Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

Published: July 5, 2019 doi: 10.3791/59978
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Neuroscience Program, Monash Biomedicine Discovery Institute and Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, Melbourne VIC 3800, Australia.
* These authors contributed equally

Summary

מחקר זה מתאר את המידות הכמותיות של גודל ולוקליזציה, מורפולוגיה שרירים וצורה מיטוכונדרילית ב -C. אלגיה באמצעות כלים זמינים לעיבוד תמונות באופן חופשי. גישה זו מאפשרת לימודים עתידיים ב -C. אלגיה להשוות בין היקף רקמות ושינויים מבניים כתוצאה מוטציות גנטיות.

Abstract

הגדרת מנגנוני הסלולר שבבסיס המחלה חיונית לפיתוח therapeutics הרומן. אסטרטגיה המשמשת לעתים קרובות לפענח מנגנונים אלה היא להחדיר מוטציות בגנים המועמדים ולתאר באופן איכותי שינויים במבנה של רקמות ומרקלים סלולריים. עם זאת, תיאורים איכותניים לא יכולים ללכוד הבדלים עדינים, אולי באופן שונה וריאציות פנויואיות על פני אנשים באוכלוסיה, והם מוערך לעתים קרובות סובייקטיבי. כאן, גישות כמותיים מתוארות כדי ללמוד את המבנה של רקמות ואורגלים באלאואודה caenorditis באמצעות סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלית וקד בשילוב עם תוכנות ביולוגיות זמינות מסחרית עיבוד. ניתוח כמותי של פנוטיפים המשפיעים על שלמות הסינפסה (גודל ורמות זריחה משולבת), פיתוח שרירים (גודל תא השריר ואורך הפילמנט רירן), ומורפולוגיה מיטוכונדריאלי (מעגליות וגודל) בוצעה כדי להבין ההשפעות של מוטציות גנטיות על אלה מבנים סלולריים. גישות כמותיים אלה אינן מוגבלות ליישומים המתוארים כאן, שכן ניתן להשתמש בהם כדי להעריך את המבנה של רקמות אחרות ואורגלות בתוך הנימטודה, כמו גם באורגניזמים אחרים במודל.

Introduction

האלמטדה (האלאים) מנוצל יותר ויותר כמערכת מודל לחשיפת התהליכים הביולוגיים והמולקולריים המעורבים במחלות אנושיות. נמטודות מבוגר יש אורך הגוף של רק מעל 1 מ"מ, והוא יכול לייצר דגירה גדולה של עד 300 ביצים1. לאחר בקיעה, הג דורשים רק 3-4 ימים כדי להגיע לבגרות, ולחיות במשך כ 2-3 שבועות2. בשל קלות התפירה, הג הוא אחד המבוקשים ביותר בדגמי בעלי חיים vivo לביצוע הקרנת סמים מהירה וחסכונית כדי לזהות therapeutics למחלות אנושיות. בנוסף, שימור גנטי שלה, הגדרה התנהגות היטב, גוף שקוף עבור מיקרוסקופ אור פלואורסצנטית או קל, וקלות של מניפולציה גנטית להפוך את המחקר של ההשלכות הסלולר והמולקולריים של מוטציות גנטיות בקלות achieveable 3. הגנום C. אלגיה מניות כ 60-80% האורתולוגיה עם הגנים האנושיים, וכ-40% מהגנים האלה ידועים כקשורים למחלות. כמה מחלות אנושיות שהיו מדגם ולמדו בג כוללים הפרעות ניווניות (מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, טרשת amyotrophic לרוחב, charcot-מארי-שיניים מחלות), מחלות הקשורות שרירים ( ניוון שרירים duchenne), ומחלות מטבולית (היפרגליקמיה)2,4. ברוב ההפרעות האנושיות, התאמה לוקליזציה תאית וארגונית מחלות ושינויים מורפולוגיים מתרחשים, אשר ניתן בקלות להעריך במודל נמטודות.

סמנים פלורסנט השתמשו באופן נרחב כדי לתייג רקמות ואורגלים להדמיה דינמית מתחת למיקרוסקופ. עם זאת, ב -C. אלגיה, שיטות קונבנציונליות להערכת אי סדירות מורפולוגית בשל מוטציות גנטיות הסתמך במידה רבה על תיאורים חזותיים. בעוד ההערכות האיכותניות יכולות לכסות טווחים רחבים יותר של תיאורים פנותטיים (מורפולוגיה סינפטית, מקלפת מערכות ה-GFP, צורה מסוימת של האקסון, עובי סיבי השריר, וכו ') ולספק את ההשקפה של עין הציפור של שינויים מורפולוגיים, הם פחות מתאימים השוואת וריאציות קטנות בין קבוצות שונות. יתרה מזאת, הערכות איכותניות מבוססות על הערכה חזותית וסובייקטיבית, שעלולה להוביל לחריגה או מתחת להערכות של חריגות מורפולוגיות. לבסוף, תצפיות איכותניות יכולות גם להשתנות במידה רבה בין אנשים, יצירת קשיים עם שכפול נתונים.

בשנים האחרונות, מספר אלגוריתמים ידידותיים למשתמש, הזמינים בקלות, שיכולים לנתח את התמונות באמצעות כימות. עם זאת, הניצול של תוכנה כגון ניתוח תמונה עבור כמה מחקרים מורפולוגיים, במיוחד ביחס שרירי קיר הגוף והמיטוסים, ב C. מחקרים המחקר הפכה מאחור. כדי לשפר את הניתוח המבני הבסיסיים ב -C. אלגיה, חלק מתוכנת ניתוח התמונה הפתוחה, הקוד הפתוח, היתה שבירה להשוות את ההשפעות של מוטציות גנטיות על המיטו, שריר קיר הגוף וסינפטית ורפולוגיה. אלה הליכים ניסיוניים לתאר בפרוטרוט כיצד תוכניות אלה (פיג'י, אילאסטיק, cellprofiler, squassh) ניתן להשתמש כדי להעריך את השינויים בגודל סינפטית ולוקליזציה של חלבון סינפטית, שריר קיר הגוף באזור ואורך סיבים, וגודל מיטוכונדריאלי ו מעגליות כתוצאה של מוטציות גנטיות ב nematode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. צמיחה ואחזקה של C. אלגיה זנים

  1. זרעים Nematode צמיחה בינונית (NGM, לראות את הטבלה חומרים) אגר צלחות עם 300 μl של החיידק הגדל איטי OP50 זן בארון זרם למינארי.
  2. השאירו את לוחות NGM אגר בארון הזרימה למינארי להתייבש.
    הערה: בהיעדר ארון זרימה למינארי, ניתן להשאיר צלחות להתייבש על הספסל, אך הן נוטות יותר לזיהום.
  3. העברה לפחות 20 בעלי חיים לכל אחד משני OP50-שופרה לוחיות העבודה של NGM אגר כדי להיות מניות עובד. יש שתי דרכים עיקריות. להעביר בעלי חיים
    1. לקטוף: להרים בעדינות את החיות באמצעות בחירת חום מעוקר. שיטה זו יעילה לבחירת בעלי חיים בודדים או מרובים מצלחת אגר. לאחר שריטה קטנה של חיידקים בקצה בעת איסוף מסייע העברה.
      הערה: הפיק עשוי מחתיכת חוט פלטינה באורך של כ-4 ס מ המוטבע בפיפטה זכוכית, כאשר החוט משוטח להיות ' חנית '. החום מחטא את האפשרות בין קטיף. כדי למנוע זיהום צולב
    2. Chunking: באמצעות מרית מחוטאת, חותכים ריבוע קטן של אגר המכיל את בעלי החיים מצלחת אחת והעביר הפוך לצלחת חדשה.
      הערות: שיטה זו שימושית בדרך כלל להעברת מספר גדול של תולעים, ולהסיר זיהום מצלחות באמצעות סיבובים מרובים של אגר לא מזוהם של chunking. להימנע מפני זיהום על ידי בוער המרית כמה שניות ולאשר את המרית ב 100% אתנול בין העברות. העברת מצלחות מורעבים אינה מומלצת כרעב וצפיפות יתר יכולה להשפיע על הבריאות והמבנה של מבני הסלולר והתת.
  4. שמרו על התולעים בטמפרטורת הצמיחה הסטנדרטית (20 ° c). כדי להבטיח אספקה רציפה של תולעים מוזנים היטב, העבירו את התולעים ללוחות הOP50 החדשים מדי 2 עד 3 ימים.

2. הגיל-סנכרון ג. אלגיה

  1. לשמור על תולעים על 3-4 NGM צלחות עד האוכלוסייה היא צפופה אבל לא רעב.
  2. לשטוף בעדינות את התולעים את הצלחת NGM עם פתרון M9. הביצים יישארו על הצלחת מאז הם לדבוק E. COLI OP50. חזור על הפעולה עם ארבעה צעדי כביסה נוספים כדי להסיר את כל החיות המקווקו.
  3. לאפשר לתולעים לבקוע עבור 40 דקות.
  4. הוסף 1-2 mL של פתרון M9 לצלחת ומערבולת בעדינות כדי לשחרר תולעים מקווקו לאחרונה.
  5. לאסוף את הפתרון M9 עם תולעים שנולדו לאחרונה ולהעביר את הפתרון עם תולעים לצלחת NGM טריים.
  6. לאפשר פתרון M9 להתאדות על ידי חשיפת צלחת NGM לאוויר. לעשות את זה ליד להבה פתוחה כדי למנוע זיהום של צלחת NGM.
  7. הגדל את התולעים במשך 27 שעות ב -20 ° c כדי לאפשר פיתוח לשלב הזחל השלישי (L3). עבור מסונכרנים בעלי חיים בוגרים בן 3 ימים, התולעים נאספו בשלב הזחל 4, גדל למשך 3 ימים נוספים כדי להגיע לשלב המבוגר בן 3 ימים.

3. הכנת שקופיות להדמיה

  1. הכינו 3-4% w/v agarose מניות בבקבוק בטוח מיקרוגל (3-4 g ב 100 mL של מים באולטרסאונד).
    הערה: ניתן להשתמש באגר במקום של העלה באותו ריכוז.
  2. ממיסים את הצמח בזהירות במיקרוגל, מטפלים לא מעל הרתיחה, עד שהכול מתמוסס (פתרון ברור). שמור על הפתרון ב 70 ° צ' כדי למנוע מיצוק.
    הערה: ניתן להשתמש במלאי Agarose מספר פעמים. החום לפני השימוש אם הצמח התחזק.
  3. באמצעות הפיפטה פסטר, מניחים טיפה של הצמח נמס על שקופית המיקרוסקופ.
    הערה: להימנע מהצורך בועות אוויר טיפה של אגר כמו אלה לשבש את היושרה של הפנקס.
  4. לחצו מיד את ה-droplet עם מגלשת מיקרוסקופ אחרת, שיטוח בעדינות את הצמח לתוך משטח בין שתי השקופיות.
    הערה: יש להסיר את כל הבועות הנותרים בשלב זה. אם לא, שקופיות חדשות יש לעשות כמו בעלי חיים יכולים בקלות להיתקע בועות. להימנע מגלישה של אגר בצד בעת לחיצה על השקופית.
  5. להשאיר את הצמח להתייבש במשך 1 דקות.
  6. הפרד בזהירות את שתי השקופיות כדי למנוע נזק לצמח, תוך השארת הלוח המתחזק באחת השקופיות.
    הערה: יש להכין שקופיות עם תחבושות מוכנות תמיד טריות בדיוק לפני הניסוי כפי שניתן לייבש. ודא שלוח האגקם מכיל עובי עקבי. לא צריך להיות בועות אוויר או סדקים בתוך הלוח כמו זה עלול להפריע הדמיה.
  7. הוסף טיפה קטנה (5-10 μL) של 0.05% הידרוכלוריד (הרדמה) למרכז של כרית agarose.
  8. באמצעות חום-מעוקר לקטוף, במהירות להעביר כ 10-15 בעלי חיים מלוח המניות ל-droplet הרדמה לפני הפתרון מתייבש. הימנע להעביר יותר מדי חיידקים OP50 זה עושה את הפתרון מעונן, אשר יכול להפריע הדמיה.
    הערה: אם פתרון ההרדמה מתייבש תוך כדי הקטיף, פשוט הפיפטה השני של 0.05% הידרוכלוריד על החיות. בעלי החיים נוטים לשכב על הצד הצדדי שלהם בתמיסה של ההרדמה.
  9. החלת שמיכות על ידי מיקום אותו מעל הלוח הגבוה ובעדינות להפיל אותו. זה ימנע היווצרות של בועות. לא להחיל לחץ על שמיכות כי זה עלול למחוץ את החיות.
  10. סמן את השקופיות עם שם הנבג.

4. הערכת מורפולוגיה סינפטית

הערה: ההשפעות של הביטוי היתר של MEC-17 על שלמות סינפסה בתוך מיקרוכדורית לרוחב האחורי (plm) קולטן לגעת נוירונים נחקרו על ידי כימות את הגודל הסינפטית ולוקליזציה באמצעות שורה סריקת קונפוקלית מיקרוסקופ. הנוירונים PLM (כולל אזורי סינפטיות) היו דמיינו באמצעות uIs115 (pmec-17:: tagRFP) transgene (זן: TU40655) ואת האזור סינפטית היה מתויג במיוחד עם jsIs37 (pmec-7:: SNB-1:: GFP) (זן: NM664 5 מטריםלשעה . מחקר זה בוצע מסונכרן הבלתי-טרנסגניים ובעלי חיים טרנסגניים של כרומוזום משני מסוג MEC-17 ביטוי overexpression [cjnEx036 (Pmec-4:: MEC-17, Pmyo-2:: mCherry); jsIs37; uIs115]7. רשימה מלאה של זנים המשמשים במחקר זה נכלל בטבלה 1.

  1. הדמיה קונמיקוד של הסינפסות של קולטן מגע
    1. כדי לדמות את אזורי סינפטית, להשתמש קו סריקת מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצמידים 488 ננומטר ו 552 ננומטר שאוב semi-מנצח דיודות לייזר דיודה מצויד עם תוכנה לכידת תמונה.
    2. אתרו את התולעים בהגדלה הנמוכה ביותר.
    3. כאשר בעלי החיים ממוקמים בהצלחה, לעבור להגדלה 40X ולהחיל בינונית טבילה (במחקר זה: 40X/1.10 HC PL CS2 היעד רב מקיפה עם טבילה במים היה בשימוש).
    4. המחש את אזור הסינפטיות על ידי מרגש fluorophores עם 488 ננומטר לייזר (2% כוח) עבור GFP fluorop, ו 552 nm (1% כוח) עבור tagRFP fluorop,.
    5. קביעת מסגרת x ו-y אופטימלית ללכידת אזור הסינפטית כולו. הקפד לשקול את גודל הפיקסל האופטימלי בעת בחירת המסגרת. במחקר זה, גודל פיקסל עקבי של 56 nm הושגה.
    6. לכידת תמונות באמצעות גלאי תמונה היברידית ולהגדיר את רווחי כדי למנוע חשיפה יתר של fluorophores (100% עבור 488 העירור ננומטר ו 15% עבור 552 ננומטר הריגוש).
    7. לאסוף תמונות z-מחסנית כדי לכסות את הסינפסה כולו, באמצעות גודל הצעד האופטימלי z בהתאם למטרה הספציפית בשימוש. במחקר זה, בגודל מיטבי z-step של 0.211 ננומטר שימש.
      הערה: ודא שכל התמונות מצולמות בתנאים מחמירים כדי לאפשר כימות קרינה והשוואה של משולב. זה יכול להיעשות על ידי שמירה על פרמטרים מיקרוסקופית זהה בכל התמונות שנתפסו (כלומר, הגדרות לייזר וגלאי, גודל פיקסל, מהירות סריקה, וגודל מיטבי z-step). הגדרות אופטימליות תלויות במטרה וניתן לחשב אותן באמצעות תוכניות ביואינפורמטיקה נגישות, כגון מחשבון נייקוויסט (https://svi.nl/NyquistCalculator). הוספת תוויות לתמונות באופן שיטתי, פעולה זו תהיה שימושית בעת השימוש בתוכנה ביואינפורמטיקה שתארגן ותעבד קבצים המבוססים על שם קובץ.
  2. קוונפיקציה של האזור הסינפטית
    1. כדי לנתח את אזור הסינפטיות, לייצא תמונות כקבצי TIFF. ניתן להשתמש בתוכנת עיבוד הדמיה מבוססת Java, כגון ImageJ, (במחקר זה, שימוש במאקרו המרת תמונת MRI ב-ImageJ).
    2. הגודל ואת רמות העוצמה של הקרינה הפלואורסצנטית משולבים של הסינפסות נמדדו מעוצמת הסכום של ז ' ה שהושגו-ערימות עם CellProfiler-3.1.5. לטעון את התמונות לתוך תוכנת CellProfiler 3.1.5. במקרה הצורך, ניתן לסנן תמונות בהתבסס על שמות של קובצי תמונה.
    3. הגדר את המודול ' שם וסוג '. לחלופין, חלץ את המטא-נתונים מתווית התמונה כדי לארגן נתונים מחושבים בהתאם.
    4. לקבוע את האזור סינפטיות בהגדרה יד של אזור זה באמצעות tagRFP מפוזר מבוטא uIs115 (Pmec-17:: tagrfp) transgene. זה יכול להיעשות על ידי הוספת מודול לגבי הצינור CellProfiler-3.1.5.
    5. כדי למדוד את הגודל ואת הקרינה הפלואורסצנטית מוגדרת היד המוגדרת, להוסיף את גודל האובייקט ואת הצורה ולמדוד את מודול עוצמת האובייקט לצינור.
    6. חשב את עוצמת הזריחה המשולבת היחסית על-ידי הוספת המודול חישוב מתמטי . לחלק את יחידות אינטנסיביות משולב שהתקבלו מ jsIs37 (Pmec-7:: snb-1:: GFP) על ידי יחידות משולבות שהתקבלו עבור UIs115 (pmec-17:: tagrfp).
    7. ייצוא מדידות וחישובים.

5. מבנה שריר קיר הגוף

  1. הדמיה פלואורסצנטית של מבנה הגוף שריר קיר
    1. להשיג זן (למשל, RW1596) נושאת את StEx30 הטרנסגנים (Pmyo-3:: gfp:: myo-3 + rol-6 (su1006))8, אשר תוויות רירן סיבים עם gfp.
      הערה: מבוא של הטרנסגנים לבעלי חיים יכול להיות מושגת על ידי חציית מתח של עניין עם בעלי חיים שכבר מבטאים את המשגר, או הזרקת דנ א לזרוע המרוחק של הגונאדה. "מתגלגל" הפנוטיפ שנגרם על ידי rol-6 מוטציה ב-transgene זה מאפשר את ההדמיה של השרירים. שרירי הקיר הגוף לרוץ לאורך הצדדים הגוגאיים כי הם בדרך כלל מנעה מן התצוגה בחיות מסוג פראי כי הם בדרך כלל לשכב על אחד הצדדים שלהם לרוחב. ה -rol-6 (su1006) אלל גורם לפיתול של בעלי החיים, ובכך לחשוף כמה תאי שרירים להדמיה.
    2. התמונה בעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית בשילוב עם ברזולוציה גבוהה טעונה מצמידים המכשיר מצלמה (CCD), 40X אובייקטיבי או גבוה יותר, מסנן GFP ותוכנה לרכישה.
    3. התאימו את זמן החשיפה ואת עוצמת התאורה כדי למנוע תמונות רוויה.
    4. לכידת ושמירה של תמונות של השרירים (400 x הגדלה) מקטע של בעל החיים המכיל לפחות אחד מושלם לראות תא השריר האלכסוני. הימנע מאזורים בעלי תא שריר יחיד שאינו שלם או מקטעים שאינם מרוכזים. גם להוציא תמונות מאזורים הקדמי והאחורי קיצוניים, ואזורים הסמוכים הפות.
      הערה: אם לבעל החיים אין תא שריר מושלם לעין, החלק בעדינות את הכיסויים כדי להפוך את בעל החיים כדי לחשוף תא שלם.
  2. מדידה של שטח תא שריר
    1. פתח את התמונה בתוכנת פיג'י9 (גירסה 2.0.0 שימש במחקר זה).
    2. השתמש בקטע המצולע כדי לעקוב בזהירות מסביב לתא שריר בודד אלכסוני. כוונן את קו המצולע בסוף על-ידי גרירת נקודת העיגון כדי לשפר את העקיבה.
    3. עבור לניתוח לשונית בחלק העליון של התוכנה ולחץ על מדידה כדי לחשב את אזור הבחירה. טבלת תוצאות נפרדת המכילה את האזור ומדידות אחרות יוצגו. אם מדידת האזור חסרה בטבלת התוצאות, עבור לקביעת המידות תחת הכרטיסיה ניתוח ובדוק שתיבת האזור מתיקלת. כמו כן, פרוש מדידות אחרות שאינן נחוצות.
    4. עבור תאי שריר עם אזור מנוון/חסר, עקוב אחר האזור החסר באמצעות כלי בחירת המצולע ולחץ על מדידה שוב. אם יש מספר מרווחים בתא, עקוב אחר כל מרווח בנפרד.
    5. לחשב את היחס של אזור הפער על כל תא שריר יחיד. יחס גבוה מעיד על מידה גבוהה יותר של ניוון שרירים עקב פערים גדולים בתוך התא. אם אין אזורים חסרים, כפי שניתן לראות בחיות מסוג פראי, היחס יחושב כאפס.
      הערה: כפקד, ציון גם עבור פגמים במבנה השריר חזותית ולהשוות את התוצאות עם המדידה הכמותית. זה שימושי במיוחד אם המתח הוא לומדים בפעם הראשונה במעבדה. העריכו את החיות כפגומות או לא-פגומות בהתבסס על שלמות החוטים. לדוגמה, בעלי חיים עם אובדן של סטריציות פילמנט ברורים, הגפינג של GFP, או פערים בתוך תאי שריר עקב התמוטטות מבנית, יהיה הבקיע כמו פגום.
  3. פילוח וקוונפיקציה של אורך סיבים רירן
    1. במקרה הצורך, המירו תחילה קבצים. טיף באמצעות פיג'י או חבילת תוכנה אחרת. שמרו את קובצי ה-TIFF במיקום הרצוי.
    2. פתח ilastik10 (תוכנה חופשית, גירסה 1.3.2 ניתן להוריד מ https://www.ilastik.org/).
    3. במהלך ilastik, בחר בסיווג הפיקסלים תחת צור פרוייקטחדש. התוכנה תציג בקשה לשמירה על הפרוייקט. שנה את שם הפרוייקט ושמור אותו במיקום הרצוי.
      הערה: יש ליצור פרוייקט חדש רק פעם אחת בלבד. פילוח הבא ניתן לבצע באמצעות אותו פרוייקט. כדי להשתמש באותן הגדרות פרוייקט, עבור אל הכרטיסיה פרוייקט בחלק העליון ולחץ על ' פתח פרוייקט ' כדי לגשת לקובץ project.
    4. צריך להיות 5 כרטיסיות בלוח השמאלי (נתוני קלט, בחירת תכונה, הדרכה, חיזוי ייצוא ועיבוד אצווה). בכרטיסיה נתוני קלט, לחץ על הוסף חדש ולאחר מכן הוסף תמונה (ות) נפרדת. כוונו את החלון המוקפץ לתיקייה המכילה את קובצי TIFF ובחרו בתמונה לפתיחה.
    5. בכרטיסיה הבאה שלהלן (בחירת תכונות), לחץ על בחירת תכונות כדי לבחור את כל תכונות הפיקסלים, המצוין על-ידי תיבות תיקקות ירוקות. בחירת הפיקסלים בשלב זה משמשת להבחנה בין מחלקות הפיקסלים השונות בשלב הבא.
      הערה: בחירת תכונת הפיקסלים תלויה ברזולוציית התמונה. מכאן, המפתחים מציעים לבחור את כל או כמה תכונות ככל האפשר, אם הכוח עיבוד היתר הזמן.
    6. לוח ההדרכה הבא מאפשר סיווג של מחלקות אובייקטים שונות המבוססות על פיקסלים. במקרה זה, שני השיעורים הם בודדים GFP הביע רירן סיבים ורקע בלתי רצוי או קצוות מטושטשים. לחץ על הוספת תווית כדי לקבל את התווית הראשונה. החלה על מספר חוטים. להתחלת הכשרת מסווג
      הערה: לחיצה כפולה על התווית מאפשרת שינוי שם (לדוגמה, שינוי שם ' תווית 1 ' ל-' פילמנט '). לחיצה כפולה על התיבה הצבעונית מאפשרת צבעים לשרטוט ולהצגת ההסתברות שישונו. גודל ברירת המחדל של מברשת הצבע הוא 1, למרות שהגודל יכול להיות מוגבר ל-61. אם הפיקסל הלא נכון צויר, פשוט השתמש בכלי מחק כדי להסיר את הציור. ניתן להשתמש בפקדי לוח מקשים (-) ו-(Shift +) כדי להגדיל ולהקטין את התמונה, בהתאמה. מקשי החיצים משמשים לניווט סביב התמונה.
    7. הוסף תווית שניה ושנה את שמו לרקע. השתלי מעל רקעים וחללים לא רצויים בין החוטים.
    8. לחץ על עדכון חי וודא שסיווג זה נעשה על-ידי התוכנה כהלכה. הוסף יותר scrawls ולכוונן את האימונים במידת הצורך.
      הערה: חשוב לפקוח עין על סיבים ממוזגים וקצוות מטושטשים (כגון קו גוף) בשלב זה. שפר את התחזית כאן ככל האפשר כדי להגדיל את הדיוק של מדידות. הדיוק חיזוי תלוי גם ברזולוציית התמונה, כמו פיקסלים באיכות נמוכה יותר קשה יותר להקניט בנפרד. הוא גם אופציונלי, אך מומלץ להפעיל את שיטת הסינון בפונקציה ' הצע תכונות ' לצד ' בקרת עדכון חי '.
    9. לאחר מסווג הכשרה התבצע כראוי, ללכת התחזית ייצוא פאנל. לחץ על בחר באפשרות ' ייצוא הגדרות תמונה ' עם הסתברות למקור.
    10. השתמש בהגדרות הבאות. החלק החתוך x ו- y תיקתק, ו- c ביטול התיקתק. ערכי ההתחלה והעצירה עבור c צריכים להיות 0 ו-1, בהתאמה. לתקתק ולהמיר סוג נתונים בהמרות ל-8 סיביות לא חתומות, לסמן את הפקודה [min, max] ולהשתמש בערכי ברירת המחדל. שנה את התבנית של וידאו קובץ הפלט ל-PNG, ושנה את שם הקובץ והספריה כרצונך.
    11. סגור את חלון הגדרות הייצוא וייצא את התמונה הספציפית שכרגע מחולקת.
    12. פתחו את תמונת ה-PNG השמורה בתוכנת פיג'י. התמונה אמורה להופיע בשחור-לבן.
    13. כוונן את סף התמונה באמצעות הגדרות ברירת המחדל.
    14. החל את תוסף השלד (2D/3D, ולאחר מכן לנתח שלד). טבלה נפרדת של תוצאות תוצג, הכוללת אורך ענף. אורך הענף מייצג את אורך הסיבים. נתונים אחרים בתוצאות יכולים גם להיות שימושיים, כגון מרחק אוקלידי.
      הערה: השמט סיבים באורכים של 0 יקרומטר או יותר מ-250 יקרומטר, מכיוון שמידות אלה אינן אפשריות בבחינה פיזיולוגית.

6. מורפולוגיה מיטוכונדריאלי

הערה: לקוונפיקציה של מורפולוגיה מיטוכונדריאלי, מחקר זה השתמשו BXN0387 זן המכיל את UIs115 (pmec-17:: tagrfp)5 העברה כדי להמחיש את נוירונים Plm ו jsIs609 (pmec-4:: MLS:: gfp)11 להמחיש המיטומטר במיוחד בתוך הנוירונים PLM. מחקר זה בוצע מסונכרן בגיל 3 יום תולעים בוגרים, אבל בוצע בהצלחה בגילאים אחרים, כמו גם ברקמות אחרות7.

  1. הדמיה פלואורסצנטית של המיטומטר בתוך הנוירונים PLM
    1. כדי למדוד גודל וצורה שינויים של המיטו, בתוך הנוירונים PLM, להמחיש הן את העצב הרקע ואת המיטומטר באמצעות הניאון הטרנסגנים.
    2. כדי לצלם את תא העצב plm, להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלית מצמידים ל488 ננומטר ו 552 ננומטר שאוב למחצה דיודה לייזר דיודות מנצח מצויד בתוכנה לכידת תמונה.
    3. צלם את התולעת לפי שלבים 4.1.1-4.1.4 לעיל, והבטחת תנאי חשיפה לא מ.
    4. כדי להמחיש את כל העצב, ייתכן שיהיה צורך בתמונה מרוצפת. כדי להשיג זאת, השתמש בתוכנה עם אפשרות לסרוק אריח כדי לאתר ולשחרר סמן בפינה אחת של תא העצב ולאחר מכן לאתר את הקצה הנגדי ושחרר את הסמן השני. התוכנה יחשב את המספר האופטימלי של אריחים הדרושים כדי ללכוד את האזור הנדרש.
      הערה: כדי להקטין את זמן הסריקה, לעתים קרובות קל יותר לאתר נוירונים העוקבים אחר מישור אחד, והתוצאה היא פחות אריחים.
    5. לזוג את סריקת האריח עם מחסנית Z, קבעו את המגבלות הנמוכות והעליונות לפני תחילת סריקת האריח, וודאו שגודל הפרוסה האופטימלי מוגדר.
    6. להבטיח רזולוציה ממוטבת, כמו פילוח יהיה מעודן יותר עם רזולוציות גבוהות יותר (כאן, ברזולוציה של 3224 x 3224 פיקסלים נעשה שימוש).
      הערה: בעוד uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) transgene משמש כדי לסמן את plm ובהצלחה למקם את המצלמה, זה לא בהכרח צריך להיות מצולם בשל הזריחה ברקע קל נצפתה מן JsIs609 (pmec-4:: MLS:: gfp) בתוך האקסון של PLM. לפיכך, ניתן לצמצם את זמן הסריקה וההדמיה על-ידי הסרת מסנן 552 ננומטר מהניסוי.
  2. מקטעי אובייקט באמצעות SQUASSH
    1. להמיר קבצי תמונה לתמונות . tiff וליצור הקרנות אינטנסיביות מקסימלית מ-Z-ערימות באמצעות תוכנת הדמיה של פיג'י. חתוך תמונות לגודל המינימלי תוך שהוא עדיין מכיל את תא העצב המלא כדי להפחית את העומס החישובית ולהפחית את רעשי הרקע.
      הערה: עבור תוצאות הנציג, רק המיטוטרים בתוך התהליכים הארוכים של האקסון נחשבו, כך גוף התא וכל המיטו, בתוך לא נכללו כל תמונה.
    2. בעזרת מאקרו הפסיפס SQUASSH עבור ImageJ, בצע פיצול ברגמן מפלח12 על התחזיות המרביות. מדריך מפורט להתקנה וליישום של מאקרו זה זמין באתר הפסיפס (http://mosaic.mpi-cbg.de/) והמתואר על ידי ריזק ואח ' 201413. התהליך של פילוח תמונה מתואר בקצרה להלן.
      הערה: פילוח זה מזהה אובייקטים (במקרה זה מיטוכונדניים בודדים) על הסף של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית, ומאפשר מדידה מדויקת של כל גודל וצורה של אובייקטים בודדים.
    3. הסרת רעשי רקע מתמונה באמצעות שיטת הכדור המתגלגל, בה משתמש חלון המוגדר על-ידי המשתמש על-פני התמונה ומחזק את אומדן עוצמת הרקע המקומית מהעוצמה הנפוצה ביותר בכל חלון. פעולה זו מתקנת עוצמות רקע שאינן מכוונות.
    4. השתמש בזיהוי אובייקטים כדי למצוא בערך אזורים של התמונה המכילים אובייקטים (מיטוכונמיטוa) של עניין, בהתבסס על עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית ומספר הפיקסלים. הפרמטרים השולטים בשלב זה הם הסדרה ועוצמת העצם המינימלית.
      הערה: הסדרה משמש כדי למנוע הפחתת עוצמה קטנה, פסגות מושרה ברעש, ואת סף עוצמת העצם המינימלי מסייע להגדיר את האורגלים התאיים מפני הזריחה של רקמת הרקע. אלה הם שני הפרמטרים העיקריים כי הם מניפולציות כדי למצוא מפלח אופטימלי של המיטו, ואת תהליך האופטימיזציה נוטה להיות ניסוי וטעייה של פרמטרים שונים עבור תמונת מבחן, ואחריו בדיקה ידנית.
    5. השתמש בתוכנה כדי להעריך את עוצמות הרקע המקומיות סביב כל אובייקט כדי לסייע בחישוב של פילוח אופטימלי.
    6. מדידת עצמים בודדים עבור גודל, היקף, אורך באמצעות מספר פיקסל, כמו גם עוצמת אות ומיקום x/y על התמונה. כדי לחשב את המידות בגודל (nm), פקטור בגודל הפיקסל של התמונה המקורית.
      הערה: עבור כל ניסוי, יש לחשב תחילה פרמטרים אופטימליים. כדי להבטיח דיוק של פילוח, מומלץ לבצע ניתוח SQUASSH בתמונת מבחן ולבדוק באופן ידני את הדיוק של פילוח. המאקרו מספק קובצי פלט המציגים את האובייקטים הבודדים שזוהו על התמונה המקורית, ובודק את הפרמטרים הללו באופן מקרוב וכוונון לתביעה יבטיחו פילוח מדויק. יש להשתמש בפרמטרים המוגדרים עבור הניסוי כולו לצורך השוואת ההשוואה. הפרמטרים המשמשים עבור תוצאות הנציג נכללים בטבלה 2.
    7. פתח את תוכנת הניתוח של פיג'י או ImageJ, נווט אל מיכל המאקרו פסיפס ופתח את התפריט SQUASSH.
      1. פתח את תפריט המשנה ' חיסור רקע ' וודא שהסרת רקע? מסומנת. ברירת המחדל עבור גודל חלון היא 10.
      2. הגדר את עוצמת האובייקט הסדרה והמינימום הרצויה , ערוץ 1 ערכים לזיהוי ולאובייקטי מקטעים מהטובים ביותר (ראה שלב 6.2.4). אין צורך בערכי ערוץ 2 עבור אובייקטים המסומנים באמצעות העברה בודד.
      3. לחץ על PSF הערכה מתוך מאפיינים אובייקטיביים כדי להעריך את הפונקציה התפשטות נקודה בהתבסס על מאפייני המיקרוסקופ. הדבר מסייע לפילוח של אובייקטים ממוקמים באופן צמוד על-ידי חשבונאות להשפעה של כל פיקסל בפיקסל השכן שלו.
        הערה: לא נעשה שימוש בפילוח של פיקסל משנה בניסוי זה בשל העומס המוגבר בעוצמת העיבוד של המחשב. כמו כן, לא נעשה שימוש במסיכות תא כאשר האקסון מוגדר בקלות. הגדרות אלה שימושיות לרקמות מורכבות יותר ולהגדרת אובייקטים בתא לפי בסיס התא.
      4. לאפשרויות ויזואליזציה, ודא שקווי מתאר של אובייקט ושמירת אובייקט ומאפייני תמונה נבדקים. לשימוש מאוחר יותר בגרפיקה ובתוכנה סטטיסטית, ודא שמספר התנאים הנכון הוא קלט.
    8. אתר את התיקיה עם תמונות . tiff והפעל את המאקרו. ניתן לבצע תהליך זה על תמונה בודדת או על קבוצה של תמונות לכל סוג של גנוטיפ הממוקם בתוך תיקיה. קבצי פלט יהיה ממוקם בתיקיה יחד עם התמונות המקוריות.
  3. ניתוח ומדידות צורה
    1. השתמש בפלט מ-SQUASSH כדי לספק קובץ נתונים . csv של אובייקט מפורט, המספק כל אובייקט בודד בכל שורה, כולל המידות שלו כמתואר לעיל.
      הערה: בעוד שתהליך מאקרו זה מבצע לאוטומטית מדידות אובייקט, חשוב תמיד לבדוק ידנית תמונות פלט לאחר פילוח SQUASSH כדי להבטיח שהמאקרו זיהה כראוי את המיטו,.
    2. כדי לנתח את הצורה של כל המיטו, להשתמש במדד דו מימדי לספרוגניות, מעגליות, כדי לאמוד את הסטייה של האובייקט ממעגל מושלם.
      הערה: מעגליות היא פונקציה של שטח והיקף (מעגליות = (4 x π) x (אזור/היקף2) שם 1 = עיגול מושלם 0 = קו ישר. ניתן להשיג זאת באמצעות נוסחה בגרפיקה ובתוכנה סטטיסטית.
    3. כדי לקבוע את השונות בגודל ובצורה על פני המאגר של המיטומטר, לחשב היסטורגרמות והתפלגות גאוסימלית מותאמת באמצעות גרפיקה ותוכנה סטטיסטית, עם סלים של 0.2 יקרומטר עבור גודל מיטוכונדריאלי ו 0.05 עבור מעגליות מיטוכונדריאלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ג. אלגיה הוא אורגניזם מודל אידיאלי ללימוד מורפולוגיה של רקמות ואורגלות שונות בשל פשטותו, השושלת הידועה של התאים, השקיפות והכלים הזמינים. כאן, אנו מספקים גישות כמותיים ללימוד אורגלים (למשל, המיטוa) ורקמות, כולל הסינפסות והשרירים באמצעות הדמיה של קרינה בשידור חי ותוכנות חינם ביולוגי לעיבוד תמונה.

רגולציה קפדנית של ביטוי MEC-17 נדרש עבור הפיתוח הרגיל סינפסה

כדי להבין עוד יותר את הפונקציה של אלפא-טובולין, transferase-העברת מק-1714, 15, 16 במערכת העצבים, למדנו מורפולוגיה סינפטית בנוירונים קולטן מגע ב -C. ביטוי יתר החלבון17. אלה מבנים סלולריים חיוניים לתפקוד העצב כפי שהם מאפשרים אותות להיות מועברים על הנוירונים השכנות. תמונות של ה-plm סינפסה נאספו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית יקוד לייזר וניתוח מורפולוגיה כמותית בוצעה באמצעות תוכנת עיבוד ביו תמונה נגישה (איור 1a, B). ביטוי יתר של MEC-17 תוצאות הפחתה משמעותית באזור טרום סינפטית צטברויות ב-PLM ומופחתת עוצמות משולב של זריחה משולבת של SNB-1:: GFP סמן (איור 1C, D). יחד, התוצאות האלה מראים כי יתר הביטוי של MEC-17 משבש את התפתחות הסינפסה רגיל ב-PLM קולטן לגעת נוירונים.

הגודל של האתר הטרום סינפטיות והזריחה המשולבת היחסיים נחקרו באמצעות תוכנת העיבוד הביו-תמונה חינם CellProfiler 3.1.5. בשל מבנה מורכב שלהם, הסינפסות הוגדרו ביד באמצעות חלבון tagRFP מפוזר הביע uIs115 (Pmec-17:: tagrfp) transgene. האזור של הסינפסה הוגדר מחושב לפי מספר הפיקסלים באזור שהוגדר. בהשוואה לשליטה מסוג פראי, בעלי חיים מביעים מוגזם-17 יש מופחתת באופן משמעותי אזורים טרום סינפטית (P = 0.0025; n ≥ 10) (איור 1ג). בנוסף, כדי ללמוד את השלמות הסינפטית, רמות האינטנסיביות משולבת יחסית של זריחה הושוו. זה היה מחושב על ידי מדידת רמות העוצמה של הזריחה משולבת בתוך הסינפסה מוגדר עבור שניהם SNB-1:: GFP ו-tagRFP התפוצבת. לאחר מכן, SNB-1:: ערכי הזריחה GFP יחסית לערכים tagRFP הושוו עבור אשר ירידה משמעותית (P = 0.0479; n ≥ 10) נצפתה עם ביטוי יתר של MEC-17 (איור 1d). יחד, תוצאות אלה מצביעים על התקנה הנכונה של MEC-17 חשוב לפיתוח הסינפסה.

מדידה כמותית של הגוף תא שריר באזור התא ואורך סיבים מגלה פגמים משמעותיים כתוצאה של מוטציות בגנים הקשורים CMT2

מוטציה בגנים MFN2, DNM2 ו KIF5A הוכחו לגרום charcot-מארי-שיניים סוג 2 (CMT2), צורה סיבי של נוירופתיה היקפית הנפוצה ביותר בירושה18, 19. CMT2 משויך בדרך כלל עם חולשת שרירים מתקדמת באיטיות וניוון, ליקוי החישה המרוחק, מומים ברגל והילוך steppage משני. כתוצאה מכך, חולים לעיתים קרובות סובלים מתישה ניידות ליקויי חיים. אין כרגע תרופה למחלה, בחלקו בשל טרוגניות גנטית קלינית הקשורים CMT219, כמו גם חוסר של מודלים בעלי חיים כדי ללמוד פתופסולוגיה מחלה. מכאן, באמצעות מודלים בעלי חיים כדי להבין את הפגמים הסלולריים הבסיסיים יכולים לספק תשובות למנגנון מחלות CMT2 לא ידוע.

עד כה, מחקרים שפורסמו הערכת פגמים בשריר הגוף בג, הסתמנו על הניקוד החזותי במקום על מדידות כמותית20. על מנת למנוע הטיה סובייקטיבית שיכולה להתרחש במהלך הערכה איכותית, מדידות כמותיים של הגוף באזור שריר הקיר ואורך סיבים רירן היו מסיבי באמצעות עיבוד תמונה זמין תוכניות. השתמשנו בשיטות אלה כדי להעריך את מורפולוגיה השריר בבעלי חיים נושאת מוטציות ב -fzo-1/MFN2, דינמיקה-1/DNM2 ו -unc-116/KIF5A גנים במבוגר בן 3 ימים בוגרים C... עבור שתי מדידות, מספר התנאים הוחלו, כך לפחות תא שריר בודד מלאה בלבד היה בתוך השקפה, תאי שריר שהיו מעורפלים או מחוץ לפוקוס היו נשלל, ואזורים קיצוניים הקדמי והאחורי, כמו גם אזורים סמוכים הפות הושמטו. בנוסף על המוטציות בגנים הקשורים CMT2, בעלי חיים גם נשאו את stEx30 (pmyo-3:: gfp:: myo-3 + rol-6 (su1006)) התוויות של C. אלגיה רירן שרשרת כבדה יחידת עם gfp (איור 2a-E). הכלי מצולע פשוט בתוכנת פיג'י9 (גירסה 2.0.0) שימש כדי למדוד את האזור של תא שריר יחיד. אם בעל חיים חווה התמוטטות מבנה שריר קיר הגוף, השארת מאחורי חללים ריקים בתוך תאי השריר, את היחס של אזור הפער לאזור שריר יחיד תא השריר היה מחושב ובהשוואה לשלוט סוג פראי (איור 3A). כדי להשיג מדידות של אורך סיבים רירן, כל תמונה היה מקוטע הראשון באמצעות תוכנה ilastik10 (גירסה 1.3.0) (איור 3b). פילוח הוא תהליך המאפשר את סיבי השריר הבודדים להיות מסווגים ומופרדים מקטעים לא רצויים כגון הרקע. לאחר פילוח, התמונה יוצאה כתמונה בינארית של 8 סיביות שאינה מוקצה. פיג'י (גירסה 2.0.0) בשלב הבא השתמשו לשלד התמונה הבינארית כדי לסנן את הפיקסלים בגבול, השארת מאחורי קטעים המייצגים את הסיבים המקוריים. לאחר מכן נותחו הסניפים של השלדים, או הרירן בודדים, בפיג. אורך המידות של 0 או יותר מ-250 μm, שהוא האורך הסביר המקסימלי עבור חוט הלהט אפילו עם שריר מתיחה, לא נכללו. בסך הכל, בין 2000 ל 3000 אורכי סיבים רירן נמדדו. סיכום של זרימת העבודה של פילוח מוצג באיור 3B. תוצאות האנליזה הכמותית היתה נוספת לעומת הבקיע ויזואלי של פגמים בשריר הגוף, שם בעלי חיים בני 3 ימים היו מסווגים פגומים או לא-פגומים בהתבסס על שלמות מבנה השריר.

פגמים במבנה הגוף השריר נצפו בין 2.5 ל 3.5 פעמים גבוה יותר ב -fzo-1 (cjn020), דינמיקה-1 (ky51) ו -unc-116 (e2310) בעלי חיים מאשר בחיות מסוג פראי במהלך הערכה חזותית (איור 4a). רוב בעלי החיים עם מוטציות ב -fzo-1 ו -unc-116 מנוסים הפסד בולט של סטריסים שרירים, לידר גדול gfp בשל הצטברות של פסולת תאית, וניוון סיבים שרירים שהשאיר שטח פעור בתוך תאי שריר ( איור 2C, E). לעומת זאת, בעוד יותר מ 60% של מוטציות דינמיקה 1 הבקיע מבחינה חזותית פגום, היקף הפגמים היה מינימלי לעומת שני המוטנטים הגנטיים האחרים. היה רק אובדן קל של סטריטים, לא הצוברי GFP וניוון שרירים רק קטין כאשר בהשוואה לשני המוטנטים האחרים (איור 2D ואיור 4a). כמו בניקוד פנוטיות אחר, לא ניתן להחשיב את מידת הפגמים, ונטייה להטיה עלולה לגרום לחלק גבוה יותר של פגמים להיות רשומים. לכן, מדידות כמותיים של אזור תא שריר ואורך סיבים יספק ייצוג מדויק יותר של מידת פגמים שרירים מאשר הערכה חזותית בלבד. בשורה עם פערים גדולים שנצפו עם הניקוד החזותי, היחס של אזור הפער לאזור תא כולל בודד הוכח להיות 5 עד 6 פעמים גבוה יותר ב -fzo-1 ו -unc-116 מוטציה בעלי חיים בהשוואה לקבוצה פראי, אשר רק חוו זניח פירוק מבנה השריר (איור 4B). העדר התמוטטות מבנית ב -דינמיקה-1 מוטציות הביאו לעלייה בלתי משמעותית, 3-קיפול בפער היחס לאזור תא השריר (איור 4b). הדבר מציין גם כי הטיית הניסויים עשויה להיות גורם התורם לחלק הגבוה של פגמים המוקצים על-ידי הערכה איכותית. עם זאת, הפערים הקטנים ירדו אורך סיבים ממוצע מ 24 יקרומטר בסוג פראי כדי 22 יקרומטר ב דינמיקה-1 מוטציות (איור 4c). אורך סיבים ממוצע היה קצר באופן דרמטי ב -fzo-1 ו- unc-116 מוטציות, הקשורות עם נוכחות של פערים גדולים בתוך ביטול תאי שריר בבעלי חיים אלה (איור 2C,E ואיור 4c ). תוצאות אלה מתאימות עם הממצאים האחרונים שלנו לחקור את ההשפעות של שינוי גנים CMT2-asscoiated ב C. אלגיה20. יתר על כן, הם להדגיש את הערכה מדויקת יותר של מורפולוגיה שרירים באמצעות שיטות כמותיים אלה לעומת הבקיע ויזואלי לבד, ולספק ראיות כי fzo-1 ו -unc-116 נדרשים עבור מורפולוגיה נורמלית השריר.

מדידות כמותיים של מורפולוגיה מיטוכונדריאלי באמצעות מקטעי אובייקט SQUASSH

על מנת להבין כיצד העדר ביקוע מיטוכונדריאלי משפיע על מורפולוגיה בתוך C. אלגיה נוירונים, ביצעו ניתוחים כמותיים בנוירונים plm מכונאי חושי. DRP-1, הג האורתולוג של ה-חלבון הקשור ביותר (DRP1), שולט בביקוע מיטוכונדריאלי, שם על הפעלה מגויס מהציטוסול כדי ליצור ספירלה סביב המיטוסים, מכווץ ובסופו של דבר שניהם ממברנות מיטוכונדריאלי הפנימיים והחיצוניים21, 22. אנו שכותרתו המיטוסקופים עם הרקמה הספציפית של רקמת העור בנוירונים PLM, אשר יש תהליך האקסון ארוך זה יכול להיות דמיינו בקלות באמצעות מיקרוסקופ epiפלואורסצנטית. אובדן ביקוע הוא היפותזה לשבש את הדינמיקה מיטוכונדריאלי הכולל, ולכן להקטין את היצירה של חדש, המיטו, קטן יותר דרך תהליך המכונה הנצה23.

ביצעת פילוח SQUASSH כדי להשוות מורפולוגיה מיטוכונדריאלי בחיות מסוג פראי ו drp-1 בעלי חיים מוטנטים. ניתחנו את המיטומטר מ 6 נוירונים PLM לבין גנוטיפ, וכתוצאה מכך ערך n של גדול יותר כי 200 המיטו, עבור כל. תרשים סכימטי ותמונות מייצגות מוצגים באיור 5A, B. מצאנו כי מוטציות חסר DRP-1 היה המיטו, גדול יותר ומוארך יותר (איור 5B-F). מיטוכונדריום ברקע מוטציה drp-1 היו 32% גדול יותר מסוג פראי (P = 0.0006, איור 5c) ו 14% יותר מוארך (רחוק יותר ממעגל מושלם) (P < 0.0001, איור 5c). לקבלת הערכה מפורטת יותר של השונות בגודל ובצורה, אנו מתווה היסטוריגרמות עבור כל מדידה, התאמת הנתונים להפצות גאוס (איור 5E, F). מצאנו כי בשני הגדלים ומעגליות, מוטציות חסר חלבון ביקוע היה שונות גדולה יותר (p < 0.0001 עבור שניהם), מודגש על ידי נוכחות של המיטו, גדול יותר ומוארך יותר רשתות/מיטוכונדריאלי (ראה איור 5Bii לקבלת דוגמאות ). בסך הכל, מצאנו ראיות כדי להציע כי מוטציה של drp -1 גורם לחוסר ביקוע בתוך נוירונים plm, וכתוצאה מכך המיטו, גדול יותר ומוארך יותר. כמו כן הדגמנו כי שיבוש ביקוע מיטוכונדריאלי גורם לעליה בשונות של מורפולוגיה מיטוכונדריאלי.

Figure 1
איור 1: קוונפיקציה של שלמות סינפסה בנוירונים PLM. (א) התמונות הן מקסימום z-תחזיות של אזור הסינפטית PLM ב בעלי חיים שאינם טרנסגניים. הפאנל השמאלי מראה את תא העצב PLM עם tagRFP, הפאנל השני מציג את האזור טרום סינפטית מתויג עם SNB-1:: GFP, התמונה השלישית היא כיסוי עם לוקליזציה משותפת מיוצגת בצהוב, והפאנל הרביעי הוא סכמטית של התמונה כיסוי. (ב) מקסימום z-הקרנה תמונות של האזור סינפטית בבעלי חיים מבטא MEC-17. תמונות מוצגות לפי לוח A. (C) גודל הקוונפיקציה של האזור טרום סינפטית בלתי טרנסגניים לעומת בעלי חיים טרנסגניים המבטא MEC-17. (ד) כימות של רמות הזריחה המשולבת היחסיים של snb-1:: gfp בלתי משולבים לעומת בעלי חיים טרנסגניים מבטא MEC-17. עבור (ג) ו (ד), סינפסות בודדים שנותחו מיוצגים באמצעות עיגולים; n ≥ 10; אומר ± S.E. מוצג בשחור. ערכי P * < 0.05, * * < 0.01 מתוך בדיקות tבלתי מזווג; סרגלי קנה מידה מייצגים 2 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה של שרירי הגוף של C. אלגיה . (א) בעל חיים המבטא את StEx30 (pmyo-3:: gfp:: myo-3 + rol-6 (su1006)) טרנזגנטי, אשר מתייג רירן שרשרת כבדה עם gfp בשרירי קיר הגוף. המערך משרה גם פנוטיפ מתגלגל בבעל החיים המקל על הדמיה של תאי השריר המסודרים לאורך הצדדים הגוגליים והגאיים של הגוף. המייצג צפיות מוגדל של סיבים רירן ב (ב) פראי סוג, (ג) fzo-1 (cjn020), (ד) דינמיקה-1 (ky51) ו (E) unc-116 (e2310) בעלי חיים. כל החיות היו מבוימת בשלב המבוגר בן השלושה ימים. סרגל בקנה מידה מייצג 60 יקרומטר ב (A), ו-30 יקרומטר ב (ב-E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מדידת שטח הגוף שריר באזור ואורך סיבים באמצעות אלגוריתמים חישוביים זמינים. (א) תמונה לדוגמה מדגימים כיצד מרחב הפער הפנימי בתוך תא שריר יחיד (אדום-מוקף), והאזור של התא כולו (צהוב-סגור) נמשכים ומחושבים בפיג כדי להשיג את היחס באזור השריר. (ב) חלוקה לרמות של פרוטוקול פילוח בתמונה אחת לדוגמה באמצעות שילוב של פיג'י ו-ilastik. סרגל בקנה מידה מייצג 30 μm. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הכשרה וכימות של פגמים בקיר הגוף שרירים. (א) הערכה חזותית של פגמים בשריר הגוף. (ב) השוואה של שטח ריק שטח ליחס השטח הכולל תא השריר בין WT למוטציות המצוין. (ג) מדידה של אורך סיבים רירן. עבור (ב) ו-(ג), רק תמונות עם תא שריר אחד לפחות לעין מלאה לראות כלולים לניתוח. סיבים עם אורך של 0 יקרומטר או יותר מ-250 יקרומטר לא נכללו גם. בארים מייצגים אחוזי בעלי חיים פגומים (A) וממוצע ± S.E.M. in (ב) ו-(ג); n ערכים המפורטים בכל אחד מהעמודות. מבחן צ'י סקוור עם שיעור גילוי שווא בוצעו כדי להשוות פגמים חזותיים ב (א), ואילו ANOVA בכיוון אחד עם הבדיקות הפוסט-הוק של דאננט עבור השוואה מרובה שימשו לניתוח מדידות כמותיים ב (ב) ו (ג). *P < 0.05, * * * *P < 0.0001, ns = לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מורפולוגיה מיטוכונדריאלי בתוך האקסונים של נוירונים PLM. (א) סכמטי של תא מיקרוטוכדורית אחורי (PLM) בזנב של ס. אלגיה. התיבה האדומה מציינת את המיקום המשוער של הסעיפים המסומנים ב (ב), אשר מציגים תמונות של נציגים של המיטומטר (pmec-4:: MLS:: gfp) בתוך האקסון. . בהיר וירוק מציין מיטוכונמיטוא בהשוואה ל WT (i), drp-1 (tm1108) מוטציות (ii) להראות גדול יותר, מוארך יותר המיטו,. תמונות מייצגות של n = 6 plm אקסונים מ 6 תולעים לכל גנוטיפ; סרגל ברים = 15 μm. (C) ממוצע גודל (μm2) של מיטוכונאסיום בודדים ככמת על ידי מפלח אובייקט squassh במבוגר בן 3 ימים (3doa) תולעים. (ד) מתכוון מעגליות של המיטו, בתוך האקסון plm, ככמת ממדידות אובייקט SQUASSH ב 3DOAs. (ה) היסטוגרמה והתפלגות גאוסיאנית המציגה את השונות של גודל מיטוכונדריאלי. F test (P < 0.0001) מראה ששונויות שונות באופן משמעותי בין היסטוגרמה drp-1 ו-WT. (f) והתפלגות גאוסימית המציגה את השונות של מעגליות מיטוכונדריאלי. הנתונים מיוצגים כממוצע +/-SEM. * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001 מתוך מבחן t של וולש; n ≥ 204 המיטומטר עבור ניתוח כמותי מ n = 6 תולעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שם הנבג גנוטיפ מקור פניה #
BXN038 uIs115 (Pmec-17:: tagRFP); jsIs609 (Pmec-4:: MLS:: GFP) מעבדת נוימן 7
BXN366 fzo-1 (cjn020); myo-3 (st386); zdIs5 (Pmec-4:: GFP); stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: myo-3 + rol-6 (su1006)) מעבדת נוימן 20
BXN419 drp-1 (tm1108); jsIs609 (Pmec-4:: MLS:: GFP); uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) מעבדת נוימן 7
BXN507 cjnEx036 (Pmec-4:: mec-17, Pmyo-2:: mCherry); jsIs37 (Pmec-7:: snb-1:: GFP); לין-15B & לין-15B (n765); uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) מעבדת נוימן 17
BXN675 unc-116 (e2310); myo-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: myo-3 + rol-6 (su1006)) מעבדת נוימן 20
BXN685 דינמיקה-1 (ky51); myo-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: myo-3 + rol-6 (su1006)) מעבדת נוימן 20
NM664 jsIs37 (Pmec-7:: snb-1:: GFP); לין-15B & לין-15B (n765) כוראבודיוטיס מרכז גנטיקה 6
RW1596 myo-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: myo-3 + rol-6 (su1006)) כוראבודיוטיס מרכז גנטיקה 8
TU4065 uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) מרטין צ'לפי מיכל 5

. שולחן 1 רשימת זנים של C. אלגיה המשמשים במחקר זה.

תמונות של PLM
מטרה 40x
רזולוציית תמונה (לכל פאנל לסריקה) 3224 x 3224
גודל חלון של הסרת רקע 20
מיכל כפול 0.78
PSF z 0.68
Regularisation 0.15
עוצמת הקרינה המינימלית של GFP 0.4

. שולחן 2 פרמטרי SQUASSH עבור פילוח של המיטומטרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

וריאציות מורפולוגית העריכו לעתים קרובות באמצעות ספירה ידנית של הבדלים מורגש או שימוש בספי שרירותי כדי לקבוע פגמים בהשוואה לסוג פראי הפנוטיפים. לאחרונה, עם זאת, שיטות כמותיים שימשו למחקרים השוואתיים של המבנה כדי למדוד במדויק ולתאר שינויים ברמה התאית התאית בצורה לא משוחדת. היכולת לזהות הבדלים עדינים אך רלוונטיים ביולוגית בין פנוטיפים הוא אמצעי רב-עוצמה להבנת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים השולטים בשינויים במבנה מורפולוגיה הנגרמים מגורמים סביבתיים או ממחלות גנטיות. המשך העלייה ברזולוציית המחשוב וההדמיה המיקרוסקופיה, ביחד עם קלות הצמיחה והרב-תכליתיות של הגנטיקה של C. אלגיה סיפקה את הפלטפורמה המושלמת לשילוב של תוכנות דימות מתוחכמות אך חופשיות עם תמונות מפורטות בסדר מפורט. כאן, הדגמנו שיטות להעריך ולכמת את גודל הסינפטית והלוקליזציה של חלבון, שריר קיר הגוף באזור ואורך סיבים, ומורפולוגיה מיטוכונדריאלי במגוון של רקעים גנטיים.

בעוד מנתח אלה הפגינו יכולת לכמת הבדלים מורפולוגיים עדינים, יש מגבלות. למרות שכל אחד מאותם מנתח לעשות שימוש בקוד פתוח ותוכנה זמינה, הם סומכים על איכות גבוהה, תמונות חדות כדי לפתור במדויק מבנים סלולריים ומשני הסלולר. זה יכול להיות לעתים קרובות צעד מגביל, כמו ציוד high-end רגיש, כגון קונפוקלית יקרוסקופים עם גלאים מתקדמים, נדרשים לצלם תמונות עם רזולוציה מספקת. אלה לא תמיד נגישים למעבדות, ניתוח עם טכנולוגיית sub-par יכול להוביל לתוצאות לא מדויקות ולא ניתן לשחזור. בנוסף, כל טכניקה שואפת להפחית את הטיית הניסויים באמצעות אלגוריתמים של מחשבים, עדיין יש צעדים שיכולים לכלול אלמנט של טעות אנוש. ההגדרה הידנית של הסינפסה ביד, החלוקה של אזור התא שריר, מיטובי הפרמטרים של פילוח מיטוכונדריאלי על ידי העין הם כל האזורים שניתן לשפר בהקשר זה. כדי להפחית את הסיכוי לטעות אנוש, המחקרים יכולים להתבצע בצורה עיוורת או לחילופין תוכנות ניתוח התמונה יכול לשמש כדי להגדיר את האזור של הריבית עצמה. באמצעות מסיכות תא, שבו האזור הרצוי לניתוח מוגדר על ידי הזריחה באורך הגל האחר, עשוי לעזור זה. הדבר משמש להגבלת הניתוח למקטע בתמונה המציגה את הקרינה הפלואורסצנטית מעל לסף קבוע, כגון גרעין התא או תא מנוכר13,24. יתרה מזו, השימוש בתמונות בנקודות זמן בודדות מגביל את השאלות ששיטות אלה יכולות לטפל בהן. התהליכים השולטים על מורפולוגיה ארגונית, היווצרות סינפסה ומבנה השריר הם בוודאי דינמיים, וניתן לראות את ההבדלים בתוך אותו תא בהתאם למצב ההתפתחותי או הביולוגי. הניתוח של מבנים אלה בנקודת קצה מסוימת יכול להיות מגביל והדמיה של זמן ההדמיה תהיה מועילה לניטור שינויים מבניים לאורך זמן. לבסוף, בעוד שינויים מורפולוגיים יכולים להיות אינדיקציה טובה להפרעה בתהליכים סלולריים, המתאם אינו תמיד משתמע. לדוגמה, ממצאים אחרונים במינים שונים הראו כי תפקוד מיטוכונדריאלי וטופס ניתן באמת לנתק7,25. לכן, חובה נוספת לקחת בחשבון כאשר מסיקים שינויים פונקציונליים כתוצאה מהבדלים מורפולוגיים.

הצלחנו להדגים את השימוש בטכניקות כמותיים אלה בערכה מסוימת של רקמות ורקעים גנטיים; עם זאת, ניתן להחיל את השימוש שלהם באופן רחב יותר. קוונפיקציה פלואורסצנטית באמצעות תוכנת הדמיה ניתן להשתמש כדי לנתח מגוון של מערכות משנה שונות כגון גרעינים ואנדוזומים, או מבנים שונים כגון נוירונים ותאי אפיתל, כל בתוך ההקשר של מוטציה או מחלה שונים רקעים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לחברי מעבדת נוימן עבור דיונים וקלט יקרי ערך. זנים מסוימים סופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). המחברים מודים WormBase על שפע של מידע על C. אלגיה, ולהכיר מונש מיקרו הדמיה, אוניברסיטת מונש, לאספקת מכשור, הדרכה ותמיכה טכנית. עבודה זו נתמכת על ידי מענקי מחקר CMTAA (2015 ו 2018), ו-NHMRC פרויקט מענקים 1101974 ו 1099690 הוענק B.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar-agar Merck 1.01614.1000
Agarose Invitrogen 16500-500
Confocal microscope Leica TCS SP8 Inverted platform
Fluorescence microscope Carl Zeiss AG Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1 Thermo scientifique MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5 Zeiss 474030-9000-000 Made by SCHOTT
Glass slides Thermo scientifique MENS41104A/40
Light LED Schott KL 300 LED
Stereo Microscope Olympus SZ51
Tryptone (Peptone from casein) Merck 107213 Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Yeast Extract Merck 103753 Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Sodium chloride Merck 106404 Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Peptone (Peptone from meat) Merck 107214 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Agar Sigma A1296 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Sodium chloride Merck 106404 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Cholesterol Sigma C8667-25G Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Calcium chloride Merck 102382 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Magnesium sulfate Merck 105886 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Dipotassium phosphate Merck 105101 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Potassium dihydrogen phosphate Merck 104873 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Disodium phosphate Merck 106586 Ingredients for M9 buffer
Sodium chloride Merck 106404 Ingredients for M9 buffer
Potassium dihydrogen phosphate Merck 104873 Ingredients for M9 buffer
Magnesium sulfate Merck 105886 Ingredients for M9 buffer
Pasteur pipette Corning CLS7095D5X-200EA
Petri dishes Corning CLS430589-500EA
Platinum wire Sigma 267201-2G
Spatula Met-app 2616
Tetramisole hydrochloride Sigma L9756-5G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. , (1974).
  2. Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
  3. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
  4. Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
  5. Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
  6. Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
  7. Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
  8. Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  10. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
  11. Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  12. Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
  13. Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
  14. Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
  15. Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
  16. Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
  17. Teoh, J. -S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
  18. Bird, T. D. Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , GeneReviews [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2019. [Updated 2016 Apr 14] Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1285/ (1998).
  19. Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
  20. Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
  21. Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
  22. Zhu, P. -P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
  23. Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
  24. Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
  25. Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).

Tags

ביולוגיה גיליון 149 מדידות כמותיים דימות מורפולוגיה סינפטית שריר קיר הגוף אורך רירן מורפולוגיה מיטוכונדריאלי שארקו-מארי-שיניים
גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית <em>בקנבאבדיוטיס</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teoh, J. S., Soh, M. S., Byrne, J.… More

Teoh, J. S., Soh, M. S., Byrne, J. J., Neumann, B. Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (149), e59978, doi:10.3791/59978 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter