Summary
توضح هذه الدراسة القياسات الكمية لحجم متشابك والتعريب، ومورفولوجيا العضلات، وشكل الميتوكوندريا في C. elegans باستخدام أدوات معالجة الصور المتاحة بحرية. يسمح هذا النهج للدراسات المستقبلية في C. elegans بمقارنة كمية مدى التغيرات الهيكلية للأنسجة والأعضاء نتيجة للطفرات الوراثية.
Abstract
تحديد الآليات الخلوية الكامنة وراء المرض أمر ضروري لتطوير علاجات جديدة. وتتمثل الاستراتيجية التي كثيرا ما تستخدم لكشف هذه الآليات في إدخال طفرات في الجينات المرشحة ووصف التغيرات النوعية في مورفولوجيا الأنسجة والعضيات الخلوية. ومع ذلك، قد لا تلتقط الأوصاف النوعية اختلافات فينوتيبيك خفية، وقد تشوه الاختلافات الفينوتية عبر الأفراد في مجموعة سكانية، وكثيراً ما يتم تقييمها ذاتياً. هنا، يتم وصف النهج الكمية لدراسة مورفولوجيا الأنسجة والعضيات في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans باستخدام المسح الضوئي بالليزر المجهرية البؤرية جنبا إلى جنب مع برامج معالجة الصور الحيوية المتاحة تجاريا. تم إجراء تحليل كمي للأنماط الظاهرية التي تؤثر على سلامة المشبك (الحجم ومستويات الفلورة المتكاملة)، وتنمية العضلات (حجم خلية العضلات وطول خيوط الميوسين)، ومورفولوجيا الميتوكوندريا (التعميم والحجم) لفهم آثار الطفرات الوراثية على هذه الهياكل الخلوية. ولا تقتصر هذه النُهج الكمية على التطبيقات الموصوفة هنا، حيث يمكن استخدامها بسهولة لتقييم شكل الأنسجة والعضيات الأخرى في الديدان الخيطية، وكذلك في الكائنات الحية النموذجية الأخرى.
Introduction
يستخدم على نحو متزايد الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans (C. elegans) كنظام نموذجي للكشف عن العمليات البيولوجية والجزيئية التي تنطوي عليها الأمراض البشرية. الديدان الخيطية الكبار لديه طول الجسم من ما يزيد قليلا على 1 ملم، ويمكنأن تنتج الحضنة كبيرة تصل إلى 300 بيضة 1. بعد الفقس، C. elegans تتطلب فقط 3-4 أيام للوصول إلى مرحلة البلوغ، ويعيش لحوالي 2 إلى 3 أسابيع2. نظرا لسهولة الزراعة، C. elegans هو حاليا واحدة من النماذج الحيوانية الأكثر رواجا في الجسم الحي لإجراء فحص فعال من حيث التكلفة والسريع للمخدرات لتحديد العلاجات للأمراض البشرية. بالإضافة إلى ذلك، فإن الحفاظ على الوراثة، والنماذج السلوكية المحددة جيدا، والجسم الشفاف للفلورة أو الفحص المجهري الخفيف، وسهولة التلاعب الجيني تجعل دراسة العواقب الخلوية والجزيئية للطفرات الوراثية قابلة لتحقيقها بسهولة 3. وC. elegans الجينوم يشارك ما يقرب من 60-80٪ علم الأنسجة مع الجينات البشرية، وحوالي 40٪ من تلك الجينات ومن المعروف أن تكون ذات صلة بالأمراض. بعض الأمراض البشرية التي تم نمذجة ودراسة في C. elegans تشمل الاضطرابات العصبية (مرض الزهايمر، مرض باركنسون، التصلب الجانبي الضموري، مرض شاركو ماري الأسنان)، الأمراض المرتبطة بالعضلات ( ضمور العضلات دوشين)، والأمراض الأيضية (فرط السكر في الدم)2،4. في معظم الاضطرابات البشرية، تحدث التعريب الخلوي والأعضاء الناجم عن الأمراض والتغيرات المورفولوجية، والتي يمكن تقييمها بسهولة في نموذج الديدان الخيطية.
وقد استخدمت علامات الفلورسنت على نطاق واسع لتسمية الأنسجة والعضيات للتصور الديناميكي تحت المجهر. ومع ذلك، في C. elegans، اعتمدت الأساليب التقليدية التي تقيّم المخالفات المورفولوجية بسبب الطفرات الوراثية إلى حد كبير على الأوصاف البصرية. في حين أن التقييمات النوعية يمكن أن تغطي نطاقات أوسع من الأوصاف الفينوتية (مورفولوجيا متشابك، تكتل GFP، شكل بديهي محدد، سمك الألياف العضلية، وما إلى ذلك) وتوفير وجهة نظر الطيور العين من التغيرات المورفولوجية، فهي أقل ملاءمة لل مقارنة الاختلافات الصغيرة عبر مجموعات مختلفة. وعلاوة على ذلك، تستند التقييمات النوعية إلى تقييم بصري وذاتي، مما قد يؤدي إلى تقدير التشوهات المورفولوجية تقديرا ً مفرطاً أو ناقصاً. وأخيرا، يمكن أن تختلف الملاحظات النوعية أيضا اختلافا كبيرا بين الأفراد، مما يخلق صعوبات في تكرار البيانات.
وفي السنوات الأخيرة، تم وضع عدد من الخوارزميات الحسابية السهلة الاستعمال والمتاحة بسهولة التي يمكنأن تحلل الصور كميا. ومع ذلك، فإن استخدام مثل هذه البرمجيات تحليل الصور لبعض الدراسات المورفولوجية، وخاصة فيما يتعلق عضلات جدار الجسم والميتوكوندريا، في C. elegans البحوث قد تخلفت. لتحسين التحليل الهيكلي الأساسي في C. elegans, تم تجريب بعض من البرمجيات المتاحة بسهولة, تحليل الصور مفتوحة المصدر لمقارنة كمية آثار الطفرات الوراثية على الميتوكوندريا العضلات, عضلة جدار الجسم ومتشابك مورفولوجيا. هذه الإجراءات التجريبية الخطوط العريضة بالتفصيل كيف يمكن استخدام هذه البرامج (فيجي، ilastik، CellProfiler، SQUASSH) لتقييم التغيرات في حجم متشابك وتوطين البروتين متشابك، منطقة العضلات جدار الجسم وطول الألياف، وحجم الميتوكوندريا وحجم الميتوكوندريا و التعميم نتيجة للطفرات الوراثية في الديدان الخيطية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- نمو وصيانة سلالات C. elegans
- بذور نيماتود النمو المتوسط (NGM، انظر جدولالمواد) لوحات أجار مع 300 درجة مئوية من سلالة القولونية بطيئة النمو OP50 في مجلس الوزراء تدفق اللامينار.
- اترك لوحات أجار NGM في خزانة تدفق اللامينار لتجف.
ملاحظة: في غياب مجلس الوزراء تدفق laminar، لوحات يمكن أن تترك لتجف على مقاعد البدلاء لكنها أكثر عرضة للتلوث. - نقل ما لا يقل عن 20 الحيوانات إلى كل من اثنين من OP50 المصنفة NGM أجار لوحات أن يكون مخزون العمل. هناك طريقتان رئيسيتان لنقل الحيوانات.
- الانتقاء: ارفع الحيوانات بلطف باستخدام اختيار معقم حراري. هذه الطريقة فعالة لاختيار الحيوانات الفردية أو متعددة من لوحة أجار. وجود كشط صغير من البكتيريا في الطرف عند قطف يساعد على نقل.
ملاحظة: يتم اختيار قطعة صغيرة من الأسلاك البلاتين حوالي 4 سم طويلة التي هي جزءا لا يتجزأ من ماصة زجاجية، مع طرف سلك بالارض لتكون 'مثل الرمح'. تعقيم الحرارة اختيار بين اختيار لمنع التلوث المتبادل. - القطع: باستخدام ملعقة معقمة، وقطع مربع صغير من أجار تحتوي على الحيوانات من لوحة واحدة ونقل رأسا على عقب إلى لوحة جديدة.
ملاحظات: هذه الطريقة مفيدة عموما لنقل أعداد كبيرة من الديدان، وإزالة التلوث من لوحات من خلال جولات متعددة من قطع أجار غير الملوثة. تجنب التلوث المتبادل عن طريق إشعال ملعقة لبضع ثوان وغمر ملعقة في الإيثانول 100٪ بين عمليات النقل. لا ينصح بالانتقال من الصفائح المتعطشة لأن المجاعة والاكتظاظ يمكن أن يؤثرا على صحة ومورفولوجيا الهياكل الخلوية ودون الخلوية.
- الانتقاء: ارفع الحيوانات بلطف باستخدام اختيار معقم حراري. هذه الطريقة فعالة لاختيار الحيوانات الفردية أو متعددة من لوحة أجار. وجود كشط صغير من البكتيريا في الطرف عند قطف يساعد على نقل.
- الحفاظ على الديدان في درجة حرارة النمو القياسية (20 درجة مئوية). لضمان استمرار إمدادات الديدان التي تتغذى بشكل جيد، نقل الديدان إلى لوحات جديدة OP50 البذور كل 2 إلى 3 أيام.
2. العمر -- مزامنة C. elegans
- الحفاظ على الديدان على لوحات NGM 3-4 حتى السكان مزدحمة ولكن لا تتضور جوعا.
- غسل بلطف الديدان قبالة لوحة NGM مع حل M9. سيبقى البيض على اللوحة بما أنّ هم يلتصقون إلى ال [إ.كل] [أب50]. كرر مع أربع خطوات غسل إضافية لإزالة جميع الحيوانات فقست.
- السماح للالديدان يفقس لمدة 40 دقيقة.
- إضافة 1-2 مل من محلول M9 إلى لوحة ودوامة بلطف لتخفيف الديدان فقست مؤخرا.
- جمع الحل M9 مع الديدان ولدت مؤخرا ونقل الحل مع الديدان إلى لوحة NGM جديدة.
- السماح للحل M9 لتبخر عن طريق تعريض لوحة NGM في الهواء. القيام بذلك المتاخمة لهب مفتوح لتجنب تلوث لوحة NGM.
- تنمو الديدان لمدة 27 ساعة في 20 درجة مئوية للسماح بالتطور في المرحلة الثالثة من اليرقات (L3). بالنسبة للالحيوانات البالغة البالغة البالغة 3 أيام، يتم اختيار الديدان في المرحلة الرابعة من اليرقات، وتزرع لمدة 3 أيام أخرى للوصول إلى مرحلة البالغين البالغة البالغة 3 أيام.
3. إعداد الشرائح للتصوير
- إعداد 3-4٪ ث / الخامس الأوجاروز الأسهم في زجاجة آمنة الميكروويف (3-4 غرام في 100 مل من المياه النقية).
ملاحظة: يمكن استخدام أجار بدلا من أجاروز في نفس التركيز. - إذابة الأجروز بعناية في فرن ميكروويف، مع الحرص على عدم الغليان، حتى يذوب كل الأجاروز (حل واضح). الحفاظ على الحل عند 70 درجة مئوية لمنع التصلب.
ملاحظة: يمكن استخدام مخزون أغاروز عدة مرات. يُسخّن قبل الاستخدام إذا كان الأجاروز قد توطد. - باستخدام ماصة باستور، ضع قطرة من الأجروز المذاب على شريحة المجهر.
ملاحظة: تجنب وجود فقاعات الهواء في قطرة من أجار وهذه تعطل سلامة وسادة. - اضغط على الفور أسفل قطرات أغاروز مع شريحة المجهر آخر، وتسطيح بلطف الأجاروز في لوحة بين الشرائح اثنين.
ملاحظة: يجب إزالة أي فقاعات بقايا في هذه المرحلة. إذا لم يكن كذلك، ينبغي إجراء شرائح جديدة كما الحيوانات يمكن أن تتعثر بسهولة في فقاعات. تجنب تجاوز أجار إلى الجانب عند الضغط على الشريحة. - يترك الأجاروز ليجف لمدة دقيقة واحدة.
- افصل الشرائح بعناية لتجنب تلف الأجاروز، مع ترك الوسادة الموطّرة على إحدى الشرائح.
ملاحظة: يجب دائما ً أن تكون الشرائح مع منصات أغاروز جاهزة طازجة قبل التجربة كما يمكن أن تجف. تأكد من أن لوحة أغاروز لديها سمك ثابت. يجب أن يكون هناك أي فقاعات الهواء أو الشقوق في وسادة لأن هذا قد تتداخل مع التصوير. - إضافة قطرة صغيرة (5-10 درجة مئوية) من 0.05٪ هيدروكلوريد رباعي الجوانب (مخدر) إلى مركز وسادة أغاروز.
- باستخدام اختيار معقمة الحرارة، نقل بسرعة حوالي 10 - 15 الحيوانات من لوحة الأسهم إلى قطرات مخدر قبل أن يجف الحل. تجنب نقل الكثير من البكتيريا OP50 لأن هذا يجعل الحل غائم، والتي يمكن أن تتداخل مع التصوير.
ملاحظة: إذا كان محلول التخدير يجف أثناء الانتقاء، ببساطة ماصة قطرة ثانية من 0.05٪ هيدروكلوريد تيتراميسال على الحيوانات. الحيوانات تميل إلى وضع على الجانب الجانبي في محلول التخدير. - تطبيق غطاء عن طريق وضعه فقط فوق لوحة أغاروز وإسقاط بلطف عليه. وهذا سوف يمنع تشكيل فقاعات. لا تمارس الضغط على غطاء لأن هذا قد يسحق الحيوانات.
- تسمية الشرائح مع اسم السلالة.
4. تقييم مورفولوجيا متشابك
ملاحظة: تم دراسة آثار MEC-17 الإفراط في التعبير على سلامة متشابك في الخلايا العصبية مستقبلات اللمس الجانبية الجانبية الخلفية (PLM) من خلال قياس حجم متشابك والتوطين باستخدام خط المسح الضوئي المجهري البؤري. تم تصور الخلايا العصبية للحركة الشعبية لتحرير السودان (بما في ذلك المناطق متشابك) باستخدام uIs115 (Pmec-17::tagRFP) transgene (سلالة: TU40655)وتسمية منطقة متشابك على وجه التحديد مع jsIs37 (Pmec-7::snb-1::GFP) (سلالة: NM664) 6) . أجريت هذه الدراسة في الحيوانات المتزامنة L3 غير المعدلة وراثيا والمعدلة وراثيا من سلالة MEC-17 خارج الكروموسوم ة التعبير المفرط BXN507 [cjnEx036 (Pmec-4::mec-17, Pmyo-2::mCherry); jsIs37; uIs115]7. وترد في الجدول 1قائمة كاملة بالسلالات المستخدمة في هذه الدراسة.
- التصوير البؤري لنقاط الاشتباك العصبي لمستقبلات اللمس
- لتصوير المناطق متشابك، واستخدام خط المسح المجهر البؤري إلى جانب 488 نانومتر و 552 نانومتر ضخ بصريا ليزر الصمام الثنائي شبه موصل ومجهزة برنامج التقاط الصور.
- حدد موقع الديدان باستخدام التكبير الأدنى.
- عندما يتم وضع الحيوانات بنجاح، انتقل إلى التكبير 40X وتطبيق وسيطة الغمر (في هذه الدراسة: تم استخدام هدف 40X/1.10 HC PL APO CS2 متعددة غامرة مع غمر المياه).
- تصور منطقة متشابك من قبل مثيرة الفلوروفور مع ليزر 488 نانومتر (2٪ قوة) لفلوروفور GFP و 552 نانومتر (1٪ السلطة) لالفلوروفور tagRFP.
- تحديد الإطار الأمثل س وy لالتقاط منطقة متشابك بأكمله. تأكد من مراعاة حجم البكسل الأمثل عند تحديد الإطار. في هذه الدراسة، تم الحصول على حجم بكسل متسقة من 56 نانومتر.
- التقاط الصور باستخدام كاشف الصور الهجين وتعيين المكاسب لمنع التعرض المفرط للفلوروفور (100٪ ل488 نانومتر الإثارة و 15٪ ل552 نانومتر الإثارة).
- جمع الصور z-كومة لتغطية متشابك كامل، وذلك باستخدام حجم الخطوة z الأمثل اعتمادا على الهدف المحدد المستخدم. في هذه الدراسة, تم استخدام حجم الخطوة z الأمثل من 0.211 نانومتر.
ملاحظة: تأكد من أن جميع الصور يتم التقاطها في ظل شرط صارم للسماح بالقياس الكمي والمقارنة المتكاملين للفلورة. ويمكن القيام بذلك عن طريق الحفاظ على معلمات الفحص الدقيق متطابقة عبر جميع الصور التي تم التقاطها (أي إعدادات الليزر وكاشف، وحجم البكسل، وسرعة المسح الضوئي، والحجم الأمثل لخطوة z). تعتمد الإعدادات المثلى على الهدف ويمكن حسابها باستخدام برامج المعلوماتية الحيوية التي يمكن الوصول إليها، مثل حاسبة Nyquist (https://svi.nl/NyquistCalculator). تسمية الصور بشكل منهجي، وهذا سيكون مفيدا عند استخدام برامج المعلوماتية الحيوية التي سيتم تنظيم ومعالجة الملفات على أساس اسم الملف.
-
التحديد الكمي لمنطقة متشابك
- لتحليل منطقة متشابك، قم بتصدير الصور كملفات TIFF. جافا القائم على برامج معالجة التصوير مثل ImageJ، يمكن استخدامها (في هذه الدراسة، تم استخدام ماكرو تحويل صورة التصوير بالرنين المغناطيسي في ImageJ).
- تم قياس حجم ومستويات كثافة الفلورة المتكاملة من نقاط الاشتباك العصبي من كثافة مجموع المداخن z التي تم الحصول عليها مع CellProfiler-3.1.5. قم بتحميل الصور في برنامج CellProfiler3.1.5. إذا لزم الأمر، يمكن تصفية الصور استنادًا إلى أسماء ملفات الصور.
- قم بإعداد الوحدة النمطية الاسم والنوع. بشكل اختياري، قم باستخراج بيانات التعريف من تسمية الصورة لتنظيم البيانات المحسوبة وفقًا لذلك.
- تحديد منطقة متشابك عن طريق تعريف يدوي لهذه المنطقة باستخدام tagRFP منتشر أعرب من uIs115 (Pmec-17::tagRFP) transgene. يمكن القيام بذلك عن طريق إضافة الوحدة النمطية بخصوص إلى خط أنابيب CellProfiler-3.1.5.
- لقياس حجم وفلورة المشبك المعرفة باليد، أضف قياس حجم الكائن وشكله ووحدة كثافة الكائن إلى خط الأنابيب.
- حساب كثافة الفلورة المتكاملة النسبية عن طريق إضافة الوحدة النمطية حساب الرياضيات. تقسيم وحدات الكثافة المتكاملة التي تم الحصول عليها من jsIs37 (Pmec-7::snb-1::GFP) من قبل الوحدات المتكاملة التي تم الحصول عليها لuIs115 (Pmec-17::tagRFP).
- قياسات التصدير والحسابات.
5. قياس هيكل العضلات جدار الجسم
- تصوير الفلورة لهيكل عضلة جدار الجسم
- الحصول على سلالة (على سبيل المثال، RW1596) تحمل stEx30 transgene (Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6 (su1006))8، الذي تسميات ألياف ميوسين مع GFP.
ملاحظة: يمكن تحقيق إدخال الترانسجين في الحيوانات إما عن طريق عبور سلالة من الاهتمام مع الحيوانات التي تعبر بالفعل عن الترانسجين، أو حقن الحمض النووي في الذراع البعيدة للغوناد. النمط الظاهري "المتداول" الناجم عن طفرة رول-6 في هذا الترانسجين يسهل تصور العضلات. عضلات جدار الجسم تعمل على طول الجانبين الظهري والبطني التي عادة ما تمنع من عرض في الحيوانات البرية من النوع لأنها تقع عادة على واحد من الجانبين الجانبي. الرول-6 (su1006) أليل يحفز التواء الحيوانات، وبالتالي تعريض بعض خلايا العضلات للتصوير. - صورة الحيوانات باستخدام مجهر الفلورة إلى جانب عالية الدقة مشحونة كاميرا الجهاز المقترنة (CCD)، 40X الهدف أو أعلى، GFP تصفية واقتناء البرمجيات.
- ضبط وقت التعرض وكثافة الإضاءة لمنع الصور المشبعة.
- التقاط وحفظ الصور من العضلات (400X التكبير) من قسم من الحيوان يحتوي على واحد على الأقل خلية العضلات المائلة مرئية كاملة. تجنب المناطق التي تحتوي على خلية عضلة واحدة غير مكتملة أو مقاطع غير موجودة خارج نطاق التركيز. كما استبعد الصور من المناطق الأمامية والخلفية المتطرفة، والمناطق المجاورة للفرج.
ملاحظة: إذا لم يكن لدى الحيوان خلية عضلة كاملة مرئية واحدة، حرك بلطف غطاء لتحويل الحيوان وذلك لفضح خلية كاملة.
- الحصول على سلالة (على سبيل المثال، RW1596) تحمل stEx30 transgene (Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6 (su1006))8، الذي تسميات ألياف ميوسين مع GFP.
- قياس منطقة خلايا العضلات
- افتح الصورة في برنامج Fiji9 (تم استخدام الإصدار 2.0.0 في هذه الدراسة).
- استخدام اختيار المضلع لتتبع بعناية حول خلية العضلات المائلة واحدة. ضبط خط المضلع في النهاية عن طريق سحب نقطة الارتساء لتحسين التتبع.
- انتقل إلى علامة التبويب تحليل في الجزء العلوي من البرنامج وانقر على قياس لحساب مساحة التحديد. وسيُعرض جدول نتائج منفصل يحتوي على المنطقة وقياسات أخرى. إذا كان قياس المنطقة مفقوداً من جدول النتائج، انتقل إلى تعيين قياسات ضمن علامة التبويب تحليل وتحقق من وضع علامة على مربع المنطقة. وبالمثل، قم بإلغاء تحديد القياسات الأخرى التي لا تحتاج إليها.
- بالنسبة لخلايا العضلات ذات المنطقة المنحلة/المفقودة، تتبع المنطقة المفقودة باستخدام أداة تحديد المضلع وانقر فوق قياس مرة أخرى. إذا كان هناك فجوات متعددة داخل الخلية، تتبع كل فجوة على حدة.
- حساب نسبة منطقة الفجوة إلى كامل خلية العضلات واحدة. نسبة عالية تشير إلى مدى أعلى من انحطاط العضلات بسبب الفجوات الكبيرة داخل الخلية. وإذا لم تكن هناك مناطق مفقودة، كما يُرى عادة في الحيوانات البرية، فإن النسبة ستحسب على أنها صفر.
ملاحظة: كعنصر تحكم، درجة أيضا لعيوب هيكل العضلات بصريا ومقارنة النتائج مع القياس الكمي. وهذا مفيد بشكل خاص إذا كان يتم دراسة سلالة لأول مرة في المختبر. لتسجيل phenotypic، وتقييم الحيوانات كما معيبة أو غير معيبة على أساس سلامة خيوط. على سبيل المثال، سيتم تسجيل الحيوانات التي تعاني من فقدان خيوط تشققات متميزة، أو تكتل GFP، أو فجوات داخل خلايا العضلات بسبب الانهيار الهيكلي، على أنها معيبة.
- تجزئة وتكميم طول ألياف الموسين
- إذا لزم الأمر، قم أولاً بتحويل الملفات إلى . tif باستخدام فيجي أو حزمة برامج أخرى. حفظ ملفات TIFF في الموقع المطلوب.
- فتح ilastik10 (البرمجيات الحرة، الإصدار 1.3.2 يمكن تحميلها من https://www.ilastik.org/).
- مرة واحدة في ilastik، اختر تصنيف بكسل ضمن إنشاء مشروع جديد . سيطالب البرنامج بحفظ المشروع. إعادة تسمية المشروع وحفظ إلى موقع المطلوب.
ملاحظة: مشروع جديد يحتاج فقط إلى إنشاء مرة واحدة. يمكن إجراء التجزئة اللاحقة باستخدام نفس المشروع. لاستخدام نفس إعدادات المشروع، انتقل إلى علامة التبويب المشروع في الجزء العلوي، وانقر فوق فتح المشروع للوصول إلى ملف المشروع. - يجب أن يكون هناك 5 علامات التبويب على اللوحة اليسرى (بيانات الإدخال، واختيار الميزات، والتدريب، وتصدير التنبؤ ومعالجة الدفعات). في علامة التبويب بيانات الإدخال، انقر فوق إضافة جديد ثم أضف صورة منفصلة (صور). قم بتوجيه الإطار المنبثق إلى المجلد الذي يحتوي على ملفات TIFF وحدد الصورة المراد فتحها.
- في علامة التبويب التالية أدناه ( تحديدالميزة)، انقر على تحديد الميزات لتحديد جميع ميزات البكسل، المشار إليها من قبل مربعات وضع علامة خضراء. يتم استخدام تحديد البكسل في هذه الخطوة لتمييز فئات البكسل المختلفة في الخطوة التالية.
ملاحظة: تحديد ميزة بكسل يعتمد على دقة الصورة. وبالتالي، يقترح المطورون تحديد كافة أو أكبر عدد ممكن من الميزات، إذا كانت قوة المعالجة والوقت يسمحان بذلك. - تسمح لوحة التدريب التالية بتصنيف فئات الكائنات المختلفة استناداً إلى وحدات البكسل. في هذه الحالة، وفئتين هي الفردية GFP التعبير عن خيوط myosin والخلفية غير المرغوب فيها أو حواف ضبابية. انقر على إضافة تسمية للحصول على التسمية الأولى. الزحف على عدد من خيوط لبدء التدريب المصنف.
ملاحظة: النقر المزدوج فوق التسمية يسمح بتغيير الاسم (على سبيل المثال، إعادة تسمية 'التسمية 1' إلى 'خيوط'). النقر المزدوج فوق المربع الملون يسمح بتغيير ألوان العرض الرسم والاحتمال. الحجم الافتراضي لفرشاة الطلاء هو 1، على الرغم من أن الحجم يمكن زيادة إلى 61. إذا تم رسم البكسل الخطأ، ببساطة استخدم أداة الممحاة لإزالة الرسم. يمكن استخدام عناصر تحكم لوحة المفاتيح (-) و (Shift +) للتكبير والتصغير للصورة، على التوالي. يتم استخدام مفاتيح الأسهم للتنقل حول الصورة. - إضافة تسمية ثانية وإعادة تسميتها إلى الخلفية. الزحف على الخلفيات والمسافات غير المرغوب فيها بين خيوط.
- انقر على تحديث مباشر وتأكد من أن التصنيف قد تم من قبل البرنامج بشكل صحيح. إضافة المزيد من الزحف وصقل التدريب إذا لزم الأمر.
ملاحظة: من المهم إبقاء العين للألياف المدمجة وحواف ضبابية (مثل خط الجسم) في هذه الخطوة. تحسين التنبؤ هنا قدر الإمكان لزيادة دقة القياسات. دقة التنبؤ يعتمد أيضا على دقة الصورة، كما بكسل في الصور ذات جودة منخفضة هي أكثر صعوبة لندف بعيدا. كما أنه اختياري ولكن من المستحسن تشغيل "أسلوب التصفية" في الدالة "اقتراح ميزات" بجانب عنصر تحكم "تحديث مباشر". - بمجرد إجراء تدريب مصنف بشكل كاف، انتقل إلى لوحة التنبؤ التصدير. انقر على اختيار تصدير إعدادات الصورة مع الاحتمالات كمصدر.
- استخدم الإعدادات التالية. قطع المنطقة دون الإقليمية x و y تكتك، و c unticked. يجب أن تكون قيم البدء والتوقف لـ c 0 و 1 على التوالي. ضع علامة على نوع البيانات في التحويلات إلى 8 بت غير موقعة، واعادة التطبيع [الحد الأدنى والحد الأقصى] واستخدم القيم الافتراضية. تغيير تنسيق فيديو ملف الإخراج إلى PNG ثم إعادة تسمية الملف والدليل كما هو مطلوب.
- أغلق إطار إعدادات التصدير وقم بتصدير الصورة المحددة التي تم تقسيمها للتو.
- افتح صورة PNG المحفوظة في برنامج Fiji. يجب أن تظهر الصورة بالأبيض والأسود.
- ضبط عتبة الصورة باستخدام الإعدادات الافتراضية.
- تطبيق البرنامج المساعد الهيكل العظمي (الهيكل العظمي 2D / 3D، ومن ثم تحليل الهيكل العظمي). سيتم عرض جدول منفصل للنتائج، والذي يتضمن طول الفرع. طول الفرع يمثل طول الألياف. ويمكن أن تكون البيانات الأخرى في النتائج مفيدة أيضا، مثل المسافة الإقليدية.
ملاحظة: حذف الألياف مع أطوال 0 ميكرومتر أو أكثر من 250 ميكرومتر، لأن هذه الأحجام ليست ممكنة من الناحية الفسيولوجية.
6. قياس مورفولوجيا الميتوكوندريا
ملاحظة: للحصول على كمية من مورفولوجيا الميتوكوندريا، استخدمت هذه الدراسة سلالة BXN0387 التي تحتوي على uIs115 (Pmec-17::tagRFP)5 transgene لتصور الخلايا العصبية PLM وjsIs609 (Pmec-4::MLS::GFP)11 لتصور الميتوكوندريا على وجه التحديد داخل الخلايا العصبية PLM. أجريت هذه الدراسة في متزامنة 3 أيام الديدان الكبار القديمة، ولكن تم تنفيذها بنجاح في أعمار أخرى، وكذلك في الأنسجة الأخرى7.
- تصوير الفلوركون داخل الخلايا العصبية للحركة الشعبية لتحرير السودان
- لقياس حجم وشكل التغيرات في الميتوكوندريا داخل الخلايا العصبية PLM، تصور كل من الخلايا العصبية الخلفية والميتوكوندريا باستخدام الجينات الفلورية.
- لتصوير الخلايا العصبية PLM، استخدم مجهر ًا بؤريًا مقترنًا بـ 488 نانومتر و552 نانومتر تم ضخه ضوئيًا بالليزر الثنائي شبه موصل ومجهز ًا ببرامج التقاط الصور.
- صورة الدودة وفقا للخطوات 4.1.1-4.1.4 أعلاه، وضمان ظروف التعرض غير المشبعة.
- من أجل تصور الخلايا العصبية بأكملها، قد تكون هناك حاجة إلى صورة متجانبة. لتحقيق ذلك، استخدم برنامج مع خيار فحص البلاط لتحديد موقع وإسقاط علامة في زاوية واحدة من الخلايا العصبية ومن ثم تحديد موقع الطرف الآخر وإسقاط علامة أخرى. سيقوم البرنامج بحساب العدد الأمثل من البلاط اللازمة لالتقاط المنطقة المطلوبة.
ملاحظة: لتقليل وقت المسح الضوئي، غالباً ما يكون من الأسهل تحديد موقع الخلايا العصبية التي تتبع مستوى واحد، مما يؤدي إلى عدد أقل من البلاط. - لاقتران فحص التجانب بمكدس Z، قم بتعيين الحدود السفلية والعليا قبل بدء فحص التجانب، وتأكد من تعيين حجم الشريحة الأمثل.
- تأكد من تحسين الدقة، حيث سيتم تحسين التقسيم بدقة أعلى (هنا، تم استخدام دقة 3224 × 3224 بكسل).
ملاحظة: في حين يتم استخدام uIs115 (Pmec-17::tagRFP) transgene لوضع الحركة الشعبية لتحرير السودان ووضع الكاميرا بنجاح، فإنه لا يحتاج بالضرورة إلى أن يتم تصويرها بسبب الفلورة الخلفية طفيفة لوحظ من jsIs609 (Pmec-4::MLS::GFP) [ترنسجن] ضمن ال [بلم] [أإكسون] نفسه. وهكذا، يمكن تقليل وقت المسح الضوئي والتصوير عن طريق إزالة مرشح 552 نانومتر من التجربة.
- تجزئة الكائن باستخدام SQUASSH
- تحويل ملفات الصور إلى صور .tiff وتوليد التوقعات كثافة قصوى من مكدسات Z باستخدام برنامج التصوير فيجي. اقتصاص الصور إلى الحد الأدنى من الحجم في حين لا تزال تحتوي على الخلايا العصبية كاملة للحد من الحمل الحسابي والحد من الضوضاء الخلفية.
ملاحظة: للحصول على النتائج التمثيلية، تم النظر فقط الميتوكوندريا داخل العمليات الإبطية طويلة، لذلك تم استبعاد الجسم الخلوي وأي الميتوكوندريا داخل من كل صورة. - باستخدام الماكرو SQUASSH جناح الفسيفساء لImageJ، قم بإجراء تقسيم Bregmanالمقطع 12 على الإسقاطات القصوى. يتوفر دليل مفصل لتركيب وتطبيق هذا الماكرو على موقع موزاييك (http://mosaic.mpi-cbg.de/) ووصفه رزق وآخرون. ويرد أدناه وصف لعملية تجزئة الصور.
ملاحظة: يعرّف هذا التجزئة الكائنات (في هذه الحالة mitochondrion الفردية) فوق عتبة كثافة الفلورة، مما يسمح بقياس دقيق لكل حجم وشكل الكائنات الفردية. - إزالة الضوضاء الخلفية من صورة باستخدام طريقة الكرة المتداول، حيث نافذة معرفة من قبل المستخدم يتحرك عبر الصورة، وحساب تقدير كثافة الخلفية المحلية من الكثافة الأكثر تكرارا في كل نافذة. يؤدي هذا إلى تصحيح كثافة الخلفية غير المتساوية.
- استخدم اكتشاف الكائن للبحث تقريبًا عن مناطق الصورة التي تحتوي على كائنات (ميتوكوندريا) ذات أهمية، استنادًا إلى كثافة الفلورة وعدد وحدات البكسل. المعلمات التي تحكم هذه الخطوة هي التسوية والحد الأدنى لكثافة الكائن.
ملاحظة: يتم استخدام التسوية لتجنب تقسيم الكثافة الصغيرة، والقمم الناجمة عن الضوضاء، وعتبة كثافة الكائن الأدنى يساعد على تحديد العضيات دون الخلوية من الفلورة الأنسجة الخلفية. هذه هي المعلمات الرئيسية التي يتم التلاعب بها للعثور على تجزئة الأمثل من الميتوكوندريا، وعملية التحسين يميل إلى أن تكون التجربة والخطأ من المعلمات المختلفة لصورة الاختبار، تليها التفتيش اليدوي. - استخدم البرنامج لتقدير كثافة الخلفية المحلية حول كل كائن للمساعدة في حساب التقسيم الأمثل.
- قياس الكائنات الفردية لحجم، محيط، طول عن طريق عدد بكسل، فضلا عن كثافة إشارة وx / y الموقع على الصورة. لحساب القياسات في الحجم (نانومتر)، عامل في حجم بكسل الصورة الأصلية.
ملاحظة: لكل تجربة، يجب أولاً حساب المعلمات المثلى. لضمان دقة التجزئة، من المستحسن إجراء تحليل SQUASSH على صورة اختبار وفحص دقة التجزئة يدويًا. يوفر الماكرو ملفات الإخراج التي تعرض الكائنات الفردية التي تم تعريفها على الصورة الأصلية، وفحص هذه المعلمات عن كثب وضبطها لتناسب سوف يضمن تجزئة دقيقة. ثم يجب استخدام المعلمات المحددة للتجربة بأكملها للمقارنة. وترد البارامترات المستخدمة في النتائج التمثيلية في الجدول2. - افتح برنامج تحليل فيجي أو ImageJ، وانتقل إلى حاوية ماكرو الفسيفساء وافتح قائمة SQUASSH.
- افتح القائمة الفرعية للطرح في الخلفية وتأكد من إزالة الخلفية؟ الافتراضي لحجم الإطار هو 10.
- تعيين التسوية المطلوبة والحد الأدنى لكثافة الكائن، قيم القناة 1 لتعريف الكائنات ومقطعها على أفضل وجه (راجع الخطوة 6.2.4). قيم القناة 2 ليست ضرورية للكائنات التي تم وضع علامة عليها باستخدام transgene واحد.
- انقر فوق تقدير PSF من الخصائص الموضوعية لتقدير وظيفة انتشار النقطة استنادًا إلى خصائص المجهر. يساعد هذا على تجزئة الكائنات الموجودة بشكل وثيق عن طريق حساب تأثير كل بكسل على بكسل المجاورة.
ملاحظة: لم يتم استخدام تجزئة Subpixel في هذه التجربة بسبب زيادة الحمل على طاقة معالجة الكمبيوتر. كما لم يتم استخدام أقنعة الخلية كما يتم تعريف محور عصبي بسهولة. هذه الإعدادات مفيدة للأنسجة أكثر تعقيداً ولتعريف الكائنات على أساس خلية. - بالنسبة لخيارات المرئيات، تأكد من تحديد حدود الكائن وخصائص الكائن والصورة. للاستخدام في وقت لاحق في الرسومات والبرامج الإحصائية، تأكد من أن العدد الصحيح من الشروط هي الإدخال.
- حدد موقع المجلد مع صور .tiff ثم قم بتشغيل الماكرو. يمكن تنفيذ هذه العملية على صورة فردية أو على مجموعة من الصور لكل نمط جيني موجود داخل مجلد. سيتم وضع ملفات الإخراج في المجلد مع الصور الأصلية.
- تحويل ملفات الصور إلى صور .tiff وتوليد التوقعات كثافة قصوى من مكدسات Z باستخدام برنامج التصوير فيجي. اقتصاص الصور إلى الحد الأدنى من الحجم في حين لا تزال تحتوي على الخلايا العصبية كاملة للحد من الحمل الحسابي والحد من الضوضاء الخلفية.
- تحليل وقياسات الشكل
- استخدم الإخراج من SQUASSH لتوفير ملف .csv بيانات كائن مفصل، والذي يوفر كل كائن فردي لكل صف بما في ذلك قياساته كما هو موضح أعلاه.
ملاحظة: أثناء عملية الماكرو هذه أتمتة قياسات الكائن من المهم دائماً التحقق يدوياً من صور الإخراج بعد تجزئة SQUASSH للتأكد من أن الماكرو قد تم تعريف الميتوكوندريا بشكل صحيح. - لتحليل شكل كل الميتوكوندريا ، استخدم مقياسثنائي الأبعاد للفحل ، التعميم، لتقدير انحراف الكائن عن دائرة مثالية.
ملاحظة: التعميم هو وظيفة من المنطقة ومحيط (التعميم = (4 ×) س (المنطقة / محيط 2) حيث 1 = دائرة مثالية و 0 = خط مستقيم. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام صيغة في الرسومات والبرامج الإحصائية. - لتحديد التباين في الحجم والشكل عبر مجموعة من الميتوكوندريا، حساب الرسوم البيانية وتوزيع غاوسي المجهزة باستخدام الرسومات والبرامج الإحصائية، مع صناديق من 0.2 ميكرومتر لحجم الميتوكوندريا و 0.05 للدائرية الميتوكوندريا.
- استخدم الإخراج من SQUASSH لتوفير ملف .csv بيانات كائن مفصل، والذي يوفر كل كائن فردي لكل صف بما في ذلك قياساته كما هو موضح أعلاه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. elegans هو كائن نموذجي مثالي لدراسة مورفولوجيا الأنسجة والعضيات المختلفة بسبب بساطته، والنسب الخلية المعروفة، والشفافية، والأدوات المتاحة. هنا، نحن نقدم النهج الكمية لدراسة العضيات (على سبيل المثال، الميتوكوندريا) والأنسجة، بما في ذلك نقاط الاشتباك العصبي والعضلات باستخدام التصوير الفلوري الحي وبرامج معالجة الصور الحيوية الحرة.
مطلوب تنظيم صارم للتعبير MEC-17 لتطوير متشابك العادي
لمزيد من فهم وظيفة ألفا توبولين أسيتيل-ترانسفيراز MEC-1714,15,16 في الجهاز العصبي, درسنا مورفولوجيا متشابك في الخلايا العصبية مستقبلات اللمس في C. elegans overexpressing البروتين17. هذه الهياكل الخلوية ضرورية لوظيفة الخلايا العصبية لأنها تسمح للإشارات التي يتم تمريرها إلى الخلايا العصبية المجاورة. تم جمع صور لمتشابكات الحركة الشعبية لتحرير السودان باستخدام مجهر ضوئي ضوئي بالليزر، وتم إجراء تحليل المورفولوجيا الكمية باستخدام برامج معالجة الصور الحيوية التي يمكن الوصول إليها (الشكل1A،B). ويؤدي التعبير المفرط لـ MEC-17 إلى تخفيضات كبيرة في مجال التراكمات السابقة للمتشابك في الحركة الشعبية لتحرير السودان، وانخفاض كثافة الفلورة المتكاملة النسبية لعلامة SNB-1::GFP (الشكل1C,D). معا, هذه النتائج تشير إلى أن الإفراط في التعبير عن MEC-17 يعطل التنمية متشابك العادي في الخلايا العصبية مستقبلات لمسPLM.
وقد تمت دراسة حجم الموقع المتبصّر والفلورة المتكاملة النسبية باستخدام برنامج معالجة الصور الحيوية المجاني CellProfiler3.1.5. بسبب بنيتها المعقدة، تم تعريف نقاط الاشتباك العصبي باليد باستخدام بروتين tagRFP المنتشر الذي تم التعبير عنه من الترانسجين uIs115 (Pmec-17::tagRFP). تم حساب مساحة المشبك المحدد بعدد وحدات البكسل داخل المنطقة المحددة. وبالمقارنة مع التحكم من النوع البري، خفضت الحيوانات الزائدة عن العبر MEC-17 بشكل كبير المناطق السابقة للمتشابك(P = 0.0025؛ n ≥ 10) (الشكل1C). وبالإضافة إلى ذلك، لدراسة سلامة متشابك، تمت مقارنة مستويات كثافة الفلورة المتكاملة النسبية. وقد تم حساب ذلك بقياس مستويات شدة الفلورة المتكاملة داخل المشبك المحدد لكل من SNB-1::GFP وtagRFP القابلة للاختراق. وفي وقت لاحق، تمت مقارنة قيم الفلورة SNB-1::GFP بالنسبة إلى قيم tagRFP التي لوحظ انخفاض كبير (P = 0.0479؛ n ≥ 10) مع التعبير المفرط لMEC-17 (الشكل1D). وتشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن التنظيم الصحيح لـ MEC-17 مهم لتطوير المشبك.
القياس الكمي لمنطقة خلايا عضلة جدار الجسم وطول الألياف يكشف عن عيوب كبيرة نتيجة للطفرات في الجينات ذات الصلة CMT2
وقد ثبت الطفرة في الجينات MFN2، DNM2 وKIF5A تسبب Charcot ماري الأسنان نوع 2 (CMT2) ، وهو شكل عصبي من الاعتلال العصبي المحيطي الموروثالأكثر شيوعا18،19. ويرتبط CMT2 عادة مع ضعف العضلات القاصي التدريجي ببطء وضمور, ضعف الحسية البعيدة, تشوهات القدم ومشية الخطوة الثانوية. ونتيجة لذلك، يعاني المرضى في كثير من الأحيان من ضعف الحركة المنهكمدى الحياة. لا يوجد حاليا أي علاج لهذا المرض، ويرجع ذلك جزئيا إلى التغاير الوراثي والسريري المرتبطة CMT219، فضلا عن عدم وجود نماذج حيوانية لدراسة الفيزيولوجيا المرضية المرض. وبالتالي، فإن استخدام النماذج الحيوانية لفهم العيوب الخلوية الكامنة يمكن أن توفر إجابات لآليات مرض CMT2 غير معروف.
حتى الآن, الدراسات المنشورة تقييم عيوب العضلات جدار الجسم في C. elegans اعتمدت على التهديف البصريبدلا من القياسات الكمية20. من أجل تجنب التحيز الذاتي الذي يمكن أن يحدث خلال التقييم النوعي، تم تجريب القياسات الكمية لمنطقة العضلات جدار الجسم وطول الألياف myosin باستخدام برامج معالجة الصور المتاحة. استخدمنا هذه الطرق لتقييم مورفولوجيا العضلات في الحيوانات التي تحمل طفرات في fzo-1/MFN2، dyn-1/DNM2 وunc-116/KIF5A الجينات في 3 أيام من العمر الكبار C. elegans. لكل من القياسات، تم تطبيق عدد من الشروط، بحيث كان على الأقل خلية العضلات المائلة كاملة واحدة في الرؤية، واستبعاد خلايا العضلات التي كانت غامضة أو خارج التركيز، والمناطق الأمامية والخلفية المتطرفة، فضلا عن المناطق المجاورة ل تم حذف الفرج. بالإضافة إلى الطفرات في الجينات المرتبطة CMT2، حملت الحيوانات أيضا stEx30 (Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6 (su1006)) transgene التي تصف C. elegans myosin وحدة فرعية سلسلة ثقيلة مع GFP (الشكل 2A-E). تم استخدام أداة المضلع البسيطة في برنامج فيجي9 (الإصدار 2.0.0) لقياس مساحة خلية عضلة واحدة. إذا كان الحيوان من ذوي الخبرة انهيار هيكل العضلات جدار الجسم، وترك وراءها المساحات الفارغة داخل خلايا العضلات، تم حساب نسبة منطقة الفجوة إلى إجمالي منطقة خلية العضلات واحدة ومقارنتها مع السيطرة من النوع البري (الشكل3A). للحصول على قياسات لطول ألياف الموسين، تم تقسيم كل صورة لأول مرة باستخدام برنامج ilastik10 (الإصدار 1.3.0) (الشكل3B). التقسيم هو عملية تسمح بتصنيف ألياف العضلات الفردية وفصلها عن الأقسام غير المرغوب فيها مثل الخلفية. بعد التجزئة، تم تصدير الصورة كصورة ثنائية غير معينة 8 بت. فيجي (الإصدار 2.0.0) تم استخدامها بعد ذلك إلى الهيكل العظمي للصورة الثنائية لتصفية البيكسلات الحدود، تاركة وراءها أجزاء تمثل الألياف الأصلية. ثم تم تحليل أطوال فرع الهياكل العظمية ، أو خيوط الموسين الفردية ، في فيجي. تم استبعاد قياسات الطول من 0 أو أكثر من 250 ميكرومتر، وهو الحد الأقصى للطول المعقول لخيوط حتى مع تمدد العضلات. بالإجمال, بين 2000 [تو] 3000 [موسين] ليف تمّ قياس أطوال كان. ويرد ملخص لسير عمل التجزئة في الشكل 3B. كما تمت مقارنة نتائج التحليل الكمي مع التهديف البصري لعيوب عضلات جدار الجسم، حيث تم تصنيف الحيوانات القديمة لمدة 3 أيام على أنها معيبة أو غير معيبة على أساس سلامة هيكل العضلات.
وقد لوحظت عيوب في مورفولوجيا عضلة جدار الجسم بين 2.5 إلى 3.5 مرات أعلى في fzo-1 (cjn020) وdyn-1 (ky51) وunc-116 (e2310) الحيوانات مما كانت عليه في الحيوانات البرية من النوع خلال التقييم البصري (الشكل4A). شهدت معظم الحيوانات مع الطفرات في fzo-1 و unc-116 فقدان واضح من التشققات العضلية، تكتل GFP كبيرة بسبب تراكم الحطام الخلوي، وانحطاط الألياف العضلية التي تركت مساحة الفجوة داخل خلايا العضلات ( الشكل 2C،E). وعلى النقيض من ذلك، في حين تم تسجيل أكثر من 60٪ من المتحولين dyn-1 معيبة بصريا، وكان مدى العيوب الحد الأدنى بالمقارنة مع اثنين من المتحولين الوراثية الأخرى. لم يكن هناك سوى خسارة طفيفة من التشققات، لا تجمعات GFP وانحطاط العضلات طفيفة فقط بالمقارنة مع المتحولين الآخرين (الشكل2D والشكل 4A). وكما هو الحال مع تسجيل العيوب الفينوتية الأخرى، لا يمكن النظر في مدى العيوب، وقد يؤدي الميل إلى التحيز إلى تسجيل نسبة أعلى من العيوب. ولذلك، فإن القياسات الكمية لمنطقة خلايا العضلات وطول الألياف توفر تمثيلا أكثر دقة لمدى عيوب العضلات من التقييم البصري وحده. وتماشياً مع الفجوات الكبيرة التي لوحظت مع تسجيل النقاط البصرية، تبين أن نسبة المساحة إلى إجمالي مساحة الخلية الواحدة أعلى بـ 5 إلى 6 مرات في الحيوانات المتحولة fzo-1 وunc-116 مقارنة بالمجموعة البرية، التي لم تشهد سوى عدد لا يُذكر انهيار هيكل العضلات (الشكل4B). وأدى عدم وجود انهيار هيكلي في المسوخ dyn-1 إلى زيادة غير هامة، 3 أضعاف في الفجوة إلى نسبة منطقة خلايا العضلات (الشكل4B). ويشير ذلك أيضا إلى أن تحيز القائمين بالتجربة قد يكون عاملا يسهم في ارتفاع نسبة العيوب التي يخصصها التقييم النوعي. ومع ذلك، خفضت الفجوات الصغيرة متوسط طول الألياف من 24 ميكرومتر في البرية إلى 22 ميكرومتر في المسوخ dyn-1 (الشكل4C). وكان متوسط طول الألياف أقصر بشكل كبير في fzo-1 و unc-116 المسوخ، وترتبط مع وجود فجوات أكبر داخل خلايا العضلات المتحللة في هذه الحيوانات (الشكل2C،E و الشكل 4C ). هذه النتائج تتفق مع النتائج التي توصلنا إليها مؤخرا دراسة آثار تغيير الجينات CMT2-asscoiated في C. elegans20. وعلاوة على ذلك، فإنها تسلط الضوء على تقييم أكثر دقة لمورفولوجيا العضلات باستخدام هذه الأساليب الكمية مقارنة بالتهديف البصري وحده، وتقدم أدلة على أن fzo-1 و unc-116 مطلوبة لمورفولوجيا العضلات العادية.
القياسات الكمية للمورفولوجيا الميتوكوندريا باستخدام تجزئة كائن سكواش
لفهم كيف يؤثر غياب الانشطار الميتوكوندريا على مورفولوجيا الميتوكوندريا في الخلايا العصبية C. elegans، قمنا بإجراء تحليلات كمية في الخلايا العصبية mechasensual PLM. DRP-1، وC. elegans orthologue من البروتين الثدييات ذات الصلة Dynamin 1 (DRP1)، والسيطرة على الانشطار الميتوكوندريا، حيث يتم تجنيد عند التنشيط من السيتوسول لتشكيل دوامة حول الميتوكوندريا، وتضييق وقطع في نهاية المطاف على حد سواء الأغشية الميتوكوندريا الداخلية والخارجية21،22. نحن تسمية الميتوكوندريا الفلورسنت مع ترانسجين الأنسجة محددة في الخلايا العصبية PLM، والتي لديها عملية طويلة axonal التي يمكن تصورها بسهولة باستخدام الفحص المجهري الظهارة. ويفترض فقدان الانشطار لتعطيل ديناميات الميتوكوندريا عموما، وبالتالي تقليل خلق أحدث، الميتوكوندريا أصغر من خلال عملية تعرف باسم الناشئة23.
قمنا بتجزئة سكواش لمقارنة مورفولوجيا الميتوكوندريا في الحيوانات المتحولة من النوع البري وdrp-1. قمنا بتحليل الميتوكوندريا من 6 الخلايا العصبية PLM لكل النمط الجيني، مما أدى إلى قيمة ن أكبر من أن 200 الميتوكوندريا لكل. تظهر الصور التخطيطية والتمثيلية في الشكل 5A، B. وجدنا أن المتحولين الذين يفتقرون إلى DRP-1 كان أكبر وأكثر ممدود الميتوكوندريا (الشكل5B-F). الميتوكوندريا في خلفية متحولة drp-1 كانت أكبر بنسبة 32٪ من النوع البري (P = 0.0006، الشكل 5C)،و 14٪ أكثر ممدود (أبعد من دائرة مثالية) (P < 0.0001، الشكل 5D). للحصول على تقييم أكثر تفصيلا ً للفرق في الحجم والشكل، قمنا برسم الرسوم البيانية لكل مقياس، وتركيب البيانات مع التوزيعات الغوسية (الشكل5E،F). وجدنا أنه بالنسبة لكل من الحجم والتعميم، كان للمتحولين الذين يفتقرون إلى البروتين الانشطاري تباين أكبر (p < 0.0001 لكليهما)، أبرزها وجود شبكات الميتوكوندريا/الميتوكوندريا الأكبر والأكثر ممدودًا (انظر الشكل 5Bii للاطلاع على أمثلة ). عموما، وجدنا أدلة تشير إلى أن طفرة drp-1 يسبب عدم وجود انشطار داخل الخلايا العصبية الحركة الشعبية لتحرير السودان، مما أدى إلى أكبر وأكثر ممدود الميتوكوندريا. كما أثبتنا أن تعطيل الانشطار الميتوكوندريا يسبب زيادة في الفرق في مورفولوجيا الميتوكوندريا.
الشكل 1: التحديد الكمي لسلامة المشبك في الخلايا العصبية للحركة الشعبية لتحرير السودان. (أ) الصور هي إسقاطات z القصوى لمنطقة متشابك ة الحركة الشعبية لتحرير السودان في حيواني غير مجِّل. تظهر اللوحة اليسرى الخلايا العصبية PLM وصفت مع tagRFP، يعرض الفريق الثاني المنطقة ما قبل متشابك وصفت مع SNB-1::GFP، والصورة الثالثة هي تراكب مع التعريب المشترك ممثلة باللون الأصفر، واللوحة الرابعة هي مخطط للصورة تراكب. (ب) الحد الأقصى من الصور البؤرية z-الإسقاط لمنطقة متشابك في الحيوانات الإفراط في التعبير MEC-17. يتم عرض الصور حسب اللوحة A. (C) حجم القياس الكمي للمنطقة ما قبل متشابك في غير المعدلة وراثيا بالمقارنة مع الحيوانات المعدلة وراثيا الإفراط في التعبير MEC-17. (د) التحديد الكمي لمستويات الفلورة المتكاملة النسبية للفترة من العمر إلى SNB-1::GFP في العوامل غير المحورة وراثياً مقابل الحيوانات المحورة وراثياً التي تُعبِّر عن الإفراط في التعبير عن MEC-17. بالنسبة لـ (C) و(D)، يتم تمثيل نقاط الاشتباك العصبي الفردية التي تم تحليلها بواسطة دوائر؛ ن ≥ 10؛ يعني ± S.E. هو مبين باللون الأسود. قيم P * < 0.05, ** < 0.01 من اختبارات tغير المقترنة; قضبان مقياس تمثل 2 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التصور من C. elegans عضلات جدارالجسم. (A) الحيوان الذي يعبر عن stEx30 (Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)) transgene، الذي يصف سلسلة ميوسين الثقيلة مع GFP في عضلات جدار الجسم. كما تحفز المجموعة النمط الظاهري المتداول في الحيوان الذي يسهل تصور خلايا العضلات مرتبة على طول الجانبين الظهري والبطني من الجسم. وجهات نظر مكبرة ممثل من ألياف الموسين في (B) البرية من نوع، (C) fzo-1 (cjn020)، (D) dyn-1 (ky51) و (E) unc-116 (e2310) الحيوانات. تم تصوير جميع الحيوانات في مرحلة الكبار البالغة من العمر 3 أيام. يمثل شريط المقياس 60 ميكرومتر في (A)، و30 ميكرومتر في (B-E). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: قياس مساحة عضلة جدار الجسم وطول الألياف باستخدام الخوارزميات الحسابيةالمتاحة. (أ) صورة توضيحية تبين كيفية رسم وحساب مساحة الفجوة الداخلية داخل خلية عضلية واحدة (مغلقة باللون الأحمر)، ومساحة الخلية بأكملها (الصفراء المغلقة) في فيجي للحصول على نسبة مساحة العضلات. (ب) مخطط بروتوكول التجزئة على صورة مثال واحد باستخدام مزيج من فيجي وilastik. شريط مقياس يمثل 30 درجة.
الشكل 4: التأهيل والقياس الكمي لعيوب العضلات جدارالجسم. (أ) التقييم البصري لعيوب عضلات جدار الجسم. (ب) مقارنة المساحة الفارغة بإجمالي نسبة مساحة خلايا العضلات بين الـ WT والمسوخ المشار إليها. (C) قياس طول ألياف الموسين. بالنسبة لـ (B) و(C)، تم تضمين الصور التي تحتوي على خلية العضلات المائلة المرئية الكاملة على الأقل للتحليل. كما استُبعدت الألياف التي يبلغ طولها 0 ميكرومتر أو أكثر من 250 ميكرومتر. تمثل القضبان النسبة المئوية للالحيوانات المعيبة في (A) والمتوسط ± S.E.M. في (B) و (C)؛ ن القيم المدرجة في كل شريط. تم إجراء اختبار تشي سكوير مع معدل اكتشاف زائف لمقارنة العيوب البصرية في (A)، في حين تم استخدام ANOVA في اتجاه واحد مع اختبارات دونيت بعد المقارنة المتعددة لتحليل القياسات الكمية في (B) و (C). *P < 0.05, ****P < 0.0001, ns = غير مهم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مورفولوجيا الميتوكوندريا داخل محاور الخلايا العصبية للحركة الشعبية لتحرير السودان. (أ) مخطط للميكروتوبيول الجانبي الخلفي (PLM) الخلايا العصبية المشانية الحسية في ذيل C. elegans. يشير المربع الأحمر إلى الموقع التقريبي للأقسام البارزة في (B)، والتي تظهر صور ًا تمثيلية للميتوكوندريا ذات العلامات GFP (Pmec-4::MLS::GFP) داخل محور الحركة الشعبية لتحرير السودان. الملتحمة الخضراء الزاهية تشير إلى الميتوكوندريا. بالمقارنة معWT (ط)، drp-1 (tm1108) المسوخ (2)تظهر أكبر ، أكثر ممدود الميتوكوندريا. الصور هي ممثلة n = 6 محاور PLM من 6 الديدان لكل النمط الجيني؛ قضبان مقياس = 15 ميكرومتر. (C) متوسط الحجم(ميكرومتر 2) من mitochondrion الفردية كما هو محدد كميا من قبل SQUASSH تجزئة الكائن في 3 أيام من العمر الكبار (3DOA) الديدان. (د) التعميم المتوسط للميثوشوندريون الفردي داخل محور الحركة الشعبية لتحرير السودان، على النحو الكمي من قياسات الأجسام SQUASSH في 3DOAs. (هـ) الرسم البياني وتوزيع الغوسيان يبينان التباين في حجم الميتوكوندريا. يظهر اختبار F (P < 0.0001) أن الفروق تختلف بشكل كبير بين drp-1 و WT. (F) الرسم البياني وتوزيع غاوسي يُظهر الفرق في دائرية الميتوكوندريا. يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط +/- SEM. *** P < 0.001, **** P <0.0001 من اختبار T ويلش; ن ≥ 204 الميتوكوندريا للتحليل الكمي من ن = 6 الديدان. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم السلالة | الجيني | مصدر | مرجع # | ||
| BXN038 | uIs115 (Pmec-17::tagRFP); jsIs609(Pmec-4::MLS::GFP) | مختبر نيومان | 7 | ||
| BXN366 | fzo-1 (cjn020)؛ myo-3 (st386); zdIs5 (Pmec-4::GFP); stEx30 (Pmyo-3:: gfp::myo-3 + رول-6 (su1006)) | مختبر نيومان | 20 | ||
| BXN419 | drp-1 (tm1108)؛ jsIs609 (Pmec-4::MLS::GFP); uIs115 (Pmec-17::tagRFP) | مختبر نيومان | 7 | ||
| BXN507 | cjnEx036 (Pmec-4::mec-17, Pmyo-2::mCherry); jsIs37 (Pmec-7::snb-1::GFP); لين-15B ولين-15A (n765)؛ uIs115 (Pmec-17::tagRFP) | مختبر نيومان | 17 سنة | ||
| BXN675 | unc-116(e2310)؛ myo-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: gfp::myo-3 + رول-6 (su1006)) | مختبر نيومان | 20 | ||
| BXN685 | dyn-1 (ky51)؛ myo-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: gfp::myo-3 + رول-6 (su1006)) | مختبر نيومان | 20 | ||
| NM664 | jsIs37 (Pmec-7::snb-1::GFP); لين-15B ولين-15A (n765) | [كنورهبديتس] مركز علم الوراثة | 6 | ||
| RW1596 | myo-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: gfp::myo-3 + رول-6 (su1006)) | [كنورهبديتس] مركز علم الوراثة | 8 | ||
| TU4065 | uIs115 (Pmec-17::tagRFP) | مارتن شالفي | 5 | ||
الجدول 1 قائمة سلالات C. elegans المستخدمة في هذه الدراسة.
| الحركة الشعبية لتحرير السودان صور axon | |
| الهدف | 40 x |
| دقة الصورة (لكل لوحة للتجانب) | 3224 x 3224 |
| حجم إطار إزالة الخلفية | 20 |
| PSF xy | 0.78 |
| PSF z | 0.68 |
| التسوية | 0.15 |
| الحد الأدنى من كثافة الفلورة من GFP | 0.4 |
الجدول 2 SQUASSH المعلمات لتقسيم الميتوكوندريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وكثيرا ً ما يتم تقييم الاختلافات المورفولوجية من خلال العد اليدوي للاختلافات الملحوظة أو باستخدام عتبات تعسفية لتحديد العيوب مقارنة بالنمط الظاهري الظاهري. ولكن في الآونة الأخيرة، استخدمت أساليب كمية للدراسات المقارنة للمورفولوجيا لقياس التغيرات على مستوى الخلايا ودون الخلوية ووصفها بدقة بطريقة غير متحيزة. القدرة على تحديد الاختلافات خفية ولكن ذات الصلة بيولوجيا بين الأنماط الظاهرية وسيلة قوية لفهم الآليات الجزيئية الكامنة التي تتحكم في التغيرات في مورفولوجيا الناجمة عن العوامل البيئية أو الأمراض الوراثية. الزيادات المستمرة في قوة الحساب ودقة التصوير المجهري، إلى جانب سهولة النمو وتعدد استخدامات علم الوراثة C. elegans وفرت منصة مثالية للمزيج من برامج التصوير المتطورة ولكن الحرة مع صور مفصلة مفصلة مفصلة. هنا، لقد أظهرنا طرق لتقييم وقياس حجم متشابك وتوطين البروتين، منطقة العضلات جدار الجسم وطول الألياف، ومورفولوجيا الميتوكوندريا في مجموعة من الخلفيات الوراثية.
وفي حين أظهرت هذه التحليلات وجود قدرة على قياس الاختلافات المورفولوجية الدقيقة، فإن هناك قيودا. وعلى الرغم من أن كل تحليل من هذه التحليلات يستخدم برمجيات مفتوحة المصدر ومتاحة بسهولة، فإنها تعتمد على صور عالية الجودة وحادة لحل الهياكل الخلوية والعضيات دون الخلوية بدقة. ويمكن أن يكون ذلك في كثير من الأحيان خطوة مقيدة، حيث أن المعدات الحساسة الراقية، مثل المجاهر البؤرية ذات الكاشفات المتقدمة، مطلوبة لالتقاط الصور بدقة مرضية. وهذه ليست دائما متاحة للمختبرات، ويمكن أن يؤدي التحليل باستخدام التكنولوجيا دون المستوى إلى نتائج غير دقيقة وغير قابلة للتكرار. وبالإضافة إلى ذلك، في حين أن كل تقنية تهدف إلى الحد من تحيز المجربة باستخدام خوارزميات الكمبيوتر، لا تزال هناك خطوات يمكن أن تنطوي على عنصر خطأ بشري. التعريف اليدوي للمتشابك باليد، والخطوط العريضة لمنطقة خلايا العضلات، والتحسينات المعلمة من تجزئة الميتوكوندريا عن طريق العين هي جميع المجالات التي يمكن تحسينها في هذا الصدد. ولتقليل فرصة حدوث خطأ بشري، يمكن إجراء دراسات بطريقة عمياء أو بدلا ً من ذلك يمكن استخدام برامج تحليل الصور لتحديد المنطقة التي تهم نفسها. استخدام أقنعة الخلية، التي يتم تعريف المنطقة المطلوبة للتحليل من قبل الفلورة في الطول الموجي مختلفة، قد تساعد على هذا. يتم استخدام هذا لقصر التحليل على مقطع من صورة تعرض الفلورة فوق عتبة محددة، مثل نواة الخلية أو خلية مُنقّبة13أو24. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام صور نقطة زمنية واحدة يحد من الأسئلة التي يمكن أن تعالجها هذه التقنيات. العمليات التي تحكم مورفولوجيا الأعضاء، وتشكيل متشابك وهيكل العضلات هي على الأرجح ديناميكية، ويمكن رؤية الاختلافات داخل الخلية نفسها اعتمادا على الحالة التنموية أو البيولوجية. وبالتالي فإن تحليل هذه الهياكل عند نقطة نهاية محددة يمكن أن يكون مقيدا، وسيكون التصوير بالفاصل الزمني مفيدا لرصد التغيرات الهيكلية على مر الزمن. وأخيرا، في حين أن التغييرات المورفولوجية يمكن أن تكون مؤشرا جيدا على اضطراب في العمليات الخلوية، والارتباط ليس دائما ضمني. على سبيل المثال، أظهرت النتائج الأخيرة في أنواع مختلفة أن وظيفةالميتوكوندريا والشكل يمكن في الواقع أن ينفصل 7،25. ولذلك، يجب أن تؤخذ في الاعتبار الاختبارات الإضافية عند استنتاج التغيرات الوظيفية نتيجة للاختلافات المورفولوجية.
وقد تمكنا من إثبات استخدام هذه التقنيات الكمية في مجموعة معينة من الأنسجة والخلفيات الوراثية؛ ومع ذلك، يمكن تطبيق استخدامها على نطاق أوسع. يمكن استخدام القياس الكمي الفلوري عن طريق برامج التصوير لتحليل مجموعة من العضيات شبه الخلوية المختلفة مثل النوى والبطانة، أو هياكل مختلفة مثل الخلايا العصبية والخلايا الظهارية، كل ذلك في سياق متحولة مختلفة أو مرض الخلفيات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما مصالح متنافسة.
Acknowledgments
نشكر أعضاء مختبر نيومان على المناقشات القيمة والمدخلات. وقدمت بعض السلالات من قبل CGC، التي تمولها مكتب المعاهد الوطنية للصحة من برامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). يشكر المؤلفون WormBase على ثروتها من المعلومات عن C. elegans، وينوه موناش التصوير الصغير ، جامعة موناش ، لتوفير الأجهزة والتدريب والدعم التقني. وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح البحثية لـ CMTAA (2015 و2018)، ومنح مشروع NHMRC 1101974 و1099690 المقدمة إلى B.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. , (1974).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
- Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
- Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
- Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
- Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
- Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
- Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
- Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
- Teoh, J. -S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
- Bird, T. D. Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , GeneReviews [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2019. [Updated 2016 Apr 14] Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1285/ (1998).
- Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
- Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
- Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
- Zhu, P. -P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
- Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
- Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
- Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).
