato della cellula ospite ed eseguire un saggio di placca standard8. Infine, l'aggancio molecolare è un potente strumento per prevedere potenziali siti di interazione farmacologica sulla superficie del virione, tra cui le glicoproteine virali dei virus avvolti e le proteine capside virali da virus non avvolti, utilizzando il computazionale Algoritmi. Questo aiuta a individuare meccanicamente meccanicamente i bersagli della modalità di azione del farmaco e fornire informazioni utili che possono essere ulteriormente convalidate dai saggi a valle.
Recentemente abbiamo impiegato i metodi sopra descritti per identificare i composti antivirali che bloccavano in modo efficiente l'infezione da CVA169 noninvilita. Qui di seguito, i protocolli dettagliati che sono stati utilizzati sono descritti e discussi.
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Protocol
NOT: Tutte le colture cellulari e le infezioni da virus devono essere condotte in cappe di biosicurezza certificate appropriate per il livello di biosicurezza dei campioni trattati. I due tannini-classe di piccole molecole di acido chebulagico (CHLA) e punicalagin (PUG), che sono stati osservati per bloccare in modo efficiente l'infezione CVA169, sono utilizzati come esempi di agenti inibitori candidati. Per i principi di base nelle tecniche di virologia, propagazione del virus, determinazione del tibieto del virus, e concetti di unità formanti placca (PFU) o molteplicità di infezione (MOI), il lettore è indicato al riferimento10.
1. Coltura cellulare, preparazione dei virus, preparazione composta e citotossicità composta
- Le cellule umane di rhabdomyosarcoma (RD) sono cellule ospiti permesse all'infezione da CVA1611. Far crescere le cellule RD in 10 mL del mezzo aquila (DMEM) modificato di Dulbecco integrato con siero bovino fetale 10% (FBS), 200 U/mL penicillinA G, 200 streptomici e 0,5 g/mL amphotericin B in flaconi T-75 a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO2 del 5%.
- Preparare il CVA16 propagando il virus nelle cellule RD e determinare il titro virale in PFU/mL. Per il protocollo ottimizzato, fare riferimento al riferimento11.
- Preparare i composti e i controlli di prova utilizzando i rispettivi solventi: ad esempio, sciogliere CHLA e PUG nel solfuro dimetilo (DMSO). Per tutte le fasi di infezione, il mezzo basale consisteva di DMEM più 2% FBS e antibiotici.
NOT: La concentrazione finale di DMSO nei trattamenti composti di prova è uguale o inferiore allo 0,25% negli esperimenti; 0,25% DMSO è incluso come trattamento di controllo negativo nei saggi per il confronto. - Eseguire la citotossicilità dei composti di prova sulle cellule RD utilizzando un reagente determinante per la vitalità cellulare come XTT ((2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide). Per il protocollo dettagliato, fare riferimento al riferimento12. Determinare le concentrazioni di citotossicità dei composti di prova utilizzando un software analitico come GraphPad Prism secondo il protocollo del produttore. Concentrazioni di droga che non influenzano in modo significativo la vitalità cellulare ( cellule vitali del 95%) sono utilizzate per il resto dello studio.
2. Tempo di -farmaco-aggiunta di assaggio
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Valutare l'influenza dei farmaci sulle cellule ospiti prima dell'infezione virale (pretrattamento)
- Semina cellule RD in piastre 12-well ad una densità di semina di 2 x 105 cellule / bene. Incubare durante la notte a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO2 del 5% per ottenere un monostrato.
- Trattare le cellule RD con composti di prova a concentrazioni non citossiche (determinate dal passaggio 1,4) in 1 mL di volume del supporto basale per 1 h o 4 h.
- Lavare le cellule con 1-2 mL di PBS prima di aggiungere 50 PFU/pozze di virus in mezzo basale (il volume finale dell'inoculum è di 300 gradi) per 1 h. Rocciare la piastra ogni 15 min.
- Dopo l'infezione, lavare nuovamente i monostrati utilizzando PBS, quindi sovrapporsi a 1 mL di supporti basali contenenti 0,8% di metilcellulosa per un'ulteriore incubazione a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO2 del 5%.
- Dopo 72 h di incubazione, rimuovere il supporto di sovrapposizione e lavare i pozze utilizzando 2 mL di PBS.
- Fissare i pozzi utilizzando 0,5 mL di 37% formaldeide per 15 min.
- Rimuovere il supernatante e lavare di nuovo con PBS.
- Macchiare i pozzi utilizzando 0,5 mL di 0,5% soluzione viola cristallo. Quindi rimuovere la soluzione di macchia entro 2 min e lavare i pozzi con un flusso delicato di acqua prima dell'essiccazione dell'aria.
- Contare le placche virali mettendo la piastra su una scatola di luce bianca. Calcolare la percentuale (%) Infezione CVA16 come segue: (Mean n. di virus placca/Droga media ' di virus placca -controllo DMSO) - 100%.
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Per valutare l'effetto dell'aggiunta dei farmaci e del virus contemporaneamente (co-aggiunta)
- Semina cellule RD in piastre 12-well ad una densità di semina di 2 x 105 cellule / bene. Incubare durante la notte a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO2 del 5% per ottenere un monostrato.
- Trattare le cellule RD con i composti di prova alle concentrazioni appropriate e 50 PFU/po di CVA16 (il volume finale dell'inoculum è di 300 gradi) contemporaneamente per 1 h. Rocciare la piastra ogni 15 min.
- Lavare le cellule con 1 mL di PBS e poi sovrapporsi a 1-2 mL di supporti basali contenenti 0,8% di metilcellulosa per un'ulteriore incubazione a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO2 del 5%.
- Macchie virali con cristallo viola dopo 72 h dopo l'infezione e determinare l'% CVA16 infezione come descritto sopra.
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Valutare l'effetto del trattamento farmacologico dopo l'ingresso virale (post-infezione)
- Semina cellule RD in piastre 12-well ad una densità di semina di 2 x 105 cellule / bene. Incubare durante la notte a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO2 del 5% per ottenere un monostrato.
- Inoculare le celle RD con 50 PFU/pozzetto di CVA16 (il volume finale dell'inoculum è di 300 gradi) per 1 h. Rocciare la piastra ogni 15 min.
- Lavare i pozze con 1-2 mL di PBS e sovrapporre le cellule con supporti basali contenenti 0,8% di metilcellulosa e le concentrazioni appropriate di composti di prova.
- Macchie virali con cristallo viola e contare dopo 72 h dopo l'infezione e determinare la% incubazioni di infezione CVA16 descritte sopra.
NOT: Eseguire delicatamente tutti i lavatori PBS per evitare di sollevare le cellule.
3. Ansaggio di rilegatura basato su citometria di flusso
- Semina cellule RD in piastre 12-well ad una densità di semina di 2 x 105 cellule / bene. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO2 del 5% per ottenere un monostrato.
- Pre-raffreddare il monostrato di cellule a 4 gradi centigradi per 1 h.
- Infettare le cellule RD con CVA16 (MOI - 100) in presenza e assenza dei composti di prova per 3 h a 4 gradi centigradi.
NOT: Eseguire l'inoculazione virale sul ghiaccio e la conseguente incubazione in un frigorifero a 4 gradi centigradi per mantenere la temperatura a 4 gradi centigradi, che consente la legame virale ma non l'ingresso. - Rimuovere l'inoculum del virus e lavare una volta con 1-2 mL di PBS ghiacciato.
- Sollevare le cellule aggiungendo 1 mL di tampone di dissociazione ghiacciata ai pozzi di ghiaccio per 3 minuti, prima di raccogliere le cellule e risalirle nel buffer di citometria del flusso a freddo ghiaccio (1x PBS più 2% FBS).
- Lavare le cellule due volte usando il buffer di citometria del flusso di ghiaccio e fissare le cellule con 0,5 mL del 4% di paraformaldeide per 20 min sul ghiaccio.
- Lavare le cellule utilizzando PBS per rimuovere eventuali virus non legati o debolmente legati, quindi macchiare le cellule con 1 mL di anticorpo anti-VP1 (1:2,000; diluito in PBS contenente 3% BSA) sul ghiaccio per 1 h, seguito da incubazione con un anti-topo igG con rilegare Alexa 488 (1:250; diluito in PBS contenente il 3% di BSA) sul ghiaccio per 1 h. Eseguire lavamenti PBS (3 volte) a seguito di ogni trattamento anticorpale.
- Risospendere le cellule in 0,5 mL del buffer di citometria a flusso freddo ghiaccio ed eseguire l'analisi della citometria di flusso su un citometro di flusso utilizzando procedure standard. Presentare i dati negli istogrammi utilizzando il software associato e quantizzare per la rappresentazione del grafico a barre.
4. Assay di inattivazione virale
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Eseguire il test di inattivazione virale come descritto in precedenza12 utilizzando le seguenti condizioni:
- Una concentrazione iniziale di 106 PFU/mL di CVA16.
- monostrati a cellule RD in piastre 12 pozze da una densità di semina di 2 x 105 cellule / bene.
- Diluizione 50 volte per esitare i composti farmacologici con conseguente concentrazione finale di virus di 50 PFU/pozzo.
- Lavare i passaggi utilizzando 1-2 mL di PBS.
- Supporti sovrapposti contenenti lo 0,8% di metilcellulosa. - Eseguire la lettura finale dell'infezione virale utilizzando la colorazione viola cristallina della procedura di placche virali come descritto sopra.
5. Analisi dell'attracco molecolare
- Scarica molecole 3D di composti di prova da PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Se le molecole non hanno una struttura 3D caricata, scaricare le strutture 2D o utilizzare la sequenza di stringhe SMILES e trasformarsi in molecole 3D tramite un programma molecolare (ad esempio CORINA).
- Scarica l'unità di assemblaggio biologico virale da RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) e prepara il modello di struttura virale utilizzando un programma di biocomputing (ad esempio UCSF Chimera). Ad esempio, nel caso della struttura cristallina virione matura CVA16 (PDB: 5C4W)3, eliminare i solventi dal file PDB, sostituire le catene laterali incomplete utilizzando i dati della libreria Rotamer di Dunbrach 2010 e aggiungere idrogeno e cariche alla struttura come precedentemente riportato13. Gli obiettivi di attracco possono essere qualsiasi proteina virale rilevante per l'analisi prevista con un'informazione biologica sull'assemblaggio (Protein Data Bank).
-
Dock composti di prova sull'unità antivirus preparata utilizzando ad esempio UCSF Chimera, e analizzare i file di output con un software di visualizzazione (ad esempio, Autodock Vina, PyMol):
- Caricare il file composto di prova in UCSF Chimera come 'ligando' ed eseguire l'attracco cieco selezionando l'intera proteina virale preparata come il 'recettore'. Utilizzare il mouse del computer o trackpad per ridimensionare il volume di ricerca per l'intero 'recettore'. In "Opzioni avanzate", consentire al numero massimo di modalità di rilegatura. I fotogrammi di ancoraggio verranno automaticamente classificati dall'energia di rilegatura più alta a quella più bassa.
- (Facoltativo) Oltre all'attracco cieco, confina il sito di attracco sulla proteina virale nelle regioni di interesse derivate dai risultati dell'attracco cieco utilizzando nuovamente il mouse o il trackpad per ridurre il volume di ricerca (ad es., 100 x 100 x 100). Questo passaggio consente di confermare i risultati dell'attracco cieco e aumenta la specificità.
- Utilizzare un sistema grafico molecolare (ad esempio PyMol) per analizzare le posizioni delle modalità di rilegatura caricando il file di ancoraggio. Trovare contatti polari dal composto alla proteina virale selezionando il "ligando" e identificando i contatti polari con l'opzione "a qualsiasi atomo"; esaminare i risultati.
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Representative Results
Il saggio di aggiunta del tempo della droga è indicato nella Figura 1 e mostra l'influenza del trattamento utilizzando le piccole molecole CHLA e PUG sull'infezione CVA16 sia all'ingresso pre-virale (pretrattamento), durante l'ingresso virale (co-aggiunta), o l'ingresso post-virale ( post-infezione). Entrambe le molecole piccole hanno prodotto solo un impatto marginale contro l'infettività del CVA16 sia nel pretrattamento delle cellule ospiti prima dell'infezione virale (Figura 1A) sia nel trattamento post-infezione (Figura 1C). Al contrario, CHLA e PUG hanno abrogato in modo efficiente l'infezione DaCVA16 di >80% nel trattamento di co-aggiunta (Figura 1B). Queste osservazioni suggeriscono quindi che i due composti sono più efficaci quando sono presenti contemporaneamente con le particelle di virus sulla superficie della cellula ospite durante l'infezione.
Nella Figura 2, l'analisi di associazione basata sulla citometria del flusso (schematicamente illustrata nella figura 2A) conferma che i due tannini impediscono l'ingresso CVA16 impedendo l'associazione di particelle virali alle cellule host. I dati di quantificazione nella figura 2B mostrano che la quantità di virus rilevata sulla superficie della cellula RD in presenza dei due farmaci, è inferiore al 10%, simile al controllo positivo dell'eparina che è noto per impedire l'allegato CVA1614. Le figure 2C, 2De 2E illustrano gli istogrammi di citometria di flusso associati in cui la banda si sposta a causa del rilevamento di CVA16 sulla superficie delle celle RD è significativamente ridotta quando sono presenti CHLA e PUG.
Figura 3A illustrare come è stato eseguito l'esperimento di inattivazione virale. Il composto farmacologico è stato mescolato con le particelle del virus CVA16 e incubato per 1 h (a lungo termine) prima della fase di diluizione, o misto e immediatamente diluito (a breve termine) prima dell'infezione. Come mostrato nella Figura 3B, una pre-incubazione delle particelle CV16 con gli agenti di prova per 1 h ha portato a una protezione quasi completa delle cellule RD contro l'infezione virale rispetto all'incubazione a breve termine e al controllo DMSO. I risultati suggeriscono quindi che sia CHLA che PUG interagiscono con le particelle CVA16 e sono in grado di renderle inattive nella successiva infezione.
Poiché i nostri dati indicano che i composti farmacologici possono inattivare direttamente le particelle CVA16, e quindi identificare il virione stesso come bersaglio plausibile della loro attività antivirale, abbiamo usato l'alloggiamento molecolare per prevedere la potenziale interazione tra questi e il pentamero capside CVA16. La figura 4A mostra una proiezione superficiale del pentamer CVA16 che costituisce il capside icosaedro del virione CVA16. L'attracco molecolare dei tannini CHLA (Figura 4B; verde) e PUG (Figura 4C; blu) indicano che entrambi si prevede che si leghino nella regione canyon del pentamerCVA16. In particolare, entrambe le piccole molecole legate appena sopra l'ingresso tascabile (Figura 4B e 4C, pannelli ingranditi), che detiene il fattore tascabile e svolge un ruolo importante per la mediatura dell'associazione CVA16 e l'ingresso nella cella host. Sia CHLA che PUG sembrano quindi mascherare la regione di ingresso tascabile, che teoricamente ostacolerebbe le interazioni tra le particelle di virus e i recettori delle cellule ospiti. Le figure 4D e 4E indicano i residui unici previsti dai contatti polari di CHLA e PUG, rispettivamente, intorno all'ingresso tascabile, con la maggior parte di queste interazioni che si verificano con VP1 sia per i composti che per i 3 aminoacidi Asn85 , Lys257e Asn417 in comune tra i due tannini.
Figura 1: Effetto di time-of-drug-addition di CHLA e PUG contro l'infettività del CVA16. Le cellule RD sono state trattate con CHLA (20 m) o PUG (25 M) in tempi diversi di inoculazione CVA16 (50 PFU/well). DMSO (0,25%) il trattamento è stato incluso come controllo negativo e tutti i saggi sono stati analizzati dal saggio di placca utilizzando la colorazione viola di cristallo 72 h dopo l'incubazione. (A) Per il pretrattamento, le cellule sono state incubate con i composti di prova per 1 h o 4 h e quindi sono state lavate prima dell'infezione da CVA16. (B) Per i saggi di co-ad-addizione, le cellule sono state somministrate con farmaci e virus contemporaneamente per 1 h e poi lavate. (C) Nella post-infezione, le cellule sono state infettate con CVA16 per 1 h, lavate e quindi trattate con composti di prova. I dati mostrati sono i mezzi e la deviazione standard (SD) da tre esperimenti indipendenti. p < 0,05 rispetto al rispettivo gruppo "solo virus". L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza. Questa cifra è stata adattata dal riferimento9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: CHLA e PUG abolino l'associazione CVA16 alla cella host. (A) Schematico dell'analto vincolante basato sulla citometria del flusso. (B) Le cellule RD (2 x 105 cellule/pozzo) sono state infettate da CVA16 (MOI - 100) in presenza o assenza di CHLA (20 M), PUG (25 m), eparina solubile (500 g/mL, controllo positivo) o DMSO (0,25%, controllo negativo) per 3 h a 4 gradi centigradi. Inocula da pozzi sono stati raccolti in tubi, lavati con PBS due volte, fissati e macchiati con anticorpo anti-VP1 seguito da Alexa 488-coniugato anticorpo secondario per il rilevamento di citometria di flusso di virus legati alla superficie. I dati quantificati dai segnali di fluorescenza rilevati sono stati tracciati come mezzi: sd da tre esperimenti indipendenti nel grafico a barre come "Attacco antivirus (%)". L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza. Vengono mostrati gli istogrammi di citometria di flusso rappresentativi dei trattamenti CHLA (C), PUG (D) ed eparina (E). Questa cifra è stata adattata dal riferimento9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: CHLA e PUG inattivano le particelle di virus CVA16 prive di cellule. (A) Schematico del saggio di inattivazione virale. (B) CVA16 (106 PFU/well) è stato trattato con CHLA (20 M) o PUG (25 M) e mescolato immediatamente per l'inattivazione a breve termine o incubato per 1 h a 37 c per l'inattivazione a lungo termine prima di essere diluito 50 volte a una concentrazione non efficace di prova composti prima di inoculare sulle cellule RD (concentrazione finale di virus : 50 PFU/pozzo). DMSO (0,25%) è stato utilizzato come controllo negativo. Gli esperimenti sono stati analizzati mediante analisi della placca utilizzando la colorazione viola di cristallo 72 h dopo l'infezione. I dati mostrati sono i mezzi: SD da tre esperimenti indipendenti. p < 0,05 rispetto al rispettivo gruppo "solo virus". L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza. Questa cifra è stata adattata dal riferimento9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: CHLA e PUG prendono di mira il capside CVA16 vicino all'ingresso della tasca. Proiezione superficiale della particella virione CVA16 con il pentamer strutturale monomerico delineato da linee rosse (A). I pentaceri aggiuntivi sul virione sono mostrati in ciano, magenta, indaco, bronzo e verde. Analisi di attracco molecolare di CHLA (B, green) e PUG (C, blu) sul pentamero CVA16 (PDB: 5C4W); i pannelli ingranditi sono delimitati in giallo. VP1 - arancione, VP2 - grigio, VP3 - bianco; polari vengono visualizzati come trattini neri. I residui che compongono l'ingresso tascabile sono di colore rosso (Ile94, Asp95, Gln207, Met212, Met213, Lys257, Thr258). D, E. Vista laterale ravvicinata nel canyon dove si trova l'ingresso della tasca e dove CHLA (D) e PUG (E) si legano. I residui unici che sono contatti polari dai contatti polari dei composti sul pentamer sono etichettati in caratteri gialli (VP1), bianchi (VP2) e neri (VP3). La linea tratteggiata bianca indica la regione di ingresso della tasca. Questa cifra è stata adattata dal riferimento9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo rapporto, abbiamo descritto i protocolli che sono utili per l'identificazione di candidati antivirali che prendono di mira l'ingresso virale, in particolare contro il CVA16 non inviluppo. I test sono progettati in modo da sezionare i primi eventi durante l'ingresso virale, il che è utile per chiarire i meccanismi di azione e i potenziali obiettivi dell'attività antivirale degli agenti di prova. Il "saggio del tempo di aggiunta del farmaco" consente di determinare ampiamente il potenziale bersaglio dei composti di prova, ad esempio le cellule ospiti non infette (analisi pretrattamento), le particelle di virus o le sue interazioni con la superficie della cellula ospite (analisi di co-addizione ), o la cellula ospite infettata da virus durante la fase replicativa virale (analisi post-infezione). Questo saggio da solo può determinare il metodo di interazione dai composti (ad esempio, co-aggiunta) che porta ai saggi successivi descritti in questo protocollo (ad esempio, analisi di inattivazione virale e analisi vincolante). Le fasi di lavaggio sono fondamentali per garantire che il metodo di trattamento esaminato sia specifico di quello analizzato. L'uso del "saggio di legame basato sulla citometria di flusso" aiuta a valutare l'influenza dei composti specificamente sul virus vincolante alla cellula ospite. Mantenere la temperatura dell'esperimento a 4 gradi centigradi è importante per la rilevazione finale dei virioni sulla superficie cellulare, in quanto questa temperatura consente il legame virale ma non l'ingresso. Il "saggio di inattivazione virale" può aiutare a determinare la potenziale interazione fisica dei composti farmacologici con le particelle di virus prive di cellule. Il passo critico è la diluizione per titrating fuori i composti di droga a seguito di incubazione con l'inoculo virale, come questo è necessario per prevenire qualsiasi interazione significativa dei farmaci con la superficie della cellula ospite nella successiva infezione passo12.
Poiché l'ingresso virale è un evento a più fasi, una classe di inibitori dell'ingresso virale di agenti antivirali potrebbe eventualmente esercitare diversi tipi di meccanismi, tra cui: (1) modulare i fattori/recettori di ingresso della superficie cellulare o le sue vie di segnalazione associate; (2) che influiscono sulla fluidità o integrità della membrana cellulare; (3) mirare alle interazioni elettrostatiche o van der Waals tra le particelle di virus e la superficie della cellula ospite; (4) indurre modifiche fisiche ai virioni come la rottura delle particelle o l'aggregazione; (5) legarsi alle glicoproteine virali o alle proteine del capside e prevenirne le funzioni o i cambiamenti conformazionali; (6) bloccando la fusione meccanismi associati; e (7) impediscono il rilascio di genoma virale all'interno della cellula ospite. Le analisi descritte nella presente relazione possono pertanto contribuire a indicare le possibili modalità d'azione sopra elencate che possono essere ulteriormente convalidate da ulteriori esperimenti. Infine, l'"analisi dell'attracco molecolare" qui descritta è strumentale per prevedere le potenziali regioni di interazione tra i composti farmacologici e le particelle virali, e come tale può aiutare a identificare i leganti di capsidi o glicoproteine virali candidati e i leganti mirati residui sulle particelle virali. Tuttavia, queste previsioni dipendono dal software di attracco e dalla risoluzione e dall'accuratezza delle strutture di cristallo proteico virale. È importante notare che il metodo di aggancio confinato opzionale nel passaggio 5.3.2 è stato aggiunto perché spesso quando si utilizzano proteine strutturali virali come molecola "recettore", il ligando può eventualmente legarsi a regioni normalmente non accessibili o esposte sulla superficie ( ad esempio, sotto la superficie del capside virione rivolto verso l'interno del virione, regioni transmembrane di glicoproteine inviluppo, ecc.). Confinare la casella di ricerca consente di prendere di mira solo le regioni accessibili della proteina virale e di escludere qualsiasi interazione irrealistica. L'attracco molecolare dipende da strutture cristallizzate, ma i recenti progressi nella modellazione omologia hanno permesso l'analisi di strutture non cristallizzate adattando la sua sequenza di amminoacidi su una struttura cristallizzata strettamente correlata15. Questo ha permesso di analizzare più strutture e le informazioni acquisite possono essere utili per ulteriori studi, tra cui analisi mutazionali che possono aiutare a convalidare le interazioni previste.
In conclusione, i saggi e i protocolli descritti nella presente relazione sono specificamente soddisfatti per identificare gli agenti antivirali candidati che prendono di mira l'ingresso virale e fornire informazioni su quale fase del processo di ingresso virale l'agente di test si rivolge, sia che si tratti di interagire con particelle di virus liberi, e prevedere possibili siti di interazione farmacologica sui virioni. Questi tipi di analisi possono essere ripetuti su altri virus non avvolti o adattati a virus avvolti come metodo di screening di composti farmacologici antivirali per possibili inibitori dell'ingresso virale. L'utilizzo di tale approccio basato sul meccanismo per identificare i candidati antivirali potrebbe contribuire ad accelerare il processo di sviluppo dei farmaci ed espandere la portata delle terapie antivirali.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori sono grati al Dr. Joshua Beckham presso l'Università del Texas ad Austin per il supporto tecnico con attracco molecolare. Questo studio è stato in parte sostenuto da finanziamenti del Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan (MOST107-2320-B-037-002 a C.-J.L. e L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 e MOST107-2320-B-038-034-MY3 a L.-T.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
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