JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Medicine

Murine appendectomy model af kronisk colitis associeret kolorektal cancer ved præcis lokalisering af Caecal patch

Published: August 24, 2019
doi:
10.3791/59921
, , , , , , , , ,
1Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital,Xi’an Jiaotong University, 2Institute of Medical Research,Northwestern Polytechnical University, 3School of Life Sciences,Northwestern Polytechnical University, 4Department of Medicine,Xi’an Jiaotong University, 5Princess Margaret Cancer Center,University of Health Network, 6Department of Pathology,Nanjing Medical University

Summary

Den præsenterede protokol beskriver en facile kirurgisk fjernelse af tillægget (caecal patch) i en mus efterfulgt af induktion af inflammatorisk tarmsygdom-associeret kolorektal cancer. Denne murine appendectomy model muliggør undersøgelse af den biologiske rolle af tillægget i patogenesen af menneskelig gastrointestinal sygdom.

Abstract

Den menneskelige tillægget er for nylig blevet impliceret til at spille vigtige biologiske roller i patogenesen af forskellige komplekse sygdomme, såsom kolorektal cancer, inflammatorisk tarmsygdom, og Parkinsons sygdom. For at studere funktionen af tillægget, en Gut sygdom-associeret murine appendectomy model er blevet etableret og dens trin-for-trin protokol er beskrevet her. Denne rapport introducerer en facile protokol for caecalis relativt patch fjernelse i mus efterfulgt af den kemiske induktion af kronisk colitis-associeret kolorektal cancer ved hjælp af en kombination af dextran sulfat natrium (DSS) og azoxymethane (AOM). IgA-specifikke celler og IgA-koncentration blev signifikant reduceret ved fjernelse af caecalis relativt-plasteret i mandlige C57BL/6-mus sammenlignet med dem i Sham-gruppen. Samtidig administration af 2% DSS og AOM resulterede i næsten 80% mus overlevelse i både Sham og appendectomy grupper uden signifikant legemsvægt tab. Histologiske resultater bekræftet Colon inflammation og forskellige grader af adenocarcinoma. Denne model kan anvendes til undersøgelse af den funktionelle rolle af tillægget i opretholdelsen af Gut mikrobiota homøostase og patogenese af tarm colitis og maligniteter, samt for den potentielle udvikling af Drug målretning behandlingsformer.

Introduction

Den kliniske appendectomy er en standard kirurgisk procedure, der involverer fjernelse af tillægget hovedsagelig på grund af betændelse (f. eks, blindtarmsbetændelse)1,2,3. Men den biologiske funktion af vermiform menneskelige appendiks forbliver kontroversiel4,5,6. Tillægget er blevet betragtet som en vestigial rest projicering fra cecum i tyktarmen. Indtil for nylig har evolutionære, immunologiske, morfologiske og mikrobiologiske undersøgelser antydet, at tillægget kan have særskilte funktioner. Disse roller omfatter produktion af immunoglobiner (f. eks. IgA og IgG), en række B-celler og T-celler, der er kritiske for adaptive immunresponser inden for tarm-associerede lymfoide væv (Galts), og genopfyldning af tyktarmen med kommensal mikrobiotas 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12.

Kliniske epidemiologiske undersøgelser af patienter med tidligere appendectomy eller akut blindtarmsbetændelse har også afsløret dets potentielle roller i patogenesen af sygdomme hos mennesker, såsom inflammatorisk tarmsygdom (IBD), kolorektal cancer og ikke-gastrointestinale sygdomme (f. eks. Parkinsons sygdom og Kardiovaskulær sygdom)13,14,15,16,17,18. For eksempel, en stor asiatisk population kohorteundersøgelse med 75.979 appendectomy patienter for nylig viste en signifikant sammenslutning mellem appendectomy og efterfølgende udvikling af kolorektal cancer, en af de mest almindelige maligniteter med en høj incidens og dødelighed14,19. Derfor, etablering af et egnet dyr appendectomy model, der ligner et menneske vil være nyttigt at undersøge de biologiske funktioner og molekylære mekanismer i tillægget i sygdoms patogenesen.

Mange pattedyr besidder et appendiks eller et appendiks lignende organ, herunder primater, lagomorfer (f. eks. kaniner), nogle gnavere og pungdyr20. For små og almindeligt anvendte forsøgsdyr, kaninen besidder vermiform appendiks morfologisk ligner den menneskelige21,22, men galt i kanin er ekstremt stor i forhold til, at i mennesker, da de fleste af lymfoide væv findes også i Peyers patches placeret i både små og store tarme21. Desuden kanin viser en anden lymfoide follikulært struktur, T celle fordeling, og immunglobulin tæthed fra det menneskelige, hvilket gør studiet af deres tillæg upassende21.

Mus er den mest almindeligt anvendte dyremodel til at studere menneskelig Patofysiologi og teste de forskellige eksisterende og nye terapeuuetics23,24,25. Den enkelt hvide store lymfoide klynge i spidsen af coecum i mus, kendt som caecalis relativt patch, menes at udføre funktioner svarende til den menneskelige tillæg26,27,28. Alligevel er det praktisk talt vanskeligt at adskille caecalis relativt patch fra coecum i mus. Hidtil, de fælles kirurgiske procedurer for inducerende blindtarmsbetændelse i en musemodel indebærer et relativt stort snit (f. eks, 1 – 2 cm) gennem bugvæggen for at få adgang til hele coecum (supplerende tabel 1)29, 30,31,32,33,34,35,36.

Heri, at generere en appendectomy model forbundet med gastrointestinal sygdom, denne rapport præsenterer en facile kirurgisk protokol til caecalis relativt patch fjernelse i mus. Dette efterfølges af den kombinerede administration af det genotoksiske middel AOM og pro-inflammatoriske agent DSS for induktion af colitis-associeret kolorektal cancer svarende til den, der ses hos mennesker. IBD har vist sig at være en risikofaktor for tarmkræft37,38. Kombinationen af AOM/DSS-induceret kronisk colitis associeret kolorektal cancer har været veletableret, og læsere kan henvise til neufert et al., og Thaker et al. for detaljerede procedurer39,40. Denne reproducerbare og hurtig murine appendectomy model kan bruges til at studere appendiks-moduleret tarmbetændelse og tyktarms mikrobiota, især i udviklingen og progression af IBD og kolorektal cancer.

Protocol

Alle dyr procedurer blev godkendt af den institutionelle Animal Care og brug udvalg af Xi’an Jiaotong University (nr. XJTULAC2019-1023). 1. mus appendectomy House 8 – 10 uger gamle C57BL/6 hanmus i et certificeret specifikt patogen frit (SPF) miljø i 1 uge før operationen. Forbered følgende sterile kirurgiske instrumenter: et par mikro-saks, et par mikro-pincet, to størrelser (4-0 og 8-0) af steriliserede ikke-absorberbare suturer, en elektrisk koagulations kuglepen m…

Representative Results

Etablering af murine appendectomy model Denne murine appendectomy model af kronisk colitis associeret kolorektal cancer kan genereres ved at følge de sekventielle kirurgiske og induktions trin som illustreret i figur 1. De hyppigste positioner af coecum er i venstre og højre bækkenbens fossa efterfulgt af den midterste linje af maven (figur 2). Den vellykkede hastighed af præ-lokalisering af coecum forud for maven…

Discussion

En murine appendectomy model af colitis-associeret kolorektal cancer blev opnået ved hjælp af kirurgiske trin med en høj overlevelsesrate i mus. I de fleste tilfælde, da coecum var placeret under bugvæggen (supplerende tabel 1, supplerende tabel 2, og figur 2), var det vanskeligt at foregribe dets placering uden laparotomi. I denne kirurgiske protokol blev der indført et let trin med berøring af bump, og den kvantitative evaluering af cecum-placeringen blev også give…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde er delvist understøttet af grundlæggende forskningsmidler til central University (G2018KY0302), University grundlæggende forskning Udviklingsfond (KT00062), National Natural Science Foundation i Kina (81870380), og klinisk forskning tildeling af Første tilknyttet Hospital i Xi’an Jiaotong University i Kina (nr. XJTU1AF-CRF-2015-029). Forfatterne takke Dr. Chengxin Shi for hans tekniske forslag i den tidlige udforskning fase af murine appendectomy model, samt patolog Dr. XI Liu for evaluering af H & E farvning resultater af colitis og kolorektal tumorer. Y.L. udførte kirurgi demonstration, gjorde dataanalyse, og skrev udkastet til manuskriptet; J.L., G.L., Z.P. og Y.M. deltog i den kirurgiske forberedelse, vævs samlinger og video produktion; M.Z. udførte flowcytometri og ELISA; Q.W. og H.X. leverede teknisk støtte til at generere en klinisk relevant murine model; R.X.Z. designede studiet, overvågede forskningen og skrev og sikrede manuskriptet; J.S. gennemgik manuskriptet.

Materials

Azoxymethane（AOM Sigma-Aldrich,Inc. A5486
Dextran Sulfate Sodium Salt（DSS MP Biomedicals,Inc. 160110
Entoiodine Shanghai likon high technology disinfection co. LTD 310102
digital caliper Ningbo yuanneng trading co. LTD 4859263
4-0 Silk Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
8-0 Prolene Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
Electric coagulation pen Chuang mei medical equipment co. LTD 28221777292
disposable syringe 1ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
disposable syringe 10ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
75% Medicinal alcohol Shandong anjie high-tech disinfection technology co. LTD 371402AAJ008
Pentobarbital sodium salt Sigma-Aldrich,Inc. 57-33-0
Physiological Saline Shandong qidu pharmaceutical co. LTD H37020766
Absorbent Cotton Swab Henan ruike medical co., LTD RK051
Surgical Instruments-Ophthalmic Jinzhong Shanghai co.LTD WA3050
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leung, T. T., et al. Bowel obstruction following appendectomy: what is the true incidence. of Surgery. 250 (1), 51-53 (2009).
  2. Salminen, P., et al. Antibiotic Therapy vs. Appendectomy for Treatment of Uncomplicated Acute Appendicitis: The APPAC Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 313 (23), 2340-2348 (2015).
  3. Mayo Clinic. . Appendicitis. , (2019).
  4. . On the Appendix Vermiformis and the Evolution Hypothesis. Nature. 8, 509 (1873).
  5. Zahid, A. The vermiform appendix: not a useless organ. Journal of College of Physicians and Surgeons Pakistan. 14 (4), 256-258 (2004).
  6. Kooij, I. A., Sahami, S., Meijer, S. L., Buskens, C. J., Te Velde, ., A, A. The immunology of the vermiform appendix: a review of the literature. Clinical and Experimental Immunology. 186 (1), 1-9 (2016).
  7. Sarkar, A., Saha, A., Roy, S., Pathak, S., Mandal, S. A glimpse towards the vestigiality and fate of human vermiform appendix-a histomorphometric study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 9 (2), 11 (2015).
  8. Fujihashi, K., et al. Human Appendix B-Cells Naturally Express Receptors for and Respond to. Interleukin-6 with Selective Iga1 and Iga2 Synthesis. Journal of Clinical Investigations. 88 (1), 248-252 (1991).
  9. Im, G. Y., et al. The appendix may protect against Clostridium difficile recurrence. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9 (12), 1072-1077 (2011).
  10. Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Bacterial translocation in the normal human appendix parallels the development of the local immune system. Annal of the New York Academy of Sciences. , 337-343 (2004).
  11. Randal Bollinger, ., Barbas, R., S, A., Bush, E. L., Lin, S. S., Parker, W. Biofilms in the large bowel suggest an apparent function of the human vermiform appendix. Journal of Theoretical Biology. 249 (4), 826-831 (2007).
  12. Smith, H., Parker, W., Kotzé, H., Laurin, S., M, Morphological evolution of the mammalian cecum and cecal appendix: Évolution morphologique de l’appendice du caecum des mammifères. Comptes Rendus Palevol. 16, (2017).
  13. Girard-Madoux, M. J. H., et al. The immunological functions of the Appendix: An example of redundancy. in Immunology. 36, 31-44 (2018).
  14. Wu, S. C., et al. Association between appendectomy and subsequent colorectal cancer development: an Asian population study. PLoS ONE. 10 (2), e0118411 (2015).
  15. Florin, T. H., Pandeya, N., Radford-Smith, G. L. Epidemiology of appendicectomy in primary sclerosing cholangitis and ulcerative colitis: its influence on the clinical behaviour of these diseases. Gut. 53 (7), 973-979 (2004).
  16. Arnbjornsson, E. Acute appendicitis as a sign of a colorectal carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 17-20 (1982).
  17. Killinger, B. A., et al. The vermiform appendix impacts the risk of developing Parkinson’s disease. Science Translatioanl Medicine. 10 (465), (2018).
  18. Chen, C. H., et al. Appendectomy increased the risk of ischemic heart disease. Journal of Surgical Research. 199 (2), 435-440 (2015).
  19. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  20. Smith, H. F., Parker, W., Kotze, S. H., Laurin, M. Multiple independent appearances of the cecal appendix in mammalian evolution and an investigation of related ecological and anatomical factors. Comptes Rendus Palevol. 12 (6), 339-354 (2013).
  21. Dasso, J. F., Obiakor, H., Bach, H., Anderson, A. O., Mage, R. G. A morphological and immunohistological study of the human and rabbit appendix for comparison with the avian bursa. Developmental and Comparative Immunology. 24 (8), 797-814 (2000).
  22. Smith, H. F., et al. Comparative anatomy and phylogenetic distribution of the mammalian cecal appendix. Journal of Evolutionary Biology. 22 (10), 1984-1999 (2009).
  23. Vandamme, T. F. Rodent models for human diseases. European Journal of Pharmacology. 759, 84-89 (2015).
  24. Prabhakar, S. Translational research challenges: finding the right animal models. Journal of Investigative Medicine. 60 (8), 1141-1146 (2012).
  25. Hosur, V., Low, B. E., Avery, C., Shultz, L. D., Wiles, M. V. Development of Humanized Mice in the Age of Genome Editing. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (10), 3043-3048 (2017).
  26. Mizoguchi, A., Mizoguchi, E., Chiba, C., Bhan, A. K. Role of appendix in the development of inflammatory bowel disease in TCR-alpha mutant mice. Journal of Experimental Medicine. 184 (2), 707-715 (1996).
  27. Farkas, S. A., et al. Preferential migration of CD62L cells into the appendix in mice with experimental chronic colitis. European Surgical Research. 37 (2), 115-122 (2005).
  28. Morrison, P. J., et al. Differential Requirements for IL-17A and IL-22 in Cecal versus Colonic Inflammation Induced by Helicobacter hepaticus. American Journal of Pathology. 185 (12), 3290-3303 (2015).
  29. Tomiyasu, N., et al. Appendectomy suppresses intestinal inflammation in a murine model of DSS-induced colitis through modulation of mucosal immune systems. Gastroenterology. 118 (4), A863-A863 (2000).
  30. Krieglstein, C. F., et al. Role of appendix and spleen in experimental colitis. Journal of Surgical Research. 101 (2), 166-175 (2001).
  31. Cheluvappa, R., Luo, A. S., Palmer, C., Grimm, M. C. Protective pathways against colitis mediated by appendicitis and appendectomy. Clinical and Experimental Immunology. 165 (3), 393-400 (2011).
  32. Cheluvappa, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. T helper type 17 pathway suppression by appendicitis and appendectomy protects against colitis. Clinical and Experimental Immunology. 175 (2), 316-322 (2014).
  33. Masahata, K., et al. Generation of colonic IgA-secreting cells in the caecal patch. Nature Communications. 5, (2014).
  34. Cheluvappa, R. A novel model of appendicitis and appendectomy to investigate inflammatory bowel disease pathogenesis and remediation. Biological Procedures Online. 16, (2014).
  35. Cheluvappa, R., Eri, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. Modulation of interferon activity-associated soluble molecules by appendicitis and appendectomy limits colitis-identification of novel anti-colitic targets. Journal of Interferon and Cytokine Research. 35 (2), 108-115 (2015).
  36. Harnoy, Y., et al. Effect of appendicectomy on colonic inflammation and neoplasia in experimental ulcerative colitis. British Journal of Surgery. 103 (11), 1530-1538 (2016).
  37. Aaron, E., Walfish, R. A. C. C. . Ulcerative Colitis. , (2017).
  38. Laukoetter, M. G., et al. Intestinal cancer risk in Crohn’s disease: a meta-analysis. Journal of Gastrointestestinal Surgery. 15 (4), 576-583 (2011).
  39. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature Protocols. 2 (8), 1998-2004 (2007).
  40. Thaker, A. I., Shaker, A., Rao, M. S., Ciorba, M. A. Modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (AOM) and dextran sulfate sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. 10 (67), (2012).
  41. Perides, G., van Acker, G. J. D., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
  42. Schofield, W. B., Palm, N. W. Gut Microbiota: IgA Protects the Pioneers. Current Biology. 28 (18), R1117-R1119 (2018).
  43. Karthikeyan, V. S., et al. Carcinoma Cecum Presenting as Right Gluteal Abscess Through Inferior Lumbar Triangle Pathway-Report of a Rare Case. International Surgery. 99 (4), 371-373 (2014).
  44. Ruscelli, P., et al. Clinical signs of retroperitoneal abscess from colonic perforation Two case reports and literature review. Medicine (Baltimore). 97 (45), (2018).
  45. Friedman, G. D., Fireman, B. H. Appendectomy, appendicitis, and large bowel cancer). Cancer Research. 50 (23), 7549-7551 (1990).
  46. Stellingwerf, M. E., et al. The risk of colectomy and colorectal cancer after appendectomy in patients with ulcerative colitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Crohn’s and Colitis. 13 (3), 309-318 (2018).

Tags

Murine AppendectomyCaecal PatchChronic ColitisColorectal CancerGastrointestinal DiseaseAppendix FunctionSurgical ProcedureMouse ModelCaecumAbdomen IncisionMesenteric Blood VesselsCaecal StumpSuture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Li, Y., Liu, J., Liu, G., Pan, Z., Zhang, M., Ma, Y., Wei, Q., Xia, H., Zhang, R. X., She, J. Murine Appendectomy Model of Chronic Colitis Associated Colorectal Cancer by Precise Localization of Caecal Patch. J. Vis. Exp. (150), e59921, doi:10.3791/59921 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image