Summary

Murin Appendectomy modell av kronisk kolit associerad kolorektal cancer genom exakt lokalisering av Caecal patch

Published: August 24, 2019
doi:

Summary

Det presenterade protokollet beskriver en facile kirurgiskt avlägsnande av appendix (caecal patch) i en mus följt av induktion av inflammatorisk tarmsjukdom-associerad kolorektal cancer. Denna murina blindtarmsoperation modell möjliggör utredning av den biologiska roll Appendix i patogenesen av mänskliga gastrointestinala sjukdomar.

Abstract

Den mänskliga Appendix har nyligen varit inblandad i att spela viktiga biologiska roller i patogenesen av olika komplexa sjukdomar, såsom kolorektal cancer, inflammatorisk tarmsjukdom, och Parkinsons sjukdom. För att studera funktionen av tillägget, en Gut sjukdomsassocierade murin blindtarmsoperation modell har upprättats och dess steg-för-steg-protokollet beskrivs här. Denna rapport introducerar ett facile protokoll för fall patch avlägsnande hos möss följt av kemisk induktion av kronisk kolit-associerad kolorektal cancer med en kombination av dextransulfat natrium (DSS) och azoxymethane (AOM). Iga-specifika celler och iga-koncentrationen reducerades signifikant vid avlägsnande av fall-plåstret hos manliga C57BL/6-möss jämfört med de i Sham-gruppen. Samtidig administrering 2% DSS och AOM resulterade i nästan 80% möss överlevnad i både bluff och blindtarmsoperation grupper utan signifikant viktminskning. Histologiska resultat bekräftade kolon inflammation och olika grader av adenocarcinom. Denna modell kan användas för studiet av den funktionella roll i appendix för att upprätthålla Gut bakterieflora homeostas och patogenesen av Gut kolit och maligniteter, samt för den potentiella utvecklingen av läkemedel inriktning terapier.

Introduction

Den kliniska blindtarmsoperation är en standard kirurgiska ingrepp som innebär avlägsnande av Appendix främst på grund av inflammation (t. ex. appendicit)1,2,3. Men den biologiska funktionen av MASKFORMIG mänskliga Appendix förblir kontroversiell4,5,6. Tillägget har betraktats som en rudimentär rest projicering från blindtarmen i tjocktarmen. Fram till nyligen har evolutionära, immunologiska, morfologiska och mikrobiologiska studier antytt att tillägget kan ha distinkta funktioner. Dessa roller inkluderar produktion av immunoglobins (t. ex., IgA och IgG), en mängd B-celler och T-celler kritiska för adaptiva immunsvar inom tarmen-associerade lymfoida vävnader (galtar), och påfyllning av tjocktarmen med kommensaler microbiotas 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , elva , 12.

Kliniska epidemiologiska studier av patienter med tidigare blindtarmsoperation eller akut blindtarm har också avslöjat dess potentiella roller i patogenesen av mänskliga sjukdomar, såsom inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), kolorektal cancer, och icke-gastrointestinala sjukdomar (t. ex. Parkinsons sjukdom och kardiovaskulär sjukdom)13,14,15,16,17,18. Till exempel visade en stor asiatisk populationskohortstudie med 75 979 patienter med blindtarmsoperation nyligen ett signifikant samband mellan blindtarmsoperation och efterföljande utveckling av kolorektal cancer, en av de vanligaste maligniteter med hög incidens och dödlighet14,19. Följaktligen, upprättande av en lämplig djur blindtarmsoperation modell som liknar en människa kommer att vara till hjälp för att undersöka de biologiska funktioner och molekylära mekanismer i appendix i sjukdomens patogenes.

Många däggdjur har ett appendix-eller Appendix-liknande organ, inklusive primater, hardjur (e.g., kaniner), några gnagare och pungdjur20. För små och vanligen använda försöksdjur, har kaninen den vermiforma Appendix morfologiskt liknar den mänskliga21,22, men galt i kaninen är extremt stor jämfört med det hos människor, eftersom majoriteten av lymfoida vävnader finns också i Peyer ‘ s patchar ligger i både små och stora tarmarna21. Dessutom, kanin visar en annan lymfoida follikulär struktur, T cell distribution, och immunglobulin densitet från den mänskliga, vilket gör att studera deras bilagor olämplig21.

Möss är den mest använda djur modellen för att studera mänsklig patofysiologi och testa de olika befintliga och nya therapuetics23,24,25. Den enda vita stora lymfoida kluster vid spetsen av blindtarmen i möss, känd som fall patch, tros utföra funktioner som liknar den mänskliga Appendix26,27,28. Ändå, det är praktiskt taget svårt att separera fall plåstret från blindtarmen hos möss. Hittills, de gemensamma kirurgiska ingrepp för att inducera blindtarmsinflammation i en musmodell innebär ett relativt stort snitt (t. ex., 1-2 cm) genom bukväggen för att få tillgång till hela blindtarmen (kompletterande tabell 1)29, 30,31,32,33,34,35,36.

Häri, att generera en blindtarmsoperation modell i samband med gastrointestinal sjukdom, denna rapport presenterar en facile kirurgiska protokoll för fall patch avlägsnande hos möss. Detta följs av kombinerad administrering av genotoxiska medel AOM och pro-inflammatorisk agent DSS för induktion av kolit-associerad kolorektal cancer liknande den som setts hos människor. IBD har visats vara en riskfaktor för tarmcancer37,38. Kombinationen av AOM/DSS-inducerad kronisk kolit-associerad kolorektal cancer har varit väl etablerad, och läsarna kan hänvisa till Neufert et al., och Thaker et al. för detaljerade förfaranden39,40. Denna reproducerbara och snabba murina blindtarmsoperation modell kan användas för att studera Appendix-modulerad tarminflammation och kolon bakterieflora, särskilt i utvecklingen och utvecklingen av IBD och kolorektal cancer.

Protocol

Alla djur förfaranden godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén för XI ‘ an Jiaotong University (No. XJTULAC2019-1023). 1. möss blindtarmsoperation Hus 8 – 10-veckors C57BL/6 manliga möss i en certifierad specifik-pathogen Free (SPF) miljö för 1 vecka före operationen. Förbered följande sterila kirurgiska instrument: ett par mikro-sax, ett par mikro-forceps, två storlekar (4-0 och 8-0) av steriliserade icke-absorberbara suturer, en …

Representative Results

Inrättande av murin blindtarmsoperation modell Denna murina blindtarmsoperation modell av kronisk kolit associerad kolorektal cancer kan genereras genom att följa de sekventiella kirurgiska och induktion steg som illustreras i figur 1. De vanligaste positionerna för blindtarmen är i vänster och höger iliaca fossa följt av mittlinjen i buken (figur 2). Den framgångsrika graden av pre-lokalisering av blindtarmen…

Discussion

En murin blindtarmsoperation modell av kolit-associerad kolorektal cancer erhölls med hjälp av kirurgiska steg med en hög överlevnad hos möss. I de flesta fall, eftersom blindtarmen var placerad under bukväggen (kompletterande tabell 1, kompletterande tabell 2, och figur 2), var det svårt att föregripa sitt läge utan laparotomy. I detta kirurgiska protokoll, ett enkelt steg att röra knölen infördes, och kvantitativ utvärdering av blindtarmen platsen tillhandahö…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds delvis av grundläggande forskningsmedel för Central University (G2018KY0302), University grund forsknings utvecklingsfonden (KT00062), National Natural Science Foundation i Kina (81870380), och klinisk forskning Award of the Första anslutna sjukhuset XI ‘ an Jiaotong University i Kina (NO. XJTU1AF-CRF-2015-029). Författarna tackar Dr Chengxin Shi för hans tekniska förslag under den tidiga prospekteringsfasen av murina blindtarmsoperation modell, liksom patologen Dr XI LiU för utvärdering av H & E färgning resultat av kolit och kolorektal tumörer. Y.L. utförde operationen demonstration, gjorde dataanalys, och skrev utkastet till manuskriptet; J.L., G.L., Z.P. och Y.M. har deltagit i kirurgiska förberedelser, vävnads kollektioner och videoproduktion; Z. utförde flödescytometri och ELISA; Q.W. och H.X. tillhandahöll teknisk support för att generera en kliniskt relevant murinmodell; R.X.Z. ritade studien, övervakade forskningen och skrev och korrektade manuskriptet; JS granskade manuskriptet.

Materials

Azoxymethane(AOM Sigma-Aldrich,Inc. A5486
Dextran Sulfate Sodium Salt(DSS MP Biomedicals,Inc. 160110
Entoiodine Shanghai likon high technology disinfection co. LTD 310102
digital caliper Ningbo yuanneng trading co. LTD 4859263
4-0 Silk Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
8-0 Prolene Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
Electric coagulation pen Chuang mei medical equipment co. LTD 28221777292
disposable syringe 1ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
disposable syringe 10ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
75% Medicinal alcohol Shandong anjie high-tech disinfection technology co. LTD 371402AAJ008
Pentobarbital sodium salt Sigma-Aldrich,Inc. 57-33-0
Physiological Saline Shandong qidu pharmaceutical co. LTD H37020766
Absorbent Cotton Swab Henan ruike medical co., LTD RK051
Surgical Instruments-Ophthalmic Jinzhong Shanghai co.LTD WA3050

References

  1. Leung, T. T., et al. Bowel obstruction following appendectomy: what is the true incidence. of Surgery. 250 (1), 51-53 (2009).
  2. Salminen, P., et al. Antibiotic Therapy vs. Appendectomy for Treatment of Uncomplicated Acute Appendicitis: The APPAC Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 313 (23), 2340-2348 (2015).
  3. Mayo Clinic. . Appendicitis. , (2019).
  4. . On the Appendix Vermiformis and the Evolution Hypothesis. Nature. 8, 509 (1873).
  5. Zahid, A. The vermiform appendix: not a useless organ. Journal of College of Physicians and Surgeons Pakistan. 14 (4), 256-258 (2004).
  6. Kooij, I. A., Sahami, S., Meijer, S. L., Buskens, C. J., Te Velde, ., A, A. The immunology of the vermiform appendix: a review of the literature. Clinical and Experimental Immunology. 186 (1), 1-9 (2016).
  7. Sarkar, A., Saha, A., Roy, S., Pathak, S., Mandal, S. A glimpse towards the vestigiality and fate of human vermiform appendix-a histomorphometric study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 9 (2), 11 (2015).
  8. Fujihashi, K., et al. Human Appendix B-Cells Naturally Express Receptors for and Respond to. Interleukin-6 with Selective Iga1 and Iga2 Synthesis. Journal of Clinical Investigations. 88 (1), 248-252 (1991).
  9. Im, G. Y., et al. The appendix may protect against Clostridium difficile recurrence. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9 (12), 1072-1077 (2011).
  10. Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Bacterial translocation in the normal human appendix parallels the development of the local immune system. Annal of the New York Academy of Sciences. , 337-343 (2004).
  11. Randal Bollinger, ., Barbas, R., S, A., Bush, E. L., Lin, S. S., Parker, W. Biofilms in the large bowel suggest an apparent function of the human vermiform appendix. Journal of Theoretical Biology. 249 (4), 826-831 (2007).
  12. Smith, H., Parker, W., Kotzé, H., Laurin, S., M, Morphological evolution of the mammalian cecum and cecal appendix: Évolution morphologique de l’appendice du caecum des mammifères. Comptes Rendus Palevol. 16, (2017).
  13. Girard-Madoux, M. J. H., et al. The immunological functions of the Appendix: An example of redundancy. in Immunology. 36, 31-44 (2018).
  14. Wu, S. C., et al. Association between appendectomy and subsequent colorectal cancer development: an Asian population study. PLoS ONE. 10 (2), e0118411 (2015).
  15. Florin, T. H., Pandeya, N., Radford-Smith, G. L. Epidemiology of appendicectomy in primary sclerosing cholangitis and ulcerative colitis: its influence on the clinical behaviour of these diseases. Gut. 53 (7), 973-979 (2004).
  16. Arnbjornsson, E. Acute appendicitis as a sign of a colorectal carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 17-20 (1982).
  17. Killinger, B. A., et al. The vermiform appendix impacts the risk of developing Parkinson’s disease. Science Translatioanl Medicine. 10 (465), (2018).
  18. Chen, C. H., et al. Appendectomy increased the risk of ischemic heart disease. Journal of Surgical Research. 199 (2), 435-440 (2015).
  19. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  20. Smith, H. F., Parker, W., Kotze, S. H., Laurin, M. Multiple independent appearances of the cecal appendix in mammalian evolution and an investigation of related ecological and anatomical factors. Comptes Rendus Palevol. 12 (6), 339-354 (2013).
  21. Dasso, J. F., Obiakor, H., Bach, H., Anderson, A. O., Mage, R. G. A morphological and immunohistological study of the human and rabbit appendix for comparison with the avian bursa. Developmental and Comparative Immunology. 24 (8), 797-814 (2000).
  22. Smith, H. F., et al. Comparative anatomy and phylogenetic distribution of the mammalian cecal appendix. Journal of Evolutionary Biology. 22 (10), 1984-1999 (2009).
  23. Vandamme, T. F. Rodent models for human diseases. European Journal of Pharmacology. 759, 84-89 (2015).
  24. Prabhakar, S. Translational research challenges: finding the right animal models. Journal of Investigative Medicine. 60 (8), 1141-1146 (2012).
  25. Hosur, V., Low, B. E., Avery, C., Shultz, L. D., Wiles, M. V. Development of Humanized Mice in the Age of Genome Editing. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (10), 3043-3048 (2017).
  26. Mizoguchi, A., Mizoguchi, E., Chiba, C., Bhan, A. K. Role of appendix in the development of inflammatory bowel disease in TCR-alpha mutant mice. Journal of Experimental Medicine. 184 (2), 707-715 (1996).
  27. Farkas, S. A., et al. Preferential migration of CD62L cells into the appendix in mice with experimental chronic colitis. European Surgical Research. 37 (2), 115-122 (2005).
  28. Morrison, P. J., et al. Differential Requirements for IL-17A and IL-22 in Cecal versus Colonic Inflammation Induced by Helicobacter hepaticus. American Journal of Pathology. 185 (12), 3290-3303 (2015).
  29. Tomiyasu, N., et al. Appendectomy suppresses intestinal inflammation in a murine model of DSS-induced colitis through modulation of mucosal immune systems. Gastroenterology. 118 (4), A863-A863 (2000).
  30. Krieglstein, C. F., et al. Role of appendix and spleen in experimental colitis. Journal of Surgical Research. 101 (2), 166-175 (2001).
  31. Cheluvappa, R., Luo, A. S., Palmer, C., Grimm, M. C. Protective pathways against colitis mediated by appendicitis and appendectomy. Clinical and Experimental Immunology. 165 (3), 393-400 (2011).
  32. Cheluvappa, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. T helper type 17 pathway suppression by appendicitis and appendectomy protects against colitis. Clinical and Experimental Immunology. 175 (2), 316-322 (2014).
  33. Masahata, K., et al. Generation of colonic IgA-secreting cells in the caecal patch. Nature Communications. 5, (2014).
  34. Cheluvappa, R. A novel model of appendicitis and appendectomy to investigate inflammatory bowel disease pathogenesis and remediation. Biological Procedures Online. 16, (2014).
  35. Cheluvappa, R., Eri, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. Modulation of interferon activity-associated soluble molecules by appendicitis and appendectomy limits colitis-identification of novel anti-colitic targets. Journal of Interferon and Cytokine Research. 35 (2), 108-115 (2015).
  36. Harnoy, Y., et al. Effect of appendicectomy on colonic inflammation and neoplasia in experimental ulcerative colitis. British Journal of Surgery. 103 (11), 1530-1538 (2016).
  37. Aaron, E., Walfish, R. A. C. C. . Ulcerative Colitis. , (2017).
  38. Laukoetter, M. G., et al. Intestinal cancer risk in Crohn’s disease: a meta-analysis. Journal of Gastrointestestinal Surgery. 15 (4), 576-583 (2011).
  39. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature Protocols. 2 (8), 1998-2004 (2007).
  40. Thaker, A. I., Shaker, A., Rao, M. S., Ciorba, M. A. Modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (AOM) and dextran sulfate sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. 10 (67), (2012).
  41. Perides, G., van Acker, G. J. D., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
  42. Schofield, W. B., Palm, N. W. Gut Microbiota: IgA Protects the Pioneers. Current Biology. 28 (18), R1117-R1119 (2018).
  43. Karthikeyan, V. S., et al. Carcinoma Cecum Presenting as Right Gluteal Abscess Through Inferior Lumbar Triangle Pathway-Report of a Rare Case. International Surgery. 99 (4), 371-373 (2014).
  44. Ruscelli, P., et al. Clinical signs of retroperitoneal abscess from colonic perforation Two case reports and literature review. Medicine (Baltimore). 97 (45), (2018).
  45. Friedman, G. D., Fireman, B. H. Appendectomy, appendicitis, and large bowel cancer). Cancer Research. 50 (23), 7549-7551 (1990).
  46. Stellingwerf, M. E., et al. The risk of colectomy and colorectal cancer after appendectomy in patients with ulcerative colitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Crohn’s and Colitis. 13 (3), 309-318 (2018).

Play Video

Cite This Article
Li, Y., Liu, J., Liu, G., Pan, Z., Zhang, M., Ma, Y., Wei, Q., Xia, H., Zhang, R. X., She, J. Murine Appendectomy Model of Chronic Colitis Associated Colorectal Cancer by Precise Localization of Caecal Patch. J. Vis. Exp. (150), e59921, doi:10.3791/59921 (2019).

View Video