Summary
El objetivo del protocolo es ilustrar los diferentes ensayos relacionados con la entrada viral que se pueden utilizar para identificar los inhibidores de entrada viralcandidatos.
Abstract
Los ensayos antivirales que examinan mecanísticamente la entrada viral son pertinentes para discernir en qué paso los agentes evaluados son más eficaces y permiten la identificación de los inhibidores de entrada viralcandidatos. Aquí, presentamos los enfoques experimentales para la identificación de moléculas pequeñas capaces de bloquear la infección por el coxsackievirus No envuelto A16 (CVA16) a través de la orientación a las partículas del virus o pasos específicos en la entrada viral temprana. Los ensayos incluyen el análisis de tiempo de adición de fármacos, el ensayo de unión viral basado en citometría de flujo y el ensayo de inactivación viral. También presentamos un protocolo de acoplamiento molecular que utiliza proteínas cápside de virus para predecir posibles residuos dirigidos por los compuestos antivirales. Estos ensayos deben ayudar en la identificación de agentes antivirales candidatos que actúan sobre la entrada viral. Las instrucciones futuras pueden explorar estos posibles inhibidores para el desarrollo de fármacos adicionales.
Introduction
La enfermedad de manos, pies y boca (HFMD) es una enfermedad más comúnmente causada por el coxsackievirus A16 (CVA16) y el enterovirus 71 (EV71) en niños pequeños. Recientemente en toda la región de Asia y el Pacífico, ha habido un repunte significativo en la HFMD inducida por CVA16. Si bien los síntomas pueden ser leves, pueden ocurrir complicaciones graves que afectan el cerebro y el corazón, con una posible letal1,2. En la actualidad, no hay terapias antivirales autorizadas ni vacunas disponibles para CVA16, por lo que es urgente desarrollar estrategias antivirales para frenar futuros brotes y las complicaciones asociadas.
CVA16 es un virus no envuelto que tiene una cápside icosahedral ensamblado a partir de pentámeros que contienen 4 proteínas estructurales, a saber, VP1, VP2, VP3 y VP4. Rodear cada eje de cinco veces en el pentamer es una región 'canyon' que se muestra como una depresión y se destaca por su papel en la unión de receptores3. En la parte inferior de este cañón se encuentra un bolsillo hidrófobo en la región de VP1 que contiene un ligando graso natural llamado esfingosina (SPH). Se ha sugerido que los receptores celulares, como el ligando de glicoproteína p -1 (PSGL-1) y el receptor carroñero de la clase B miembro 2 (SCARB2), desempeñen un papel en la unión viral desplazando este ligando que resulta en cambios conformacionales en la posterior expulsión del genoma viral en la célula huésped4,5,6. La identificación de posibles inhibidores que bloquean los sucesivos eventos en el proceso de entrada viral podría proporcionar posibles estrategias terapéuticas contra la infección por CVA16.
Los pasos en el ciclo de vida del virus se pueden diseccionar a través de enfoques experimentales como objetivos para ayudar a identificar agentes antivirales específicos del modo. Un análisis de tiempo de adición de fármacos examina el efecto del tratamiento farmacológico en diferentes momentos durante la infección viral, incluyendo la preentrada (agregada antes de la infección por el virus), la entrada (agregada simultánea a la infección por el virus) y la infección por virus)7. El impacto se puede evaluar utilizando un ensayo de placa estándar cuantificando el número de placas virales formadas en cada una de las condiciones del tratamiento. El ensayo de unión viral basado en citometría de flujo determina si el medicamento evita la unión viral a las células huésped. Esto se logra cambiando la temperatura de 37 oC, a la que se producen la mayoría de las infecciones por virus humanos, a 4 oC, donde los viriones son capaces de unirse a la superficie de la célula huésped pero no pueden entrar en las células7. Las partículas del virus unido a la membrana celular se cuantifican a través de la inmunomancha contra los antígenos virales y se evalúan mediante citometría de flujo. El ensayo de inactivación viral, por otro lado, ayuda a evaluar posibles interacciones físicas del fármaco con partículas de virus libres, ya sea protegiendo o neutralizando los viriones, o causando agregaciones o cambios de conformación que los hacen inactivos para interacciones posteriores con la superficie de la célula huésped durante la infección8,9. En este experimento, el inóculo viral se permite incubar primero con el fármaco antes de ser diluido para valorar la droga antes de infectar a la monocapa de la célula huésped y realizar un ensayo de placa estándar8. Por último, el acoplamiento molecular es una poderosa herramienta para predecir posibles sitios de interacción farmacológica en la superficie del virión, incluidas las glicoproteínas virales de los virus envueltos y las proteínas cápside virales de virus no envueltos, mediante el uso de virus computacionales Algoritmos. Esto ayuda a identificar mecanísticamente los objetivos del modo de acción de la droga y proporcionar información útil que puede ser validada aún más por ensayos posteriores.
Recientemente empleamos los métodos descritos anteriormente para identificar compuestos antivirales que bloquearon eficientemente la infección por el CVA169no envuelto. En este documento, se describen y discuten los protocolos detallados que se utilizaron.
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Protocol
NOTA: Todos los cultivos celulares y las infecciones por virus deben llevarse a cabo en campanas de bioseguridad certificadas que sean adecuadas para el nivel de bioseguridad de las muestras que se manipulan. Las dos moléculas pequeñas de ácido quebulágico (CHLA) y punicalagin (PUG), quese observaron para bloquear eficientemente la infección CVA16 9, se utilizan como ejemplos de agentes inhibidores candidatos. Para los principios básicos en técnicas virológicas, propagación de virus, determinación de la sentenciadeda de virus y conceptos de unidades formadoras de placas (PFU) o multiplicidad de infección (MOI), se remite al lector a la referencia10.
1. Cultivo celular, preparación de virus, preparación de compuestos y citotoxicidad compuesta
- Las células humanas de rabdomiosarcoma (RD) son células huésped permisivas a la infección CVA1611. Cultivar las células RD en 10 ml del medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 200 U/ml de penicilina G, 200 g/ml de estreptocina y 0,5 g/ml de anfotericina B en frascos De-75 a 37 oC en una incubadora de CO 2.
- Prepare CVA16 propagando el virus en las células rd y determine el titer viral en PFU/ml. Para el protocolo optimizado, consulte la referencia11.
- Preparar los compuestos y controles de ensayo utilizando sus respectivos disolventes: por ejemplo, disolver CHLA y PUG en dimetilsulfóxido (DMSO). Para todos los pasos de infección, el medio basal consistía en DMEM más 2% FBS y antibióticos.
NOTA: La concentración final de DMSO en los tratamientos compuestos de ensayo es igual o inferior al 0,25% en los experimentos; 0.25% DMSO se incluye como un tratamiento de control negativo en los ensayos para la comparación. - Realizar el ensayo de citotoxicidad de los compuestos de ensayo en las células RD utilizando un reactivo determinante de viabilidad celular como XTT ((2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenilo]-5-feniloamino)-carbonilo]-2H-tetrazolium hidróxido). Para un protocolo detallado, consulte la referencia12. Determinar las concentraciones de citotoxicidad de los compuestos de ensayo utilizando un software analítico como GraphPad Prism de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para el resto del estudio se utilizan concentraciones de fármacos que no influyen significativamente en la viabilidad celular (células viables del 95%) .
2. Ensayo de tiempo de adición de drogas
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Evaluar la influencia de los medicamentos en las células huésped antes de la infección viral (pretratamiento)
- Células de RD de semillas en placas de 12 pocillos a una densidad de sembración de 2 x 105 células/pozo. Incubar durante la noche a 37oC en una incubadora de CO2 al 5% para obtener una monocapa.
- Tratar las células RD con compuestos de ensayo a concentraciones no citotóxicas (determinadas a partir del paso 1.4) en 1 ml de volumen de medios basales durante 1 h o 4 h.
- Lavar las células con 1-2 ml de PBS antes de añadir 50 PFU/pozo de virus en medio basal (el volumen final del inóculo es de 300 ol) durante 1 h. Mece la placa cada 15 minutos.
- Después de la infección, lave las monocapas de nuevo usando PBS, luego superponga con 1 ml de medios basales que contengan 0,8% de metilcelulosa para una mayor incubación a 37 oC en una incubadora deCO2 al 5%.
- Después de 72 h de incubación, retire el medio de superposición y lave los pozos usando 2 ml de PBS.
- Fijar los pozos usando 0.5 mL de 37% formaldehído durante 15 min.
- Retire el sobrenadante y lávelo de nuevo con PBS.
- Mancha los pozos con 0,5 ml de solución violeta cristalina al 0,5%. A continuación, retire la solución de manchas en 2 minutos y lave los pozos con una corriente suave de agua antes de secar al aire.
- Cuente las placas virales colocando la placa en una caja de luz blanca. Calcular el porcentaje (%) CVA16 infección de la siguiente manera: (Media de virus de placa + droga / Media de virus de placa + control DMSO) - 100%.
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Evaluar el efecto de la adición de los fármacos y el virus simultáneamente (co-adición)
- Células de RD de semillas en placas de 12 pocillos a una densidad de sembración de 2 x 105 células/pozo. Incubar durante la noche a 37oC en una incubadora de CO2 al 5% para obtener una monocapa.
- Tratar las células RD con los compuestos de ensayo a las concentraciones adecuadas y 50 PFU/pozo de CVA16 (el volumen final del inóculo es de 300 ol) simultáneamente durante 1 h. Mecer la placa cada 15 minutos.
- Lavar las células con 1 ml de PBS y luego superponer con 1-2 ml de medios basales que contengan 0,8% de metilcelulosa para una mayor incubación a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5%.
- Mancha las placas virales con cristal violeta después de 72 h después de la infección y determinar el% de la infección CVA16 como se describió anteriormente.
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Evaluar el efecto del tratamiento farmacológico después de la entrada viral (post-infección)
- Células de RD de semillas en placas de 12 pocillos a una densidad de sembración de 2 x 105 células/pozo. Incubar durante la noche a 37oC en una incubadora de CO2 al 5% para obtener una monocapa.
- Inocular las células RD con 50 PFU/pozo de CVA16 (el volumen final del inóculo es de 300 ol) durante 1 h. Mece la placa cada 15 minutos.
- Lavar los pozos con 1-2 ml de PBS y superponer las células con medios basales que contengan 0,8% de metilcelulosa y las concentraciones adecuadas de compuestos de ensayo.
- Manchas placas virales con violeta cristalina y cuentan después de 72 h después de la infección y determinan el% de las incubaciones de infección CVA16 descritas anteriormente.
NOTA: Realice todos los lavados DE PBS suavemente para evitar levantar las células.
3. Ensayo de enlace basado en citometría de flujo
- Células de RD de semillas en placas de 12 pocillos a una densidad de sembración de 2 x 105 células/pozo. Incubar durante la noche a 37oC en una incubadora de CO2 al 5% para lograr una monocapa.
- Enfríe previamente la monocapa celular a 4oC durante 1 h.
- Infectar las células de RD con CVA16 (MOI a 100) en presencia y ausencia de los compuestos de ensayo durante 3 h a 4 oC.
NOTA: Realizar la inoculación viral sobre el hielo y la incubación subsiguiente en un refrigerador de 4oC para mantener la temperatura a 4oC, lo que permite la unión viral pero no la entrada. - Retire el inóculo del virus y lávelo una vez con 1-2 ml de PBS helado.
- Levante las células agregando 1 ml de tampón de disociación helada a los pozos en hielo durante 3 minutos, antes de recoger las células y resuspenderlas en tampometría de citometría de flujo de frío y hielo (1x PBS más 2% FBS).
- Lave las células dos veces con el tampón de citometría de flujo frío y fije las células con 0,5 ml de paraformaldehído al 4% durante 20 minutos sobre hielo.
- Lavar las células usando PBS para eliminar cualquier virus no enlazado o débilmente unido, y luego manchar las células con 1 ml de anticuerpo anti-VP1 (1:2,000; diluido en PBS que contiene 3% de BSA) en hielo durante 1 h, seguido de la incubación con un IgG secundario conjugado con el propio Ratón Conjugado Alexa 488 (1:250; diluido en PBS que contiene 3% de BSA) sobre hielo durante 1 h. Realizar lavados de PBS (3 veces) después de cada tratamiento con anticuerpos.
- Resuspenda las células en 0,5 ml del tampón de citometría de flujo frío y realice análisis de citometría de flujo en un citometro de flujo utilizando procedimientos estándar. Presente los datos en histogramas utilizando el software asociado y el quantitado para la representación del gráfico de barras.
4. Ensayo de inactivación viral
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Realice el ensayo de inactivación viral como se describió anteriormente12 utilizando las siguientes condiciones:
- Concentración inicial de 106 PFU/ml de CVA16.
- Monocapas de células RD en placas de 12 pocillos a partir de una densidad de sembrado de 2 x 105 células/pozo.
- 50 veces la dilución para la valoración de los compuestos de la droga resultando en una concentración final del virus de 50 PFU/bueno.
- Lavar los pasos con 1-2 ml de PBS.
- Medios superpuestos que contienen 0,8% de metilcelulosa. - Realizar la lectura final de la infección viral utilizando la tinción violeta cristalina de las placas virales procedimiento como se detalló anteriormente.
5. Análisis de acoplamiento molecular
- Descargar moléculas 3D de compuestos de prueba de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Si las moléculas no tienen una estructura 3D cargada, descargue las estructuras 2D o utilice la secuencia de cuerdas SMILES y transforme en moléculas 3D a través de un programa molecular (por ejemplo, CORINA).
- Descargue la unidad de ensamblaje biológico viral de RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) y prepare el modelo de estructura viral utilizando un programa de biocomputación (por ejemplo, UCSF Quimera). Por ejemplo, en el caso de la estructura de cristal de virión madura CVA16 (PDB: 5C4W)3, eliminar disolventes del archivo PDB, reemplazar las cadenas laterales incompletas utilizando datos de la Biblioteca Rotamer Dunbrach 2010, y añadir hidrógenos y cargas a la estructura como previamente reportado13. Los objetivos de acoplamiento pueden ser cualquier proteína viral relevante para el análisis previsto con información de ensamblaje biológico (Banco de Datos de Proteínas).
-
Acople compuestos de prueba en la unidad de virus preparada utilizando, por ejemplo, ucSF Quimera, y analice los archivos de salida con un software de visualización (por ejemplo, Autodock Vina, PyMol):
- Cargue el archivo compuesto de prueba en UCSF Quimera como el 'ligand' y realice el acoplamiento ciego seleccionando toda la proteína viral preparada como el 'receptor'. Utilice el ratón del ordenador o el trackpad para cambiar el tamaño del volumen de búsqueda a todo el 'receptor'. En 'Opciones avanzadas', permita que el número de modos de enlace sea al máximo. Los marcos de acoplamiento se clasificarán automáticamente de mayor a menor energía de enlace.
- (Opcional) Además del acoplamiento a ciegas, limite el sitio de acoplamiento a la proteína viral en regiones de interés derivadas de los resultados de acoplamiento ciego utilizando el ratón o el trackpad de nuevo para reducir el volumen de búsqueda (por ejemplo, 100 x 100 x 100 o). Este paso ayuda a confirmar los resultados de acoplamiento ciego y aumenta la especificidad.
- Utilice un sistema de gráficos moleculares (por ejemplo, PyMol) para analizar las posiciones de los modos de enlace cargando el archivo de acoplamiento. Encuentra contactos polares desde el compuesto hasta la proteína viral seleccionando el 'ligand' e identificando los contactos polares con la opción 'a cualquier átomo'; examinar los resultados.
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Representative Results
El ensayo de tiempo de adición de fármacos está indicado en la Figura 1 y muestra la influencia del tratamiento utilizando las moléculas pequeñas CHLA y PUG en la infección CVA16, ya sea la entrada previral (pretratamiento), durante la entrada viral (adición co-similar) o la entrada postviral ( post-infección). Ambas moléculas pequeñas sólo produjeron un impacto marginal contra la infectividad CVA16, ya sea en el pretratamiento de las células huésped antes de la infección viral (Figura1A)o en el tratamiento posterior a la infección (Figura1C). Por el contrario, CHLA y PUG abrogaron eficientemente la infección por CVA16 en >80% en el tratamiento de co-adición (Figura1B). Por lo tanto, estas observaciones sugieren que los dos compuestos son más eficaces cuando están presentes simultáneamente con las partículas del virus en la superficie de la célula huésped durante la infección.
En la Figura 2, el análisis de enlace basado en citometría de flujo (ilustrado esquemáticamente en la Figura 2A)confirma que los dos taninos impiden la entrada de CVA16 impidiendo la unión de partículas virales a las células huésped. Los datos de cuantificación de la Figura 2B muestran que la cantidad de virus detectados en la superficie de la célula RD en presencia de los dos fármacos, es inferior al 10%, similar al control positivo de heparina que se sabe que impide la conexión CVA1614. La Figura 2C, 2Dy 2E representa los histogramas de citometría de flujo asociados donde el cambio de banda debido a la detección de CVA16 en la superficie de la célula RD se reduce significativamente cuando CHLA y PUG están presentes.
La Figura 3A muestra cómo se realizó el experimento de inactivación viral. El compuesto del fármaco se mezcló con las partículas del virus CVA16 e incubado durante 1 h (a largo plazo) antes del paso de dilución, o mezclado e inmediatamente diluido (a corto plazo) antes de la infección. Como se muestra en la Figura 3B,una preincubación de las partículas CV16 con los agentes de prueba durante 1 h condujo a una protección casi completa de las células RD contra la infección viral en comparación con la incubación a corto plazo y el control DMSO. Por lo tanto, los resultados sugieren que TANTO CHLA como PUG interactúan con las partículas CVA16 y son capaces de hacerlas inactivas en la infección posterior.
Dado que nuestros datos indican que los compuestos farmacológicos pueden inactivar directamente las partículas CVA16, y por lo tanto identificar el virión en sí como un objetivo plausible de su actividad antiviral, utilizamos el acoplamiento molecular para predecir la interacción potencial entre estos agentes y el pentamer cápside CVA16. La Figura 4A muestra una proyección superficial del pentamer CVA16 que constituye la cápside icosahedral del virión CVA16. El acoplamiento molecular de los taninos CHLA (Figura4B;verde) y PUG (Figura4C;azul) indican que ambos están previstos para unirse en la región del cañón del pentamer CVA16. Específicamente, ambas moléculas pequeñas unidas justo por encima de la entrada de bolsillo (Figura4B y 4C,paneles con zoom), que mantiene el factor de bolsillo y desempeña un papel importante para mediar la unión CVA16 y la entrada en la célula huésped. Tanto CHLA como PUG parecen enmascarar la región de entrada de bolsillo, lo que teóricamente obstruiría las interacciones entre las partículas del virus y los receptores de células huésped. La Figura 4D y 4E indican los residuos únicos pronosticados a partir de los contactos polares de CHLA y PUG, respectivamente, alrededor de la entrada del bolsillo, con la mayoría de estas interacciones que ocurren con VP1 para ambos compuestos y los 3 aminoácidos Asn85 , Lys257,y Asn417 siendo en común entre los dos taninos.
Figura 1: Efecto de tiempo de adición de fármacos de CHLA y PUG contra la infectividad CVA16. Las células RD fueron tratadas con CHLA (20 oM) o PUG (25 oM) en diferentes momentos de inoculación CVA16 (50 PFU/pozo). DMSO (0,25%) el tratamiento se incluyó como control negativo y todos los ensayos fueron analizados por ensayo de placa utilizando manchas de cristal violeta 72 h después de la incubación. (A) Para el pretratamiento, las células se incuban con los compuestos de prueba durante 1 h o 4 h y luego se lavaron antes de la infección por CVA16. (B) Para ensayos de adición conjunta, las células se administraron con medicamentos y virus simultáneamente durante 1 h y luego se lavaron. (C) En la posinfección, las células se infectaron con CVA16 durante 1 h, se lavaron y luego se trataron con compuestos de prueba. Los datos que se muestran son las medias de desviación estándar (SD) de tres experimentos independientes. *p < 0.05 en comparación con el grupo respectivo 'solo virus'. El análisis estadístico se realizó utilizando el análisis unidireccional de la varianza. Esta figura ha sidoadaptada de la referencia 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: CHLA y PUG abolir la unión CVA16 a la célula host. (A) Esquema del ensayo de encuadernación basado en citometría de flujo. (B) células RD (2 x 105 células/pozo) se infectaron con CVA16 (MOI a 100) en presencia o ausencia de CHLA (20 oM), PUG (25 oM), heparina soluble (500 g/ml, control positivo) o DMSO (0,25%, control negativo) durante 3 h a 4 oC. El inócula de los pozos se recogió en tubos, se lavó con PBS dos veces, se fijó y se tiñó con anticuerpoantido anti-VP1 seguido de anticuerpo secundario conjugado alexa 488 para la detección de citometría de flujo de virus enlazados a la superficie. Los datos cuantificados de las señales de fluorescencia detectadas se trazaron como el medio de SD de tres experimentos independientes en el gráfico de barras como 'Enlace de virus (%)'. *p < 0,05 en comparación con el tratamiento de control 'DMSO'. El análisis estadístico se realizó utilizando el análisis unidireccional de la varianza. Se muestran los histogramas representativos de citometría de flujo de los tratamientos CHLA (C), PUG (D) y heparina (E). Esta figura ha sidoadaptada de la referencia 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: CHLA y PUG inactivan partículas del virus CVA16 libres de células. (A) Esquema del ensayo de inactivación viral. (B) CVA16 (106 PFU/pozo) fue tratado con CHLA (20 oM) o PUG (25 m) y mezclado inmediatamente para inactivación a corto plazo o incubado durante 1 h a 37 oC para inactivación a largo plazo antes de diluirse 50 veces a una concentración no efectiva de ensayo compuestos antes de inocular las células rd (concentración final del virus 50 PFU/pozo). DMSO (0,25%) fue utilizado como un control negativo. Los experimentos fueron analizados por ensayo de placa utilizando manchas violetas cristalinas 72 h después de la infección. Los datos que se muestran son los medios de SD de tres experimentos independientes. *p < 0.05 en comparación con el grupo respectivo 'solo virus'. El análisis estadístico se realizó utilizando el análisis unidireccional de la varianza. Esta figura ha sidoadaptada de la referencia 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: CHLA y PUG apuntan a la cápside CVA16 cerca de la entrada de bolsillo. Proyección superficial de la partícula de virión CVA16 con el pentamer estructural monomérico delineado por líneas rojas (A). Los pentamers adicionales en el virión se muestran en cian, magenta, índigo, bronce y verde. Análisis de acoplamiento molecular de CHLA (B, verde) y PUG (C, azul) en el pentamer CVA16 (PDB: 5C4W); los paneles ampliados se demarcan en amarillo. VP1 - naranja, VP2 - gris, VP3 - blanco; los contactos polares se muestran como guiones negros. Los residuos que componen la entrada de bolsillo son de color rojo (Ile94, Asp95, Gln207, Met212, Met213, Lys257, Thr258). D, E. Vista lateral de primer plano en el cañón donde se encuentra la entrada de bolsillo y donde CHLA (D) y PUG (E) se unen. Los residuos únicos que son contactos polares de los contactos polares de los compuestos en el pentamer están etiquetados en fuentes amarillas (VP1), blancas (VP2) y negras (VP3). La línea blanca discontinua indica la región de entrada de bolsillo. Esta figura ha sidoadaptada de la referencia 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este informe, describimos los protocolos que son útiles para la identificación de candidatos antivirales que se dirigen a la entrada viral, en particular contra el CVA16 no envuelto. Los ensayos están diseñados de manera sectización de los primeros eventos durante la entrada viral, lo que es útil para aclarar el mecanismo o mecanismos de acción y los posibles objetivos de la actividad antiviral de los agentes de prueba. El "ensayo de tiempo de adición de fármacos" permite determinar ampliamente el objetivo potencial de los compuestos de ensayo, por ejemplo, las células huésped no infectadas (análisis de pretratamiento), las partículas del virus o sus interacciones con la superficie de la célula huésped (análisis de adición de co-adición ), o la célula huésped infectada por el virus durante la fase replicativa viral (análisis posterior a la infección). Este ensayo por sí solo puede determinar el método de interacción de los compuestos (por ejemplo, la adición combinada) que conduce a los ensayos posteriores descritos en este protocolo (por ejemplo, el ensayo de inactivación viral y el análisis de unión). Las medidas de lavado son fundamentales para garantizar que el método de tratamiento examinado sea específico del analizado. El uso del «ensayo de unión basado en citometría de flujo» ayuda a evaluar la influencia de los compuestos específicamente en la unión de virus a la célula huésped. Mantener la temperatura del experimento a 4oC es importante para la detección final de los viriones en la superficie celular, ya que esta temperatura permite la unión viral pero no la entrada. El "ensayo de inactivación viral" puede ayudar a determinar la interacción física potencial de los compuestos farmacológicos con las partículas del virus libre de células. El paso crítico es la dilución para valorar los compuestos del fármaco después de la incubación con el inóculo viral, ya que esto es necesario para evitar cualquier interacción significativa de los fármacos con la superficie de la célula huésped en el paso12de la infección posterior.
Dado que la entrada viral es un evento de varios pasos, una clase de inhibidores de entrada viral de agentes antivirales podría ejercer posiblemente varios tipos de mecanismos, entre ellos: (1) la modulación de los factores/receptores de entrada de la superficie celular o sus vías de señalización asociadas; (2) afectar la fluidez o integridad de la membrana celular; (3) apuntar a las interacciones electrostáticas o van der Waals entre las partículas del virus y la superficie de la célula huésped; 4) inducir cambios físicos en los viriones, como la rotura de partículas o la agregación; 5) unión a glicoproteínas virales o proteínas cápside y la prevención de sus funciones o cambios de conformación; 6) bloquear los mecanismos asociados a la fusión; y (7) prevenir la liberación del genoma viral dentro de la célula huésped. Por lo tanto, los análisis descritos en este informe pueden ayudar a señalar los modos de acción potenciales mencionados anteriormente que pueden ser validados aún más por experimentos adicionales. Por último, el "análisis de acoplamiento molecular" descrito aquí es instrumental para predecir posibles regiones de interacción entre los compuestos farmacológicos y las partículas del virus, y como tal puede ayudar a identificar los aglutinantes de cápside o glicoproteína viralcandidatos candidatos y los residuos de las partículas del virus. Sin embargo, estas predicciones dependen del software de acoplamiento y de la resolución y precisión de las estructuras de cristal de proteínaviral. Es importante tener en cuenta que el método de acoplamiento confinado opcional en el paso 5.3.2 se añadió porque a menudo cuando se utilizan proteínas estructurales virales como la molécula 'receptor', el ligando posiblemente puede unirse a regiones normalmente no accesibles o expuestas en la superficie ( por ejemplo, bajo la superficie de la cápside de virión frente al interior del virión, regiones transmembranas de glicoproteínas envolventes, etc.). El confino del cuadro de búsqueda permite orientar únicamente las regiones accesibles de la proteína viral y descarta cualquier interacción poco realista. El acoplamiento molecular depende de estructuras cristalizadas, pero los recientes avances en el modelado homología han permitido el análisis de estructuras no cristalizadas al colocar su secuencia de aminoácidos en una estructura cristalizada estrechamente relacionada15. Esto ha permitido analizar más estructuras y la información adquirida puede ser útil para estudios adicionales, incluidos análisis mutacionales que pueden ayudar a validar las interacciones pronosticadas.
En conclusión, los ensayos y protocolos descritos en este informe están específicamente atendidos para identificar los agentes antivirales candidatos que se dirigen a la entrada viral, y proporcionar información sobre a qué paso del proceso de entrada viral se dirige el agente de prueba, ya sea que interactuar con partículas de virus libres, y la predicción de posibles sitios de interacción de drogas en los viriones. Estos tipos de ensayos pueden repetirse en otros virus no envueltos o adaptarse a los virus envueltos como método de detección de compuestos antivirales para detectar posibles inhibidores de la entrada viral. El uso de este enfoque basado en mecanismos para identificar candidatos antivirales podría ayudar a acelerar el proceso de desarrollo de fármacos y ampliar el alcance de las terapias antivirales.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.
Acknowledgments
Los autores están agradecidos al Dr. Joshua Beckham de la Universidad de Texas en Austin por el apoyo técnico con acoplamiento molecular. Este estudio fue apoyado en parte por la financiación del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MOST107-2320-B-037-002 a C.-J.L. y L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 y MOST107-2320-B-038-034-MY3 a L.-T.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma | AL-158127-500G | |
| Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Anti-VP1 antibody | Merck-Millipore | MAB979 | Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D |
| Beckman Coulter Cytometer | Beckman Coulter | FC500 | |
| Corina | Molecular Networks GmbH | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| Methylcellulose | Sigma | M0512-100G | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| PyMol | Schrödinger | ||
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco |
References
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