В этом исследовании излагаются количественные измерения синаптических размеров и локализации, морфологии мышц и митохондриальной формы в C. elegans с использованием свободно доступных инструментов обработки изображений. Такой подход позволяет будущим исследованиям в C. elegans количественно сравнить степень структурных изменений тканей и органелл в результате генетических мутаций.
Определение клеточных механизмов, лежащих в основе болезни имеет важное значение для развития новых терапевтических препаратов. Стратегия, часто используемая для распутывания этих механизмов, заключается в внедрении мутаций в генах-кандидатах и качественном описании изменений в морфологии тканей и клеточных органелл. Однако качественные описания могут не фиксировать тонкие фенотипические различия, могут искажать фенотипические вариации между отдельными лицами в популяции и часто оцениваются субъективно. Здесь описаны количественные подходы для изучения морфологии тканей и органелл в нематоде Caenorhabditis elegans с помощью лазерного сканирования конфокальной микроскопии в сочетании с коммерчески доступным программным обеспечением для обработки биоизображений. Для понимания был проведен количественный анализ фенотипов, влияющих на целостность синапсов (размер и интегрированные уровни флуоресценции), развитие мышц (размер мышечной клетки и длина нити миозинов) и митохондриальную морфологию (круговость и размер) влияние генетических мутаций на эти клеточные структуры. Эти количественные подходы не ограничиваются описанными здесь приложениями, поскольку они могут легко использоваться для количественной оценки морфологии других тканей и органелл в нематоде, а также в других типовых организмах.
Нематод Caenorhabditis elegans (C. elegans) все чаще используется в качестве модели системы для выявления биологических и молекулярных процессов, участвующих в болезни человека. Взрослый нематод имеет длину тела чуть более 1 мм, и может производить большой выводок до 300 яиц1. После вылупления, C. elegans только требуется 3-4 дней, чтобы достичь совершеннолетия, и жить около 2 до 3 недель2. Из-за своей простоты культивирования, C. elegans в настоящее время является одним из самых востребованных моделей in vivo животных для проведения экономически эффективных, экспресс-скрининга наркотиков для выявления терапевтических средств для заболеваний человека. Кроме того, его генетическая консервация, четко определенные поведенческие парадигмы, прозрачное тело для флуоресценции или световой микроскопии, а также простота генетических манипуляций делают изучение клеточных и молекулярных последствий генетических мутаций легко достижимым 3. Геном C. elegans имеет около 60-80% оротологии с человеческими генами, и около 40% из этих генов, как известно, связаны с болезнью. Некоторые из человеческих заболеваний, которые были смоделированы и изучены в C. elegans включают нейродегенеративные расстройства (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, Шарко-Мари-Зубная болезнь), мышечные заболевания ( Мышечная дистрофия Дюшенна и метаболические заболевания(гипергликемия) 2,4. В большинстве человеческих расстройств происходят вызванные болезнями клеточные и органеллыи и морфологические изменения, которые легко оценить в модели нематод.
Флуоресцентные маркеры широко используются для обозначения тканей и органелл для динамической визуализации под микроскопом. Однако, в C. elegans, обычные методы, которые оценивают морфологические нарушения из-за генетических мутаций в значительной степени опирались на визуальные описания. В то время как качественные оценки могут охватывать более широкие диапазоны фенотипических описаний (синаптической морфологии, GFP слипания, конкретные аксональные формы, толщина мышечного волокна и т.д.) и обеспечить вид с высоты птичьего полета морфологических изменений, они менее хорошо подходят для сравнение небольших вариаций в разных группах. Кроме того, качественные оценки основаны на визуальной, субъективной оценке, которая может привести к чрезмерной или недооценке морфологических аномалий. Наконец, качественные наблюдения могут также сильно различаться между людьми, создавая трудности с репликацией данных.
В последние годы был разработан ряд удобных для пользователя вычислительных алгоритмов, которые могут количественно анализировать изображения. Тем не менее, использование такого программного обеспечения анализа изображений для некоторых морфологических исследований, особенно в отношении мышц стенки тела и митохондрий, в C. elegans исследования отстают. Для улучшения основных структурных анализов в C. elegans, некоторые из легко доступных, с открытым исходным кодом программного обеспечения анализа изображений были опробованы количественно сравнить влияние генетических мутаций на мышечные митохондрии, мышцы стены тела и синаптической Морфология. Эти экспериментальные процедуры подробно излагают, как эти программы (Фиджи, иластик, CellProfiler, СКВАСШ) могут быть использованы для оценки изменений в синаптических размерах и локализации синаптического белка, области мышц стены тела и длины клетчатки, а также митохондриальных размера и круговой связи в результате генетических мутаций в нематоде.
Морфологические вариации часто оценивались с помощью ручного подсчета заметных различий или использования произвольных пороговых значений для определения дефектов по сравнению с фенотипом дикого типа. Однако в последнее время для сравнительных исследований морфологии используютс?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим сотрудников лаборатории Ноймана за ценные дискуссии и вклад. Некоторые штаммы были предоставлены CGC, которая финансируется NIH Управление научно-исследовательских инфраструктурных программ (P40 OD010440). Авторы благодарят WormBase за ее богатое количество информации о C. elegans, и признать Монаш Micro Imaging, Монаш университета, для предоставления приборов, обучение и техническую поддержку. Эта работа была поддержана cmTAA научно-исследовательских грантов (2015 и 2018), и NHMRC проект Гранты 1101974 и 1099690 присуждается B.N.
Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
Light LED | Schott | KL 300 LED | |
Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
Spatula | Met-app | 2616 | |
Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |