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Immunology and Infection

Utilisation des essais d'entrée virale et de l'analyse moléculaire de l'amarrage pour l'identification des candidats antiviraux contre le Coxsackievirus A16

Published: July 15, 2019 doi: 10.3791/59920
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 3,5
1Department of Molecular Biosciences, University of Texas at Austin, 2School of Pharmacy, College of Pharmacy, Kaohsiung Medical University, 3Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Department of Microbiology and Immunology, Dalhousie University, 5Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University

Summary

L'objectif du protocole est d'illustrer les différents essais relatifs à l'entrée virale qui peuvent être utilisés pour identifier les inhibiteurs de l'entrée virale candidat.

Abstract

Les analyses antivirales qui examinent mécaniquement l'entrée virale sont pertinentes pour discerner à quelle étape les agents évalués sont les plus efficaces, et permettent l'identification des inhibiteurs d'entrée virales candidats. Ici, nous présentons les approches expérimentales pour l'identification de petites molécules capables de bloquer l'infection par le coxsackievirus A16 (CVA16) non enveloppé en ciblant les particules virales ou des étapes spécifiques dans l'entrée virale précoce. Les essais comprennent l'analyse de l'heure de l'ajout de médicaments, l'analyse de liaison virale basée sur la cytométrie du flux et l'essai d'inactivation virale. Nous présentons également un protocole d'amarrage moléculaire utilisant des protéines capsides virales pour prédire les résidus potentiels ciblés par les composés antiviraux. Ces tests devraient aider à l'identification des agents antiviraux candidats qui agissent sur l'entrée virale. Les orientations futures peuvent explorer ces inhibiteurs possibles pour le développement ultérieur de médicaments.

Introduction

La maladie de la main, du pied et de la bouche (HFMD) est une maladie la plus souvent causée par le coxsackievirus A16 (CVA16) et l'entérovirus 71 (EV71) chez les jeunes enfants. Récemment, dans toute la région Asie-Pacifique, il y a eu une hausse significative de la DHHC induite par le CVA16. Bien que les symptômes peuvent être légers, des complications graves peuvent se produire qui affectent le cerveau et le cœur, avec la fatalité potentielle1,2. À l'heure actuelle, il n'existe pas de thérapies antivirales ou de vaccins homologués pour le CVA16, et il est donc urgent d'élaborer des stratégies antivirales pour freiner les flambées futures et les complications connexes.

CVA16 est un virus non enveloppé qui a une capside icosahedral assemblé à partir de pentamers qui contiennent chacun 4 protéines structurelles à savoir VP1, VP2, VP3, et VP4. Encerclant chaque axe quintuple dans le phésse est une région «canyon» qui se manifeste comme une dépression et est connu pour son rôle dans la liaison des récepteurs3. Au fond de ce canyon se trouve une poche hydrophobe dans la région VP1 qui contient un ligand gras naturel nommé sphingosine (SPH). Les récepteurs cellulaires, tels que l'homme P selectin glycoprotein ligand 1 (PSGL-1) et le membre de classe B des récepteurs de charognards 2 (SCARB2), ont été suggérés pour jouer un rôle dans la liaison virale en déplaçant ce ligand qui a comme conséquence des changements conformationnels au capside et au éjection ultérieure du génome viral dans la cellule hôte4,5,6. L'identification des inhibiteurs possibles qui bloquent les événements successifs dans le processus d'entrée virale pourrait fournir des stratégies thérapeutiques potentielles contre l'infection de CVA16.

Les étapes du cycle de vie du virus peuvent être disséquées par des approches expérimentales comme cibles pour aider à identifier les agents antiviraux spécifiques au mode. Une analyse de l'heure d'ajout de médicaments examine l'effet du traitement médicamenteux à différents moments de l'infection virale, y compris la pré-entrée (ajoutée avant l'infection virale), l'entrée (ajoutée en même temps que l'infection virale) et après l'entrée (ajoutée après l'infection virus)7. L'impact peut être évalué à l'aide d'un analyse de plaque standard en quantiant le nombre de plaques virales formées dans chacune des conditions de traitement. L'essai de liaison virale basé sur la cytométrie du flux détermine si le médicament empêche l'attachement viral aux cellules hôtes. Ceci est réalisé en déplaçant la température de 37 oC, à laquelle la majorité des infections virales humaines se produisent, à 4 oC, où les virions sont capables de se lier à la surface de la cellule hôte, mais sont incapables d'entrer dans les cellules7. Les particules virales liées à la membrane cellulaire sont ensuite quantifiées par immunostaining contre les antigènes viraux et évaluées par cytométrie de flux. L'analyse d'inactivation virale, d'autre part, aide à évaluer les interactions physiques potentielles du médicament avec les particules virales libres, soit en protégeant ou en neutralisant les virions, ou en causant des agrégations ou des changements conformationnels qui les rendent inactifs pour interactions ultérieures avec la surface de la cellule hôte pendant l'infection8,9. Dans cette expérience, l'inoculum viral est autorisé à d'abord incuber avec le médicament avant d'être dilué pour titrer le médicament avant d'infecter la monocouche cellulaire hôte et d'effectuer un test de plaque standard8. Enfin, l'amarrage moléculaire est un outil puissant pour prédire les sites potentiels d'interaction médicamenteuse sur la surface de la virion, y compris les glycoprotéines virales des virus enveloppés et les protéines capsides virales des virus non enveloppés, en utilisant des Algorithmes. Cela permet de repérer mécanistement les cibles du mode d'action du médicament et de fournir des informations utiles qui peuvent être validées par des essais en aval.

Nous avons récemment utilisé les méthodes décrites ci-dessus pour identifier les composés antiviraux qui ont efficacement bloqué l'infection par le CVA169non enveloppé . Ici, les protocoles détaillés qui ont été utilisés sont décrits et discutés.

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Protocol

REMARQUE: Toutes les cultures cellulaires et les infections virales doivent être effectuées dans des hottes de biosécurité certifiées qui conviennent au niveau de biosécurité des échantillons manipulés. Les deux tanins de la classe des petites molécules d'acide chébulagique (CHLA) et de punicalagin (PUG), qui ont été observés pour bloquer efficacement l'infection CVA169, sont utilisés comme exemples d'agents inhibiteurs candidats. Pour les principes de base dans les techniques de virologie, la propagation du virus, la détermination du titre de virus, et les concepts d'unités de formation de plaque (PFU) ou la multiplicité de l'infection (MOI), le lecteur est renvoyé à la référence10.

1. Culture cellulaire, Préparation des virus, Préparation des composés et Cytotoxicité composée

  1. Les cellules de rhabdomyosarcome humain (RD) sont des cellules d'hôte permissives à l'infection de CVA1611. Cultivez les cellules RD dans 10 ml du milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 200 u/mL de pénicilline G, 200 g/mL de streptomycine et 0,5 g/mL d'amphotéricine B en T-75 flasks à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 %.
  2. Préparer CVA16 en propageant le virus dans les cellules RD et déterminer le titer viral dans PFU/mL. Pour un protocole optimisé, veuillez consulter la référence11.
  3. Préparer les composés d'essai et les contrôles à l'aide de leurs solvants respectifs : par exemple, dissoudre le CHLA et le PUG dans le sulfoxide de diméthyle (DMSO). Pour toutes les étapes d'infection, le milieu basal s'est composé de DMEM plus 2% FBS et antibiotiques.
    REMARQUE: La concentration finale de DMSO dans les traitements composés d'essai est égale ou inférieure à 0,25% dans les expériences; 0,25% DMSO est inclus comme un traitement de contrôle négatif dans les essais à des fins de comparaison.
  4. Effectuer l'essai de cytotoxicité des composés d'essai sur les cellules de RD utilisant un réactif déterminant de viabilité de cellules tel que XTT ((2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxyde). Pour un protocole détaillé, veuillez consulter la référence12. Déterminer les concentrations de cytotoxicité des composés d'essai à l'aide d'un logiciel d'analyse tel que GraphPad Prism selon le protocole du fabricant. Des concentrations de médicaments qui n'influencent pas de façon significative la viabilité des cellules (95 % des cellules viables) sont utilisées pour le reste de l'étude.

2. Temps d'addition de drogue (Test d'avertissement)

  1. Évaluer l'influence des médicaments sur les cellules hôtes avant l'infection virale (prétraitement)
    1. Cellules RD de semence dans des plaques de 12 puits à une densité d'ensemencement de 2 x 105 cellules/puits. Incuber toute la nuit à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 % pour obtenir une monocouche.
    2. Traiter les cellules RD avec des composés d'essai à des concentrations non cytotoxiques (déterminées à partir de l'étape 1,4) dans 1 ml de volume de support basal pendant 1 h ou 4 h.
    3. Laver les cellules avec 1-2 ml de PBS avant d'ajouter 50 PFU/puits de virus dans le milieu basal (volume final de l'inoculum est de 300 l) pendant 1 h. Rock la plaque toutes les 15 minutes.
    4. Après l'infection, laver à nouveau les monocouches à l'aide de PBS, puis superposer avec 1 ml de support basal contenant 0,8 % de méthylcellulose pour une incubation ultérieure à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 %.
    5. Après 72 h d'incubation, retirer le support de la refaçon et laver les puits à l'aide de 2 ml de PBS.
    6. Fixer les puits à l'aide de 0,5 ml de formaldéhyde à 37 % pendant 15 min.
    7. Retirez le supernatant et lavez-le à nouveau à l'aide de PBS.
    8. Tainer les puits en utilisant 0,5 ml de solution violette cristalline de 0,5%. Retirez ensuite la solution de tache dans les 2 minutes et lavez les puits avec un doux jet d'eau avant le séchage à l'air.
    9. Comptez les plaques virales en plaçant la plaque sur une boîte à lumière blanche. Calculer le pourcentage (%) Infection CVA16 comme suit: (Moyenne du virus de la plaque / Moyenne de contrôle du virus de la plaque DMSO) - 100%.
  2. Évaluer l'effet de l'ajout simultané des médicaments et du virus (co-addition)
    1. Cellules RD de semence dans des plaques de 12 puits à une densité d'ensemencement de 2 x 105 cellules/puits. Incuber toute la nuit à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 % pour obtenir une monocouche.
    2. Traiter simultanément les cellules RD avec les composés d'essai aux concentrations appropriées et 50 PFU/puits de CVA16 (le volume final de l'inoculum est de 300 l) simultanément pendant 1 h. Rock la plaque toutes les 15 min.
    3. Laver les cellules avec 1 ml de PBS, puis superposer avec 1-2 ml de support basal contenant 0,8% de méthylcellulose pour une incubation ultérieure à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5%.
    4. Tachez les plaques virales avec le violet de cristal après 72 h après l'infection et déterminez l'infection cVA16% comme décrit ci-dessus.
  3. Évaluer l'effet du traitement médicamenteux après l'entrée virale (post-infection)
    1. Cellules RD de semence dans des plaques de 12 puits à une densité d'ensemencement de 2 x 105 cellules/puits. Incuber toute la nuit à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 % pour obtenir une monocouche.
    2. Inoculer les cellules RD avec 50 PFU/puits de CVA16 (volume final de l'inoculum est de 300 l) pendant 1 h. Rock la plaque toutes les 15 min.
    3. Laver les puits avec 1-2 ml de PBS et superposer les cellules avec un support basal contenant 0,8% de méthylcellulose et les concentrations appropriées de composés d'essai.
    4. Tachez les plaques virales avec de la violette cristalline et comptez après 72 h après l'infection et déterminez les % d'incubations d'infections CVA16 décrites ci-dessus.
      REMARQUE: Effectuer tous les lavages PBS doucement pour éviter de soulever les cellules.

3. Flow Cytometry-based Binding Assay

  1. Cellules RD de semence dans des plaques de 12 puits à une densité d'ensemencement de 2 x 105 cellules/puits. Incuber toute la nuit à 37 oC dans un incubateur de CO2 de 5 % pour obtenir une monocouche.
  2. Pré-réfrigérer la monocouche cellulaire à 4 oC pendant 1 h.
  3. Infecter les cellules RD avec cVA16 (MOI 100) en présence et en absence des composés d'essai pendant 3 h à 4 oC.
    REMARQUE: Effectuer l'inoculation virale sur la glace et l'incubation qui s'ensuit dans un réfrigérateur de 4 oC pour maintenir la température à 4 oC, ce qui permet une liaison virale, mais pas l'entrée.
  4. Enlever l'inoculum du virus et laver une fois avec 1-2 ml de PBS glacé.
  5. Soulevez les cellules en ajoutant 1 ml de tampon de dissociation glace-froid aux puits sur glace pendant 3 min, avant de recueillir les cellules et de les suspendre dans un tampon de cytométrie à débit froid (1x PBS plus 2 % de FBS).
  6. Laver les cellules deux fois à l'aide du tampon de cytométrie à débit froid et fixer les cellules avec 0,5 ml de paraformaldéhyde de 4 % pendant 20 min sur glace.
  7. Laver les cellules à l'aide de PBS pour éliminer les virus non liés ou faiblement liés, puis tacher les cellules avec 1 ml d'anticorps anti-VP1 (1:2,000; dilué en PBS contenant 3% bSA) sur la glace pendant 1 h, suivie d'une incubation avec un secondaire Alexa 488-conjugué anti-souris IgG (1:250; dilué en PBS contenant 3 % de BSA) sur la glace pendant 1 h. Effectuer des lavages PBS (3 fois) après chaque traitement d'anticorps.
  8. Resuspendre les cellules dans 0,5 ml du tampon de cytométrie de l'écoulement de glace et effectuer une analyse de cytométrie d'écoulement sur un cytomètre d'écoulement en utilisant des procédures standard. Présenter des données dans les histogrammes à l'aide du logiciel associé et quantitate pour la représentation graphique à barres.

4. Inactivation virale Dis

  1. Effectuer l'inactivation virale comme précédemment décrit12 en utilisant les conditions suivantes:
    - Concentration de départ de 106 PFU/mL de CVA16.
    - monocouches de cellules RD dans des plaques de 12 puits à partir d'une densité d'ensemencement de 2 x 105 cellules/puits.
    - dilution 50 fois plus diluée pour titrer les composés médicamenteux, ce qui entraîne une concentration finale du virus de 50 PFU/puits.
    - Laver les étapes à l'aide de 1-2 ml de PBS.
    - Couverture des supports contenant 0,8 % de méthylcellulose.
  2. Effectuer la lecture finale de l'infection virale en utilisant la coloration violette de cristal de la procédure de plaques virales comme détaillé ci-dessus.

5. Analyse moléculaire de l'amarrage

  1. Téléchargez des molécules 3D de composés d'essai de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Si les molécules n'ont pas de structure 3D téléchargée, téléchargez les structures 2D ou utilisez la séquence de cordes SMILES et transformez-les en molécules 3D via un programme moléculaire (p. ex. CORINA).
  2. Téléchargez l'unité d'assemblage biologique virale de RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) et préparez le modèle de structure virale à l'aide d'un programme de bioinformatique (p. ex. LA chimère de l'UCSF). Par exemple, dans le cas de la structure de cristal de virion mature CVA16 (PDB : 5C4W)3, supprimer les solvants du fichier PDB, remplacer les chaînes latérales incomplètes à l'aide des données de la bibliothèque Rotamer Dunbrach 2010, et ajouter des hydrogènes et des charges à la structure comme précédemment signalé13. Les cibles d'amarrage peuvent être toutes les protéines virales pertinentes pour l'analyse prévue avec une information d'assemblage biologique (Banque de données de protéines).
  3. Les composés de test de dock sur l'unité de virus préparée utilisant par exemple la chimère d'UCSF, et analysent les fichiers de sortie avec un logiciel de visualisation (par exemple, Autodock Vina, PyMol) :
    1. Téléchargez le fichier composé de test dans la chimère de l'UCSF en tant que «ligand» et effectuez l'amarrage à l'aveugle en sélectionnant la protéine virale préparée en tant que « récepteur ». Utilisez la souris d'ordinateur ou le trackpad pour redimensionner le volume de recherche à l'ensemble du « récepteur ». Dans les « options avancées », permettre au nombre de modes de liaison d'être au maximum. Les cadres d'amarrage seront automatiquement classés de l'énergie de liaison la plus élevée à la plus faible.
    2. (Facultatif) Plus loin à l'amarrage aveugle, confinez le site d'amarrage à la protéine virale dans les régions d'intérêt dérivées des résultats d'amarrage à l'aveugle à l'aide de la souris ou du trackpad à nouveau pour réduire le volume de recherche (p. ex., 100 x 100 x 100). Cette étape permet de confirmer les résultats d'amarrage à l'aveugle et augmente la spécificité.
    3. Utilisez un système graphique moléculaire (p. ex. PyMol) pour analyser les positions des modes de liaison en téléchargeant le fichier d'amarrage. Trouvez des contacts polaires du composé à la protéine virale en sélectionnant le «ligand» et en identifiant les contacts polaires avec l'option «à tous les atomes»; examiner les résultats.

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Representative Results

L'exemple de l'heure d'ajout de drogue est indiqué à la figure 1 et montre l'influence du traitement à l'aide des petites molécules CHLA et PUG sur l'infection cVA16 soit pré-virale (prétraitement), lors de l'entrée virale (co-addition), ou post-virale entrée ( post-infection). Les deux petites molécules n'ont produit qu'un impact marginal contre l'infectiosité CVA16, que ce soit dans le prétraitement des cellules hôtes avant l'infection virale (figure 1A) ou dans le traitement post-infection (figure 1C). En revanche, CHLA et PUG ont abrogé efficacement l'infection à CVA16 de 80 % dans le traitement de co-addition (Figure 1B). Ces observations suggèrent donc que les deux composés sont plus efficaces lorsqu'ils sont simultanément présents avec les particules virales à la surface des cellules hôtes pendant l'infection.

Dans la figure 2, l'analyse de liaison à base de cytométrie du débit (illustrée de façon schématique dans la figure 2A) confirme que les deux tanins empêchent l'entrée de CVA16 en empêchant la liaison des particules virales aux cellules hôtes. Les données de quantification de la figure 2B montrent que la quantité de virus détectée à la surface des cellules RD en présence des deux médicaments est inférieure à 10 %, semblable au contrôle positif à l'héparine qui est connu pour empêcher l'attachement CVA1614. La figure 2C, 2Det 2E représentent les histogrammes de cytométrie de flux associés où le décalage de bande dû à la détection de CVA16 sur la surface de la cellule RD est considérablement réduit lorsque CHLA et PUG sont présents.

La figure 3A montre comment l'expérience d'inactivation virale a été réalisée. Le composé médicamenteux a été mélangé avec les particules virales CVA16 et incubé pendant 1 h (à long terme) avant l'étape de dilution, ou mélangé et immédiatement dilué (à court terme) avant l'infection. Comme le montre la figure 3B, une pré-incubation des particules CV16 avec les agents d'essai pendant 1 h a conduit à une protection presque complète des cellules RD contre l'infection virale par rapport à l'incubation à court terme et le contrôle DMSO. Les résultats suggèrent donc que chLA et PUG interagissent avec les particules CVA16 et sont capables de les rendre inactives dans l'infection subséquente.

Puisque nos données indiquent que les composés de drogue peuvent inactiver directement des particules de CVA16, et donc identifier la virion elle-même comme cible plausible de leur activité antivirale, nous avons employé l'amarrage moléculaire pour prévoir l'interaction potentielle entre ces ces agents et le c.r. La figure 4A montre une projection de surface de la padation CVA16 qui constitue le capside icosaèdre de la virion CVA16. L'amarrage moléculaire des tanins CHLA (figure4B; vert) et PUG (figure4C; bleu) indiquent qu'ils sont tous deux prévus pour se lier dans la région de canyon de la pâtissine CVA16. Plus précisément, les deux petites molécules liées juste au-dessus de l'entrée de poche (Figure4B et 4C, panneaux zoomés), qui détient le facteur de poche et joue un rôle important pour la médiation CVA16 liaison et l'entrée dans la cellule hôte. Le CHLA et le PUG semblent donc masquer la région d'entrée de poche, ce qui, en théorie, obstruerait les interactions entre les particules virales et les récepteurs des cellules hôtes. La figure 4D et 4E indiquent les résidus uniques prédits à partir des contacts polaires de CHLA et pug, respectivement, autour de l'entrée de poche, avec la plupart de ces interactions se produisant avec VP1 pour les deux composés et les 3 acides aminés Asn85 , Lys257, et Asn417 étant en commun entre les deux tanins.

Figure 1
Figure 1 : Effet d'ajout de temps de drogue de CHLA et de PUG contre l'infectiosité CVA16. Les cellules DE RD ont été traitées avec CHLA (20 M) ou PUG (25 -M) à différents moments de l'inoculation de CVA16 (50 PFU/puits). DMSO (0,25%) le traitement a été inclus comme contrôle négatif et tous les essais ont été analysés par l'analyse de plaque utilisant la coloration de violette de cristal 72 h après l'incubation. (A) Pour le prétraitement, les cellules ont été incubées avec les composés d'essai pendant 1 h ou 4 h et ont ensuite été lavées avant l'infection de CVA16. (B) Pour les essais de co-addition, les cellules ont été administrées avec des médicaments et le virus simultanément pendant 1 h, puis lavées. (C) Dans la post-infection, les cellules ont été infectées par CVA16 pendant 1 h, lavées, puis traitées avec des composés d'essai. Les données présentées sont les moyens de déviation standard (SD) de trois expériences indépendantes. p 'lt; 0.05 par rapport au groupe 'virus seulement' respectif. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide d'une analyse à sens unique de la variance. Ce chiffre a été adapté de la référence9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : ChLA et PUG abolissent la liaison CVA16 à la cellule hôte. (A) Schéma de l'essai de liaison à base de cytométrie de flux. (B) Les cellules RD (2 x 105 cellules/puits) ont été infectées par le CVA16 (MOI - 100) en présence ou absence de CHLA (20 M), de PUG (25 m), d'héparine soluble (500 g/mL, contrôle positif) ou de DMSO (0,25 %, contrôle négatif) pendant 3 h à 4 oC. Inocula des puits ont été rassemblés dans des tubes, lavés avec PBS deux fois, fixe, et souillé avec l'anticorps anti-VP1 suivi par Alexa 488-conjugué anticorps secondaires pour la détection de cytométrie de flux des virus liés à la surface. Les données quantifiées des signaux de fluorescence détectés ont été tracées comme les moyens - SD de trois expériences indépendantes dans le graphique à barres comme «Liaison virus (%) . L'analyse statistique a été effectuée à l'aide d'une analyse à sens unique de la variance. Les histogrammes représentatifs de cytométrie de flux de CHLA (C), PUG (D), et les traitements d'héparine (E) sont montrés. Ce chiffre a été adapté de la référence9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : ChLA et PUG inactivent des particules virales CVA16 sans cellules. (A) Schéma de l'inactivation virale. (B) CVA16 (106 PFU/well) a été traité avec CHLA (20 M) ou PUG (25 M) et mélangé immédiatement pour l'inactivation à court terme ou incubé pendant 1 h à 37 oC pour l'inactivation à long terme avant d'être dilué 50 fois à une concentration non efficace de test avant d'inoculer sur les cellules RD (concentration de virus final de 50 PFU/puits). DMSO (0,25%) a été utilisé comme un contrôle négatif. Des expériences ont été analysées par l'analyse de plaque utilisant la coloration de violette de cristal 72 h post-infection. Les données présentées sont les moyens de SD de trois expériences indépendantes. p 'lt; 0.05 par rapport au groupe 'virus seulement' respectif. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide d'une analyse à sens unique de la variance. Ce chiffre a été adapté de la référence9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : ChLA et PUG ciblent la capside CVA16 près de l'entrée de poche. Projection de surface de la particule virion CVA16 avec le phésif monomérique délimité par des lignes rouges (A). D'autres pentamers sur la virion sont représentés en cyan, magenta, indigo, bronze et vert. Analyse moléculaire de l'amarrage moléculaire de CHLA (B, vert) et PUG (C, bleu) sur le PVA16 pentamer (PDB: 5C4W); les panneaux zoomés sont délimités en jaune. VP1 - orange, VP2 , gris, VP3 et blanc ; les contacts polaires sont représentés sous forme de tirets noirs. Les résidus qui composent l'entrée de poche sont colorés rouge (Ile94, Asp95, Gln207, Met212, Met213, Lys257, Thr258). D, E. Vue latérale en gros plan dans le canyon où se trouve l'entrée de poche et où CHLA (D) et PUG (E) se lient à. Les résidus uniques qui sont des contacts polaires provenant des contacts polaires des composés sur le pentamer sont étiquetés en jaune (VP1), blanc (VP2) et en caractères noirs (VP3). La ligne pointillée blanche indique la région d'entrée de poche. Ce chiffre a été adapté de la référence9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Dans ce rapport, nous avons décrit les protocoles qui sont utiles pour l'identification des candidats antiviraux qui ciblent l'entrée virale, en particulier contre le CVA16 non enveloppé. Les essais sont conçus de manière à disséquer les premiers événements lors de l'entrée virale, ce qui est utile pour clarifier le mécanisme d'action et les cibles potentielles de l'activité antivirale des agents d'essai. L'« analyse de l'heure de l'ajout de médicaments » permet de déterminer de façon générale la cible potentielle des composés testés, par exemple les cellules hôtes non infectées (analyse de prétraitement), les particules virales ou ses interactions avec la surface de la cellule hôte (analyse de co-addition ), ou la cellule hôte infectée par le virus pendant la phase de réplication virale (analyse post-infection). Cet analyse seul peut déterminer la méthode d'interaction à partir des composés (p. ex., co-addition) qui mène aux essais subséquents décrits dans ce protocole (p. ex., analyse d'inactivation virale et analyse contraignante). Les étapes de lavage sont essentielles pour s'assurer que la méthode de traitement examinée est spécifique à celle analysée. L'utilisation de l'essai de liaison à base de cytométrie de flux aide à évaluer l'influence des composés spécifiquement sur la liaison du virus à la cellule hôte. Le maintien de la température de l'expérience à 4 oC est important pour la détection finale des virions à la surface de la cellule, car cette température permet une liaison virale mais non une entrée. L'« analyse d'inactivation virale » peut aider à déterminer l'interaction physique potentielle des composés médicamenteux avec les particules virales sans cellules. L'étape critique est la dilution pour titrer les composés médicamenteux après l'incubation avec l'inoculum viral, car cela est nécessaire pour empêcher toute interaction significative des médicaments avec la surface de la cellule hôte dans l'étape d'infection ultérieure12.

Étant donné que l'entrée virale est un événement en plusieurs étapes, une classe d'inhibiteurs d'entrée virale d'agents antiviraux pourrait éventuellement exercer plusieurs types de mécanismes, y compris : (1) moduler les facteurs/récepteurs d'entrée de surface cellulaire ou ses voies de signalisation associées; (2) affecter la fluidité ou l'intégrité de la membrane cellulaire; (3) cibler les interactions électrostatiques ou van der Waals entre les particules virales et la surface des cellules hôtes; (4) induire des changements physiques aux virions telles que la rupture ou l'agrégation de particules ; (5) se liant aux glycoprotéines virales ou aux protéines capsides et empêchant leurs fonctions ou changements conformationnels; (6) bloquer les mécanismes associés à la fusion; et (7) empêcher la libération du génome viral à l'intérieur de la cellule hôte. Les analyses décrites dans ce rapport peuvent donc aider à indiquer les modes d'action potentiels susmentionnés qui peuvent être validés par d'autres expériences. Enfin, l'« analyse moléculaire de l'amarrage » décrite ici est essentielle pour prédire les régions d'interaction potentielles entre les composés médicamenteux et les particules virales, et en tant que telle peut aider à identifier les liants de capsid ou de glycoprotéine virales candidats et les résidus sur les particules virales. Cependant, ces prédictions dépendent du logiciel d'amarrage, et de la résolution et de l'exactitude des structures cristallines virales. Il est important de noter que la méthode d'amarrage confinée facultative à l'étape 5.3.2 a été ajoutée parce que souvent, lors de l'utilisation de protéines structurelles virales comme molécule « réceptrice », le ligand peut éventuellement se lier à des régions normalement non accessibles ou exposées à la surface ( par exemple, sous la surface de la capside virion face à l'intérieur de la virion, les régions transmembranaires des glycoprotéines enveloppe, etc.). Le confinement de la boîte de recherche permet uniquement aux régions accessibles de la protéine virale d'être ciblées et exclut toute interaction irréaliste. L'amarrage moléculaire dépend de structures cristallisées, mais les progrès récents dans la modélisation homologie ont permis l'analyse des structures non cristallisées en adaptant sa séquence d'acide aminé sur une structure cristallisée étroitement liée15. Cela a permis d'analyser davantage de structures et l'information acquise peut être utile pour d'autres études, y compris des analyses mutationnelles qui peuvent aider à valider les interactions prévues.

En conclusion, les essais et les protocoles décrits dans le présent rapport visent spécifiquement à identifier les agents antiviraux candidats qui ciblent l'entrée virale, et à fournir des informations sur l'étape du processus d'entrée virale que l'agent de test cible, s'ils interagir avec les particules virales libres et prédire d'éventuels sites d'interaction médicamenteuse sur les virions. Ces types d'essais peuvent être répétés sur d'autres virus non enveloppés ou adaptés aux virus enveloppés comme méthode de dépistage des composés antiviraux pour les inhibiteurs possibles de l'entrée virale. L'utilisation d'une telle approche axée sur les mécanismes pour identifier les candidats aux antiviraux pourrait aider à accélérer le processus de développement de médicaments et à élargir la portée des traitements antiviraux.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas de conflit d'intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs sont reconnaissants au Dr Joshua Beckham de l'Université du Texas à Austin pour son soutien technique avec l'amarrage moléculaire. Cette étude a été financée en partie par le financement du ministère des Sciences et de la Technologie de Taïwan (MOST107-2320-B-037-002 à C.-J.L. et L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 et MOST107-2320-B-038-034-MY3 à L.-T.L.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde Sigma AL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG Invitrogen A11029
Amphotericin B GIBCO 15290-018
Anti-VP1 antibody Merck-Millipore MAB979 Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter Cytometer Beckman Coulter FC500
Corina Molecular Networks GmbH
Crystal violet Sigma C3886-100G
DMEM GIBCO 11995-040
DMSO Sigma D5879
FBS GIBCO 26140-079
Formaldehyde Sigma F8775
Graphpad Prism GraphPad
Heparin sodium salt Sigma H3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
Methylcellulose Sigma M0512-100G
PBS pH 7.4 GIBCO 10010023
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
PyMol Schrödinger
UCSF Chimera University of California, San Francisco

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References

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  2. Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
  3. Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
  4. Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
  5. Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
  6. Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
  7. Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
  8. Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187 (2013).
  9. Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162 (2018).
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  14. Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65 (2017).
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Immunologie et infection numéro 149 antiviraux développement de médicaments inhibiteurs d'entrée entrée virale analyse contraignante amarrage moléculaire Autodock PyMol CHImère de l'UCSF
Utilisation des essais d'entrée virale et de l'analyse moléculaire de l'amarrage pour l'identification des candidats antiviraux contre le Coxsackievirus A16
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Wang, J. Y., Lin, C. J., Liu, C. H., … More

Wang, J. Y., Lin, C. J., Liu, C. H., Lin, L. T. Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16. J. Vis. Exp. (149), e59920, doi:10.3791/59920 (2019).

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