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Medicine

Murine Appendektomie Modell der chronischen Colitis assoziiert entaktischen Darmkrebs durch präzise Lokalisierung von Caecal Patch

Published: August 24, 2019
doi:
10.3791/59921
, , , , , , , , ,
1Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital,Xi’an Jiaotong University, 2Institute of Medical Research,Northwestern Polytechnical University, 3School of Life Sciences,Northwestern Polytechnical University, 4Department of Medicine,Xi’an Jiaotong University, 5Princess Margaret Cancer Center,University of Health Network, 6Department of Pathology,Nanjing Medical University

Summary

Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine einfache chirurgische Entfernung des Blinddarms (Kaecal-Patch) in einer Maus, gefolgt von der Induktion von entzündlichem Darmerkrankungen-assoziiertem Dickdarmkrebs. Dieses murine Appendektomie-Modell ermöglicht die Untersuchung der biologischen Rolle des Blinddarms bei der Pathogenese der menschlichen Magen-Darm-Krankheit.

Abstract

Der menschliche Blinddarm wurde vor kurzem involviert, um wichtige biologische Rollen bei der Pathogenese verschiedener komplexer Krankheiten wie Dickdarmkrebs, entzündliche Darmerkrankungen und Parkinson zu spielen. Um die Funktion des Blinddarms zu untersuchen, wurde ein Darmkrankheits-assoziiertes taurines Appendektomie-Modell etabliert und sein Schritt-für-Schritt-Protokoll wird hier beschrieben. Dieser Bericht führt ein leichtes Protokoll für die Entfernung von Kaecal-Pflastern bei Mäusen ein, gefolgt von der chemischen Induktion von chronischem Kolitis-assoziiertem Dickdarmkrebs unter Verwendung einer Kombination aus Dextransulfat-Natrium (DSS) und Azoxymethan (AOM). IgA-spezifische Zellen und IgA-Konzentration wurden bei der Entfernung des Kaecal-Patches bei männlichen C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu denen in der Scheingruppe signifikant reduziert. Gleichzeitige Verabreichung von 2% DSS und AOM führte zu fast 80% Mäuseüberleben in Schein- und Appendektomiegruppen ohne signifikanten Gewichtsverlust des Körpers. Histologische Ergebnisse bestätigten eine Darmentzündung und verschiedene Grade des Adenokarzinoms. Dieses Modell kann für die Untersuchung der funktionellen Rolle des Blinddarms bei der Aufrechterhaltung der Darmmikrobiota-Homöostase und Pathogenese von Darmkolitis und Malignitäten sowie für die mögliche Entwicklung von Medikament-Targeting-Therapien verwendet werden.

Introduction

Die klinische Appendektomie ist ein Standard-chirurgisches Verfahren mit Entfernung des Blinddarms vor allem aufgrund von Entzündungen (z.B. Appendizitis)1,2,3. Die biologische Funktion des vermiformen menschlichen Blinddarms bleibt jedoch umstritten4,5,6. Der Blinddarm wurde als vestigialer Überrest betrachtet, der aus dem Cecum im Großdarm projiziert wird. Bis vor kurzem haben evolutionäre, immunologische, morphologische und mikrobiologische Studien darauf hingedeutet, dass der Anhang unterschiedliche Funktionen besitzen kann. Zu diesen Rollen gehören die Produktion von Immunglobinen (z. B. IgA und IgG), eine Vielzahl von B-Zellen und T-Zellen, die für adaptive Immunantworten innerhalb der Darm-assoziierten Lymphgewebe (GALTs) entscheidend sind, und die Auffüllung des Großdarms mit commensalen Mikrobiotas. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12.

Klinische epidemiologische Studien von Patienten mit früherer Appendektomie oder akuter Appendizitis haben auch ihre potenzielle Rolle bei der Pathogenese menschlicher Krankheiten, wie entzündliche Darmerkrankungen (IBD), Dickdarmkrebs und nicht-gastrointestinal Erkrankungen (z.B. Parkinson und Herz-Kreislauf-Erkrankungen)13,14,15,16,17,18. So zeigte eine große asiatische Populationskohortenstudie mit 75.979 Appendektomie-Patienten kürzlich einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Blinddarmkrebs- und Sterblichkeit14,19. Dementsprechend wird die Erstellung eines geeigneten Tier-Appendektomie-Modells, das einem Menschen ähnelt, hilfreich sein, um die biologischen Funktionen und molekularen Mechanismen des Blinddarms in der Krankheitspathogenese zu untersuchen.

Viele Säugetiere besitzen einen Blinddarm oder ein Blinddarm-ähnliches Organ, einschließlich Primaten, Lagomorphen (z.B. Kaninchen), einige Nagetiere und Beuteltiere20. Bei kleinen und häufig verwendeten Labortieren besitzt das Kaninchen den vermiformenen Blinddarm, der dem menschlichen21,22ähnelt, aber GALT beim Kaninchen ist im Vergleich zum Menschen extrem groß, da die Mehrheit der Lymphgewebe finden sich auch in Peyers Pflastern, die sich sowohl im Dünn- als auch im Dickdarm befinden21. Darüber hinaus zeigt das Kaninchen eine andere lymphoide follikelische Struktur, T-Zell-Verteilung, und Immunglobulindichte vom Menschen, die das Studium ihrer Anhänge ungeeignet macht21.

Mäuse sind das am häufigsten verwendete Tiermodell, um die humane Pathophysiologie zu studieren und die verschiedenen bestehenden und neuartigen Therapuetika23,24,25zu testen. Der einzelne weiße große Lymphoidhaufen an der Spitze des Caecums bei Mäusen, bekannt als der Kaecal-Patch, wird angenommen, dass er ähnliche Funktionen wie der menschliche Blinddarm26,27,28ausführt. Dennoch ist es praktisch schwierig, den Kaecal-Patch von Caecum bei Mäusen zu trennen. Bisher beinhalten die üblichen chirurgischen Verfahren zur Induktion von Blinddarmentzündungen in einem Mausmodell einen relativ großen Schnitt (z. B. 1–2 cm) durch die Bauchwand, um Zugang zum gesamten Caecum zu erhalten (Zusatztabelle 1)29, 30,31,32,33,34,35,36.

Hierin, um ein Appendektomie-Modell im Zusammenhang mit Magen-Darm-Erkrankungen zu generieren, stellt dieser Bericht ein leichtes chirurgisches Protokoll für die Entfernung von Kaecal-Pflasterbeiten bei Mäusen vor. Es folgt die kombinierte Verabreichung des genotoxischen Mittels AOM und des proinflammatorischen Mittels DSS zur Induktion von Kolitis-assoziiertem Dickdarmkrebs ähnlich dem beim Menschen. IBD hat sich als Risikofaktor für Darmkrebs37,38gezeigt. Die Kombination von AOM/DSS-induziertem chronischem Kolitis-assoziiertem Dickdarmkrebs ist gut etabliert, und Leser können sich auf Neufert et al. und Thaker et al. für detaillierte Verfahren39,40beziehen. Dieses reproduzierbare und schnelle murine Appendektomie-Modell kann verwendet werden, um Blinddarm-modulierte Darmentzündungen und Dickdarm-Mikrobiota zu studieren, insbesondere bei der Entwicklung und Progression von IBD und Dickdarmkrebs.

Protocol

Alle tierischen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Xi’an Jiaotong University (Nr. XJTULAC2019-1023). 1. Mäuse-Appendektomie Haus 8–10 Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse in einer zertifizierten spezifisch-pathogenfreien (SPF) Umgebung für 1 Woche vor der Operation. Bereiten Sie folgende sterile chirurgische Instrumente vor: ein Paar Mikroschere, ein Paar Mikrozange, zwei Größen (4-0 und 8-0) sterilisierter nicht resorbierbarer Näht…

Representative Results

Etablierung eines murinen Appendektomiemodells Dieses murine Appendektomie-Modell des chronischen Colitis assoziierten Dickdarmkrebses kann durch Befolgen der sequenziellen chirurgischen und Induktionsschritte erzeugt werden, wie in Abbildung 1dargestellt. Die häufigsten Positionen von caecum sind in der linken und rechten iliac fossa gefolgt von der Mittellinie des Bauches (Abbildung 2). Die erfolgreiche Rate der Vo…

Discussion

Ein murines Appendektomie-Modell von Kolitis-assoziiertem Dickdarmkrebs wurde mit chirurgischen Schritten mit einer hohen Überlebensrate bei Mäusen erhalten. In den meisten Fällen war es schwierig, seiner Lage ohne Laparotomie vorzugreifen, da das Caecum unter der Bauchwand positioniert war(Zusatztabelle 1, Zusatztabelle 2und Abbildung 2), da es schwierig war, seiner Lage ohne Laparotomie vorzugreifen. In diesem chirurgischen Protokoll wurde ein einfacher Schritt zur Ber?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird teilweise durch Fundamental Research Funds for the Central University (G2018KY0302), University Fundamental Research Development Fund (KT00062), National Natural Science Foundation of China (81870380) und Clinical Research Award des Erstes angeschlossenes Krankenhaus der Xi’an Jiaotong Universität in China (Nr. XJTU1AF-CRF-2015-029). Die Autoren danken Dr. Chengxin Shi für seine technischen Vorschläge während der frühen Explorationsphase des murinen Appendektomiemodells sowie dem Pathologen Dr. Xi Liu für die Bewertung der H&E-Färbungsergebnisse von Kolitis und kolorektalen Tumoren. Y.L. führte die Operation Demonstration durch, führte Datenanalysen durch und schrieb den Entwurf des Manuskripts; J.L., G.L., Z.P. und Y.M. nahmen an der chirurgischen Vorbereitung, Gewebesammlungen und Videoproduktion teil; M.Z. führte die Durchflusszytometrie und ELISA durch; Q.W. und H.X. leisteten die technische Unterstützung bei der Erzeugung eines klinisch relevanten murinen Modells; R.X.Z. entwarf die Studie, überwachte die Forschung und schrieb und dokumentierte das Manuskript; J.S. überprüfte das Manuskript.

Materials

Azoxymethane（AOM Sigma-Aldrich,Inc. A5486
Dextran Sulfate Sodium Salt（DSS MP Biomedicals,Inc. 160110
Entoiodine Shanghai likon high technology disinfection co. LTD 310102
digital caliper Ningbo yuanneng trading co. LTD 4859263
4-0 Silk Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
8-0 Prolene Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
Electric coagulation pen Chuang mei medical equipment co. LTD 28221777292
disposable syringe 1ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
disposable syringe 10ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
75% Medicinal alcohol Shandong anjie high-tech disinfection technology co. LTD 371402AAJ008
Pentobarbital sodium salt Sigma-Aldrich,Inc. 57-33-0
Physiological Saline Shandong qidu pharmaceutical co. LTD H37020766
Absorbent Cotton Swab Henan ruike medical co., LTD RK051
Surgical Instruments-Ophthalmic Jinzhong Shanghai co.LTD WA3050
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Li, Y., Liu, J., Liu, G., Pan, Z., Zhang, M., Ma, Y., Wei, Q., Xia, H., Zhang, R. X., She, J. Murine Appendectomy Model of Chronic Colitis Associated Colorectal Cancer by Precise Localization of Caecal Patch. J. Vis. Exp. (150), e59921, doi:10.3791/59921 (2019).
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