Summary
Das Ziel des Protokolls ist es, die verschiedenen Assays im Zusammenhang mit viralen Eintritte zu veranschaulichen, die verwendet werden können, um Kandidaten-Virus-Eintrittshemmer zu identifizieren.
Abstract
Antivirale Assays, die den viralen Eintrag mechanistisch untersuchen, sind relevant, um zu erkennen, in welchem Schritt die bewerteten Wirkstoffe am effektivsten sind, und die Identifizierung von Kandidaten-Virus-Eintrittshemmern zu ermöglichen. Hier stellen wir die experimentellen Ansätze zur Identifizierung kleiner Moleküle vor, die eine Infektion durch das nicht umhüllte Coxsackievirus A16 (CVA16) blockieren können, indem sie auf die Viruspartikel oder bestimmte Schritte bei der frühen viralen Eintierung abzielen. Assays umfassen die Analyse der Zeit-der-Arzneimittel-Addition, Flusszytometrie-basierte virale Bindung Assay, und virale Inaktivierung Assay. Wir präsentieren auch ein molekulares Docking-Protokoll, das Virus-Capsid-Proteine verwendet, um potenzielle Rückstände vorherzusagen, die von den antiviralen Verbindungen angegriffen werden. Diese Assays sollten bei der Identifizierung von antiviralen Wirkstoffen helfen, die auf den viralen Eintrag wirken. Zukünftige Richtungen können diese möglichen Inhibitoren für die weitere Arzneimittelentwicklung erforschen.
Introduction
Die Hand-, Fuß- und Mundkrankheit (HFMD) ist eine Krankheit, die am häufigsten durch das Coxsackievirus A16 (CVA16) und das Enterovirus 71 (EV71) bei Kleinkindern verursacht wird. Kürzlich gab es im gesamten asiatisch-pazifischen Raum einen deutlichen Anstieg der CVA16-induzierten HFMD. Während die Symptome leicht sein können, können schwere Komplikationen auftreten, die das Gehirn und das Herz betreffen, mit potenzieller Todesfall1,2. Derzeit gibt es keine zugelassenen antiviralen Therapien oder Impfungen für CVA16, und daher besteht die dringende Notwendigkeit, antivirale Strategien zu entwickeln, um zukünftige Ausbrüche und die damit verbundenen Komplikationen einzudämmen.
CVA16 ist ein nicht umhülltes Virus, das ein ikosaedrales Kapsid aus Pentamern hat, die jeweils 4 strukturelle Proteine enthalten: VP1, VP2, VP3 und VP4. Umgibt jede fünffache Achse in den Pentamer ist eine "Canyon"-Region, die als Depression zeigt und für ihre Rolle in der Rezeptorbindung3bekannt ist. Am Boden dieser Schlucht liegt eine hydrophobe Tasche in der VP1-Region, die einen natürlichen Fettligand namens Sphingosin (SPH) enthält. Zelluläre Rezeptoren, wie z. B. humanes P-Selgin-Glykoprotein-Ligand 1 (PSGL-1) und Scavenger-Rezeptor-Klasse B-Mitglied 2 (SCARB2), wurden vorgeschlagen, eine Rolle bei der viralen Bindung zu spielen, indem dieser Liganden verdrängt wird, was zu Konformationsänderungen am Kapsid und anschließender Auswurf des viralen Genoms in die Wirtszelle4,5,6. Die Identifizierung möglicher Inhibitoren, die die aufeinanderfolgenden Ereignisse im viralen Eintrittsprozess blockieren, könnte potenzielle therapeutische Strategien gegen eine CVA16-Infektion liefern.
Die Schritte im Viruslebenszyklus können durch experimentelle Ansätze als Ziele zur Identifizierung modusspezifischer antiviraler Wirkstoffe seziert werden. Eine Analyse der Zeit-der-Arzneimittel-Addition untersucht die Arzneimittelbehandlungswirkung zu verschiedenen Zeiten während der Virusinfektion, einschließlich Pre-Entry (vor der Virusinfektion hinzugefügt), Eintrag (gleichzeitig zur Virusinfektion hinzugefügt) und Post-Entry (hinzugefügt nach dem Virusinfektion)7. Die Auswirkungen können mit einem Standard-Plaque-Assay bewertet werden, indem die Anzahl der viralen Plaques quantifiziert wird, die in jeder der Behandlungsbedingungen gebildet werden. Der Strömungszytometrie-basierte virale Bindungstest bestimmt, ob das Medikament die virale Bindung an Wirtszellen verhindert. Dies wird erreicht, indem die Temperatur von 37 °C, bei der die Meisten Infektionen mit menschlichen Viren auftreten, auf 4 °C verschoben wird, wo die Virionen in der Lage sind, sich an die Oberfläche der Wirtszelle zu binden, aber nicht in die Zellen7gelangen können. Die zellmembrangebundenen Viruspartikel werden dann durch Immunfärbung gegen virale Antigene quantifiziert und durch Durchflusszytometrie bewertet. Der virale Inaktivierungstest hingegen hilft, mögliche physikalische Wechselwirkungen des Arzneimittels mit freien Viruspartikeln zu bewerten, entweder die Virionen abzuschirmen oder zu neutralisieren oder Aggregationen oder Konformationsänderungen zu verursachen, die sie für nachfolgende Wechselwirkungen mit der Wirtszelloberfläche während der Infektion8,9. In diesem Experiment darf das virale Inokulum zuerst mit dem Medikament inkubieren, bevor es verdünnt wird, um das Medikament vor der Infektion der Wirtszellmonolayer zu titrieren und einen Standard-Plaque-Assaydurchzuführen 8. Schließlich ist das molekulare Andocken ein leistungsfähiges Werkzeug, um potenzielle Wechselwirkungsstellen für Arzneimittel auf der Virionenoberfläche vorherzusagen, einschließlich der viralen Glykoproteine von umhüllten Viren und der viralen Kapsidproteine von nicht umhüllten Viren, indem computergestützte Algorithmen. Dies hilft, mechanistisch Ziele der Wirkungsweise des Medikaments zu lokalisieren und nützliche Informationen zu liefern, die durch nachgelagerte Assays weiter validiert werden können.
Wir haben vor kurzem die oben beschriebenen Methoden verwendet, um antivirale Verbindungen zu identifizieren, die eine Infektion durch das nicht umhüllte CVA169effizient blockierten. Hierin werden die verwendeten detaillierten Protokolle beschrieben und diskutiert.
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Protocol
HINWEIS: Alle Zellkulturen und Virusinfektionen müssen in zertifizierten Biosicherheitshauben durchgeführt werden, die dem Biosicherheitsniveau der behandelten Proben entsprechen. Die beiden Tannin-Klasse der kleinen Moleküle Chebulagsäure (CHLA) und Punicalagin (PUG), die beobachtet wurden, um effizient zu blockieren CVA16-Infektion9, werden als Beispiele für Kandidatenhemmende Mittel verwendet. Für Grundprinzipien in virologischen Techniken, Virusausbreitung, Bestimmung von Virustiter und Konzepten von Plaqueforming Units (PFU) oder Multiplizität von Infektionen (MOI) wird der Leser auf Referenz10verwiesen.
1. Zellkultur, Viruszubereitung, Compound-Vorbereitung und zusammengesetzte Zytotoxizität
- Menschliche Rhabdomyosarkom (RD) Zellen sind Wirtszellen freizügig cvA16 Infektion11. Wachsen Sie die RD-Zellen in 10 ml des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS), 200 U/ml Penicillin G, 200 g/ml Streptomycin und 0,5 g/ml Amphotericin B in T-75-Kolben bei 37 °C in einem 5%-CO2-Inkubator.
- Bereiten Sie CVA16 vor, indem Sie das Virus in RD-Zellen vermehren und viralen Titer in PFU/ml bestimmen. Für optimiertes Protokoll siehe Verweis11.
- Bereiten Sie die Prüfverbindungen und Kontrollen mit ihren jeweiligen Lösungsmitteln vor: lösen Sie beispielsweise CHLA und PUG in Dimethylsulfoxid (DMSO). Für alle Infektionsschritte bestand das Basalmedium aus DMEM plus 2% FBS und Antibiotika.
HINWEIS: Die Endkonzentration von DMSO in den Test-Compound-Behandlungen beträgt in den Experimenten 0,25 % oder liegt unter 0,25 %; 0,25% DMSO wird als Negativkontrollbehandlung in die Vergleichstests einbezogen. - Führen Sie den Zytotoxizitätstest der Testverbindungen an den FU-Zellen unter Verwendung eines zelllebensfähigkeitsbestimmenden Reagenzes wie XTT ((2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-phenylamino)-carbonyl]-2H-Tetrazoliumhydroxid) durch. AusführlicheProtokolle finden Sie unter Referenz12. Bestimmen Sie die Zytotoxizitätskonzentrationen der Prüfverbindungen mit einer Analysesoftware wie GraphPad Prism gemäß dem Herstellerprotokoll. Für den Rest der Studie werden Arzneimittelkonzentrationen verwendet, die die Zelllebensfähigkeit nicht signifikant beeinflussen (95 % lebensfähige Zellen).
2. Time-of-Drug-Addition Assay
-
Bewertung des Einflusses von Medikamenten auf Wirtszellen vor einer Virusinfektion (Vorbehandlung)
- Seed RD-Zellen in 12-Well-Platten mit einer Saatdichte von 2 x 105 Zellen/Well. Über Nacht bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren, um eine Monoschicht zu erhalten.
- Behandeln Sie FU-Zellen mit Testverbindungen in nichtzytotoxischen Konzentrationen (bestimmt ab Schritt 1.4) in 1 ml Basalmedienvolumen für 1 h oder 4 h.
- Waschen Sie Zellen mit 1-2 ml PBS, bevor Sie 50 PFU/Well des Virus in Basalmedium (Endvolumen des Inokulums ist 300 l) für 1 h. Rock die Platte alle 15 min.
- Nach der Infektion die Monolayer erneut mit PBS waschen und dann mit 1 ml Basalmedium mit 0,8% Methylcellulose für eine weitere Inkubation bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator überlagern.
- Nach 72 h Inkubation die Überlagerungsmedien entfernen und die Brunnen mit 2 ml PBS waschen.
- Fixieren Sie die Brunnen mit 0,5 ml 37% Formaldehyd für 15 min.
- Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie es erneut mit PBS.
- Beflecken Sie die Brunnen mit 0,5 ml 0,5% kristallvioletter Lösung. Dann entfernen Sie die Fleckenlösung innerhalb von 2 min und waschen Sie die Brunnen mit einem sanften Wasserstrom vor dem Austrocknen der Luft.
- Zählen Sie die viralen Plaques, indem Sie die Platte auf einen Weißlichtkasten legen. Berechnen Sie den Prozentsatz (%) CVA16-Infektion wie folgt: (Mean - des Plaquevirus +Arzneimittels / Mittelwert des Plaquevirus+DMSO-Kontrolle)
-
Bewertung der Wirkung der gleichzeitigen Zugabe der Medikamente und des Virus (Koaddition)
- Seed RD-Zellen in 12-Well-Platten mit einer Saatdichte von 2 x 105 Zellen/Well. Über Nacht bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren, um eine Monoschicht zu erhalten.
- Behandeln Sie RD-Zellen mit den Prüfverbindungen in den entsprechenden Konzentrationen und 50 PFU/Well von CVA16 (Endvolumen des Inokulums beträgt 300 l) gleichzeitig für 1 h. Gestein die Platte alle 15 min.
- Waschen Sie Zellen mit 1 ml PBS und überlagern Sie dann mit 1-2 ml Basalmedium, das 0,8% Methylcellulose enthält, für eine weitere Inkubation bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator.
- Stain virale Plaques mit Kristallviolett nach 72 h post-Infektion und bestimmen Die% CVA16-Infektion wie oben beschrieben.
-
Bewertung der Arzneimittelbehandlungswirkung nach viralem Eintritt (nach der Infektion)
- Seed RD-Zellen in 12-Well-Platten mit einer Saatdichte von 2 x 105 Zellen/Well. Über Nacht bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren, um eine Monoschicht zu erhalten.
- Impfen Sie die RD-Zellen mit 50 PFU/Well von CVA16 (Endvolumen des Inokulums beträgt 300 l) für 1 h. Gestein die Platte alle 15 min.
- Waschen Sie die Brunnen mit 1-2 ml PBS und überlagern Sie die Zellen mit Basalmedien, die 0,8% Methylcellulose und die entsprechenden Konzentrationen von Prüfverbindungen enthalten.
- Stain virale Plaques mit Kristallviolett und zählen nach 72 h nach der Infektion und bestimmen die% CVA16 Infektion Inkubationen oben beschrieben.
HINWEIS: Führen Sie alle PBS-Washes vorsichtig aus, um das Heben der Zellen zu vermeiden.
3. Flow Cytometry-basierter Bindungstest
- Seed RD-Zellen in 12-Well-Platten mit einer Saatdichte von 2 x 105 Zellen/Well. Über Nacht bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren, um eine Monoschicht zu erreichen.
- Die Zellmonoschicht bei 4 °C für 1 h vorkühlen.
- Infizieren Sie RD-Zellen mit CVA16 (MOI = 100) in Gegenwart und Abwesenheit der Prüfverbindungen für 3 h bei 4 °C.
HINWEIS: Führen Sie die virale Impfung auf Eis und die anschließende Inkubation in einem 4 °C-Kühlschrank durch, um die Temperatur bei 4 °C zu halten, was eine virale Bindung, aber keinen Eintritt ermöglicht. - Entfernen Sie Virus Inoculum und waschen Sie einmal mit 1-2 ml eiskalte PBS.
- Heben Sie zellen, indem Sie 1 ml eiskalten Dissoziationspuffer für 3 min zu den Brunnen auf dem Eis hinzufügen, bevor Sie die Zellen sammeln und in eiskaltem Durchflusszytometriepuffer (1x PBS plus 2% FBS) wieder aufhängen.
- Waschen Sie Zellen zweimal mit dem eiskalten Durchflusszytometriepuffer und fixieren Sie die Zellen mit 0,5 ml 4% Paraformaldehyd für 20 min auf Eis.
- Waschen Sie die Zellen mit PBS, um alle ungebundenen oder schwach gebundenen Viren zu entfernen, und färben Sie dann die Zellen mit 1 ml Anti-VP1-Antikörper (1:2.000; verdünnt in PBS mit 3% BSA) auf Eis für 1 h, gefolgt von einer Inkubation mit einem sekundären Alexa 488-konjugierten Anti-Maus-IgG (1:250; in PBS mit 3% BSA) auf Eis für 1 h verdünnt. Führen Sie PBS-Waschungen (3-mal) nach jeder Antikörperbehandlung durch.
- Setzen Sie die Zellen in 0,5 ml des eiskalten Durchflusszytometriepuffers aus und führen Sie die Durchflusszytometrieanalyse an einem Durchflusszytometer mithilfe von Standardverfahren durch. Präsentieren Sie Daten in Histogrammen mit der zugehörigen Software und quantitieren Sie für die Darstellung von Balkendiagrammen.
4. Viraler Inaktivierungstest
-
Führen Sie den viralen Inaktivierungstest wie zuvorbeschrieben 12 unter Verwendung der folgenden Bedingungen durch:
- Eine Anfangskonzentration von 106 PFU/ml CVA16.
- RD-Zell-Monolayer in 12-Well-Platten aus einer Sädichte von 2 x 105 Zellen/Well.
- 50-fache Verdünnung zum Austäupfen der Wirkstoffverbindungen, was zu einer endgültigen Viruskonzentration von 50 PFU/Well führt.
- Waschschritte mit 1-2 ml PBS.
- Overlay-Medien mit 0,8% Methylcellulose. - Führen Sie die endgültige Auslesung der Virusinfektion mit der kristallvioletten Färbung von viralen Plaques Verfahren wie oben beschrieben.
5. Molekulare Docking-Analyse
- Laden Sie 3D-Moleküle von Testverbindungen von PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) herunter. Wenn Moleküle keine 3D-Struktur hochgeladen haben, laden Sie die 2D-Strukturen herunter oder verwenden Sie die SMILES-String-Sequenz und wandeln Sie sich über ein molekulares Programm (z.B. CORINA) in 3D-Moleküle um.
- Laden Sie die virale biologische Montageeinheit von der RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) herunter und erstellen Sie das virale Strukturmodell mit einem Biocomputing-Programm (z.B. UCSF Chimera). Zum Beispiel, im Fall von CVA16 reifen Virionenkristallstruktur (PDB: 5C4W)3, löschen Lösungsmittel aus der PDB-Datei, ersetzen unvollständige Seitenketten mit Daten aus der Dunbrach 2010 Rotamer Library, und fügen Sie Wasserstoffe und Ladungen zur Struktur als zuvor gemeldet13. Docking-Ziele können alle relevanten viralen Proteine für die beabsichtigte Analyse mit einer biologischen Montageinformation (Protein Data Bank) sein.
-
Dock-Test-Compounds auf die vorbereitete Viruseinheit mit z.B. UCSF Chimera und analysieren Sie die Ausgabedateien mit einer Visualisierungssoftware (z.B. Autodock Vina, PyMol):
- Laden Sie die Test-Compound-Datei in UCSF Chimera als "Ligand" hoch und führen Sie blindes Andocken durch, indem Sie das gesamte vorbereitete virale Protein als "Rezeptor" auswählen. Verwenden Sie die Computermaus oder das Trackpad, um die Größe des Suchvolumens auf den gesamten "Rezeptor" zu ändern. Lassen Sie unter "Erweiterte Optionen" die Anzahl der Bindungsmodi maximal zu. Docking-Frames werden automatisch von der höchsten bis zur niedrigsten Bindungsenergie gewertet.
- (Optional) Beschränken Sie die Andockstelle nach dem Blindandocken auf das virale Protein in Bereichen von Interesse, die aus den Blinddocking-Ergebnissen abgeleitet sind, indem Sie die Maus oder das Trackpad erneut verwenden, um das Suchvolumen zu reduzieren (z. B. 100 x 100 x 100 X). Dieser Schritt hilft, die Blind-Docking-Ergebnisse zu bestätigen und erhöht die Spezifität.
- Verwenden Sie ein molekulares Grafiksystem (z. B. PyMol), um die Positionen der Bindungsmodi zu analysieren, indem Sie die Dockingdatei hochladen. Finden Sie polare Kontakte von der Verbindung zum viralen Protein, indem Sie den "Ligand" auswählen und polare Kontakte mit der Option "zu beliebigen Atomen" identifizieren; die Ergebnisse zu untersuchen.
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Representative Results
Der Time-of-Drug-Additionstest ist in Abbildung 1 dargestellt und zeigt den Einfluss der Behandlung mit den kleinen Molekülen CHLA und PUG auf die CVA16-Infektion entweder vorviral (Vorbehandlung), während des viralen Eintrags (Koaddition) oder des postviralen Eintrags ( nach der Infektion). Beide kleinen Moleküle erzeugten nur marginale Auswirkungen auf die CVA16-Infektion, sei es bei der Vorbehandlung der Wirtszellen vor einer Virusinfektion (Abbildung 1A) oder in der Nachinfektionsbehandlung (Abbildung 1C). Im Gegensatz dazu haben CHLA und PUG die CVA16-Infektion bei der Co-Additionsbehandlung effizient um >80% aufgehoben (Abbildung 1B). Diese Beobachtungen deuten daher darauf hin, dass die beiden Verbindungen am effektivsten sind, wenn sie während der Infektion gleichzeitig mit den Viruspartikeln auf der Oberfläche der Wirtszelle vorhanden sind.
In Abbildung 2bestätigt die strömungszytometriebasierte Bindungsanalyse (schematisch dargestellt in Abbildung 2A), dass die beiden Tannine den CVA16-Eintrag verhindern, indem sie die virale Partikelbindung an die Wirtszellen verhindern. Die Quantifizierungsdaten in Abbildung 2B zeigen, dass die Virusmenge, die auf der RD-Zelloberfläche in Gegenwart der beiden Medikamente nachgewiesen wurde, weniger als 10 % beträgt, ähnlich der Heparin-Positivkontrolle, die bekanntermaßen CVA16-Anhang14verhindert. Abbildung 2C, 2Dund 2E zeigen die zugehörigen Durchflusszytometrie-Histogramme, bei denen die Bandverschiebung aufgrund des Nachweises von CVA16 auf der RD-Zelloberfläche signifikant reduziert wird, wenn CHLA und PUG vorhanden sind.
Abbildung 3A zeigt, wie das virale Inaktivierungsexperiment durchgeführt wurde. Die Wirkstoffverbindung wurde entweder mit den CVA16-Viruspartikeln gemischt und vor der Infektion für 1 h (langfristig) inkubiert oder vor der Infektion gemischt und sofort verdünnt (kurzfristig). Wie in Abbildung 3Bdargestellt, führte eine Vorinkubation der CV16-Partikel mit den Testmitteln für 1 h zu einem nahezu vollständigen Schutz der RD-Zellen gegen die Virusinfektion im Vergleich zur kurzfristigen Inkubation und der DMSO-Kontrolle. Die Ergebnisse deuten daher darauf hin, dass sowohl CHLA als auch PUG mit den CVA16-Partikeln interagieren und in der Folgeinfektion inaktiv werden können.
Da unsere Daten darauf hindeuten, dass die Wirkstoffverbindungen CVA16-Partikel direkt inaktivieren können und damit das Virion selbst als plausibles Ziel ihrer antiviralen Aktivität identifiziert werden, haben wir molekulares Andocken verwendet, um die potentielle Wechselwirkung(en) zwischen diesen und dem CVA16 Capsid Pentamer. Abbildung 4A zeigt eine Oberflächenprojektion des CVA16-Pentamers, aus dem das Ikosaeder-Capsid des CVA16-Virions besteht. Das molekulare Andocken der Tannine CHLA (Abbildung 4B; grün) und PUG (Abbildung 4C; blau) zeigen an, dass beide im Canyon-Bereich des CVA16-Pentamers binden sollen. Insbesondere beide kleinen Moleküle, die knapp über dem Tascheneingang gebunden sind (Abbildung4B und 4C, gezoomte Paneele), die den Taschenfaktor halten und eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der CVA16-Bindung und dem Eintritt in die Wirtszelle spielen. Sowohl CHLA als auch PUG scheinen daher den Eingangsbereich der Tasche zu maskieren, was theoretisch Wechselwirkungen zwischen den Viruspartikeln und den Wirtszellrezeptoren behindern würde. Abbildung 4D und 4E zeigen die einzigartigen Rückstände, die von den polaren Kontakten von CHLA bzw. PUG um den Tascheneingang vorhergesagt wurden, wobei die meisten dieser Wechselwirkungen mit VP1 für beide Verbindungen und die 3 Aminosäuren Asn85 auftreten. , Lys257und Asn417 haben gemeinsam zwischen den beiden Tanninen.
Abbildung 1: Time-of-Drug-Additionswirkung von CHLA und PUG gegen CVA16-Infektion. RD-Zellen wurden zu verschiedenen Zeiten der CVA16-Inokulation (50 PFU/Well) mit CHLA (20 M) oder PUG (25 M) behandelt. DMSO (0,25%) Behandlung wurde als Negativkontrolle aufgenommen und alle Assays wurden durch Plaque-Assay mit kristallvioletter Färbung 72 h nach der Inkubation analysiert. (A) Zur Vorbehandlung wurden die Zellen mit den Prüfverbindungen für 1 h oder 4 h inkubiert und dann vor der CVA16-Infektion gewaschen. (B) Für Co-Additions-Assays wurden Zellen 1 h gleichzeitig mit Medikamenten und Viren verabreicht und anschließend gewaschen. (C) Bei einer Nachinfektion wurden die Zellen 1 h lang mit CVA16 infiziert, gewaschen und anschließend mit Testverbindungen behandelt. Gezeigte Daten sind die Mittelwerte der Standardabweichung (SD) aus drei unabhängigen Experimenten. *p < 0,05 im Vergleich zur jeweiligen Gruppe "nur Viren". Die statistische Analyse wurde mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse durchgeführt. Diese Zahl wurde nach Bezugnahme9angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: CHLA und PUG beseitigen die CVA16-Bindung an die Wirtszelle. (A) Schematic des Strömungszytometrie-basierten Bindungs-Assays. (B) RD-Zellen (2 x 105 Zellen/Well) wurden mit CVA16 (MOI = 100) infiziert, wenn CHLA (20 M), PUG (25 M), lösliches Heparin (500 g/ml, Positive Kontrolle) oder DMSO (0,25%, Negativkontrolle) für 3 h bei 4 °C vorliegen. Inokula aus Brunnen wurden in Schläuche nimiert, zweimal mit PBS gewaschen, fixiert und mit Anti-VP1-Antikörpern gefärbt, gefolgt von Alexa 488-konjugierten Sekundärantikörpern zur Durchflusszytometriede Detektion von oberflächengebundenen Viren. Quantifizierte Daten aus den erkannten Fluoreszenzsignalen wurden als Mittel -SD aus drei unabhängigen Experimenten im Stabdiagramm als "Virusbindung (%)" dargestellt. *p < 0,05 im Vergleich zur "DMSO"-Kontrollbehandlung. Die statistische Analyse wurde mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse durchgeführt. Gezeigt werden die repräsentativen Durchflusszytometrie-Histogramme von CHLA -C), PUG (D) und Heparin (E) Behandlungen. Diese Zahl wurde nach Bezugnahme9angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: CHLA und PUG inaktivieren zellfreie CVA16-Viruspartikel. (A) Schematic des viralen Inaktivierungs-Assays. (B) CVA16 (106 PFU/Well) wurde mit CHLA (20 m) oder PUG (25 m) behandelt und sofort zur kurzfristigen Inaktivierung gemischt oder für 1 h bei 37 °C zur langfristigen Inaktivierung inkubiert, bevor sie 50-fach auf eine nicht wirksame Konzentration von Vor der Impfung auf RD-Zellen (endgültige Viruskonzentration = 50 PFU/Well). DMSO (0,25%) wurde als Negativkontrolle verwendet. Die Experimente wurden mittels Plaque-Assay mit kristallvioletter Färbung 72 h nach der Infektion analysiert. Gezeigte Daten sind die Mittel - SD aus drei unabhängigen Experimenten. *p < 0,05 im Vergleich zur jeweiligen Gruppe "nur Viren". Die statistische Analyse wurde mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse durchgeführt. Diese Zahl wurde nach Bezugnahme9angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: CHLA und PUG zielen auf das CVA16-Capsid in der Nähe des Tascheneingangs ab. Oberflächenprojektion des CVA16 Virionenpartikels mit dem monomeren Strukturpentamer, der durch rote Linien abgegrenzt ist (A). Zusätzliche Pentamer auf dem Virion werden in Cyan, Magenta, Indigo, Bronze und Grün gezeigt. Molekulare Dockinganalyse von CHLA (B, grün) und PUG (C, blau) am CVA16 Pentamer (PDB: 5C4W); vergrößerte Paneele sind gelb abgegrenzt. VP1 = orange, VP2 = grau, VP3 = weiß; Polarkontakte werden als schwarze Striche angezeigt. Rückstände, die Make-up Tascheneingang sind rot gefärbt (Ile94, Asp95, Gln207, Met212, Met213, Lys257, Thr258). D, E. Nahaufnahme seitliche Ansicht in den Canyon, wo sich der Tascheneingang befindet und an den chlA (D) und PUG (E) binden. Einzigartige Rückstände, bei denen es sich um polare Kontakte von den polaren Kontakten der Verbindungen am Pentamer handelt, sind in gelb (VP1), weiß (VP2) und in schwarzen (VP3) Schriftarten gekennzeichnet. Die weiße gestrichelte Linie zeigt den Bereich des Tascheneingangs an. Diese Zahl wurde nach Bezugnahme9angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In diesem Bericht haben wir die Protokolle beschrieben, die für die Identifizierung antiviraler Kandidaten nützlich sind, die auf die Viruseingabe abzielen, insbesondere gegen die nicht umhüllte CVA16. Die Assays sind so konzipiert, dass die frühen Ereignisse während des viralen Eintrags sezieren, was hilfreich ist, um den Wirkmechanismus(n) und die potenziellen Ziele der antiviralen Aktivität der Testmittel zu klären. Der "Time-of-Drug-Addition ssay" ermöglicht es, das potenzielle Ziel der Testverbindungen, z. B. die nicht infizierten Wirtszellen (Vorbehandlungsanalyse), die Viruspartikel oder ihre Wechselwirkungen mit der Wirtszelloberfläche (Koadditionsanalyse) umfassend zu bestimmen. ) oder die virusinfizierte Wirtszelle während der viralen Replikatphase (Post-Infektionsanalyse). Dieser Assay allein kann die Methode der Wechselwirkung aus den Verbindungen (z.B. Co-Addition) bestimmen, die zu den nachfolgenden Assays führt, die in diesem Protokoll beschrieben werden (z. B. viraler Inaktivierungstest und Bindungsanalyse). Waschschritte sind entscheidend, um sicherzustellen, dass die untersuchte Behandlungsmethode spezifisch für die untersuchte Behandlung ist. Die Verwendung des "Flow Cytometry-basierten Bindungsassays" hilft, den Einfluss der Verbindungen speziell auf die Virusbindung an die Wirtszelle zu bewerten. Die Aufrechterhaltung der Temperatur des Experiments bei 4 °C ist wichtig für den endgültigen Nachweis der Virionen auf der Zelloberfläche, da diese Temperatur eine virale Bindung, aber keinen Eintritt ermöglicht. Der "virale Inaktivierungstest" kann helfen, eine mögliche physikalische Wechselwirkung der Wirkstoffverbindungen mit den zellfreien Viruspartikeln zu bestimmen. Der entscheidende Schritt ist die Verdünnung für die Ausscheidung der Wirkstoffverbindungen nach der Inkubation mit dem viralen Inokulum, da dies notwendig ist, um jede sinnvolle Wechselwirkung der Medikamente mit der Wirtszelloberfläche im nachfolgenden Infektionsschritt12zu verhindern.
Da es sich bei der viralen Eingabe um ein mehrstufiges Ereignis handelt, könnte eine virusvirale Inhibitorklasse antiviraler Wirkstoffe möglicherweise verschiedene Arten von Mechanismen ausüben, darunter: (1) Modulation von Zelloberflächeneintrittsfaktoren/Rezeptoren oder den zugehörigen Signalwegen; (2) Auswirkungen auf die Fluidität oder Integrität der Zellmembran; (3) auf elektrostatische oder van der Waals-Wechselwirkungen zwischen den Viruspartikeln und der Wirtszelloberfläche abzielen; (4) die Induzieren physikalischer Veränderungen der Virionen wie Partikelbruch oder -aggregation; (5) Bindung an virale Glykoproteine oder Kapsidproteine und Verhinderung ihrer Funktionen oder Konformationsveränderungen; (6) Blockierung fusionsassoziierter Mechanismen; und (7) die Freisetzung des viralen Genoms in der Wirtszelle zu verhindern. Die in diesem Bericht beschriebenen Analysen können daher dazu beitragen, auf die oben aufgeführten potenziellen Wirkungsweisen hinzuweisen, die durch weitere Experimente weiter validiert werden können. Schließlich ist die hier beschriebene "molekulare Andockanalyse" von entscheidender Bedeutung, um potenzielle Wechselwirkungsbereiche zwischen den Wirkstoffverbindungen und den Viruspartikeln vorherzusagen, und kann als solche dazu beitragen, kandidaten virale Kapsid- oder Glykoproteinbindemittel und die gezielten Rückstände auf den Viruspartikeln. Diese Vorhersagen hängen jedoch von der Docking-Software und der Auflösung und Genauigkeit der viralen Proteinkristallstrukturen ab. Es ist wichtig zu beachten, dass die optionale begrenzte Andockmethode in Schritt 5.3.2 hinzugefügt wurde, da der Liganden häufig bei Verwendung viraler Strukturproteine als "Rezeptor"-Molekül an Bereiche binden kann, die normalerweise nicht zugänglich oder an der Oberfläche exponiert sind ( z.B. unter der Oberfläche des Virion-Capsids, das auf das Innere des Virions, Transmembranbereiche von Hüllglykoproteinen usw. zugewandt ist). Durch das Einschränken des Suchfeldes können nur zugängliche Regionen des viralen Proteins gezielt eingesetzt werden und unrealistische Wechselwirkungen ausgeschlossen werden. Das molekulare Andocken ist abhängig von kristallisierten Strukturen, aber die jüngsten Fortschritte in der Homologiemodellierung haben die Analyse nicht kristallisierter Strukturen ermöglicht, indem sie ihre Aminosäuresequenz an eine eng verwandte kristallisierte Strukturanpassten 15. Dies hat es ermöglicht, mehr Strukturen zu analysieren, und die erfassten Informationen können für weitere Studien nützlich sein, einschließlich Mutationsanalysen, die helfen können, die vorhergesagten Wechselwirkungen zu validieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in diesem Bericht beschriebenen Assays und Protokolle speziell darauf ausgerichtet sind, antivirale Wirkstoffe zu identifizieren, die auf den Viraleintritt abzielen, und Informationen darüber bereitzustellen, auf welchen Schritt des Viruseintrittsprozesses der Testwirkstoff abzielt, ob sie mit freien Viruspartikeln interagieren und mögliche Wechselwirkungsstellen für Medikamente auf den Virionen vorhersagen. Diese Arten von Assays können auf anderen nicht umhüllten Viren wiederholt oder an umhüllte Viren angepasst werden, um antivirale Arzneimittelverbindungen auf mögliche Inhibitoren des viralen Eintrags zu screening. Die Verwendung eines solchen mechanismusgesteuerten Ansatzes zur Identifizierung antiviraler Kandidaten könnte dazu beitragen, den Arzneimittelentwicklungsprozess zu beschleunigen und den Umfang antiviraler Therapeutika zu erweitern.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Joshua Beckham von der University of Texas at Austin für die technische Unterstützung beim molekularen Andocken. Diese Studie wurde teilweise durch Fördermittel des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie Taiwans (MOST107-2320-B-037-002 bis C.-J.L. und L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 und MOST107-2320-B-038-034-MY3 bis L.-T.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
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