Este estudo esboça medidas quantitativas do tamanho e da localização sináptica, da morfologia do músculo, e da forma mitochondrial em C. elegans usando ferramentas livremente disponíveis do processamento de imagem. Esta aproximação permite que os estudos futuros em C. elegans comparem quantitativamente a extensão de mudanças estruturais do tecido e do organela em conseqüência das mutações genéticas.
A definição dos mecanismos celulares subjacentes à doença é essencial para o desenvolvimento de novas terapêuticas. Uma estratégia freqüentemente usada para desvendar esses mecanismos é introduzir mutações nos genes candidatos e descrever qualitativamente as alterações na morfologia dos tecidos e organelas celulares. Entretanto, as descrições qualitativas não podem capturar diferenças fenotípicas sutis, podem deturpar variações fenotípicas em indivíduos de uma população, e são freqüentemente avaliadas subjetivamente. Aqui, abordagens quantitativas são descritas para estudar a morfologia dos tecidos e organelas no nematódeo Caenorhabditis elegans usando microscopia confocal de varredura a laser combinada com software de processamento de bioimagem disponível comercialmente. Uma análise quantitativa de fenótipos que afetam a integridade da sinapse (tamanho e níveis de fluorescência integrados), desenvolvimento muscular (tamanho da célula muscular e comprimento do filamento da miosina) e morfologia mitocondrial (circularidade e tamanho) foi realizada para entender os efeitos das mutações genéticas nestas estruturas celulares. Essas abordagens quantitativas não se limitam às aplicações aqui descritas, pois poderiam prontamente ser utilizadas para avaliar quantitativamente a morfologia de outros tecidos e organelas no nematoide, bem como em outros organismos modelo.
O nematódeo Caenorhabditis elegans (C. elegans) é cada vez mais utilizado como um sistema modelo para desvendar os processos biológicos e moleculares envolvidos na doença humana. Um nematódeo adulto tem um comprimento de corpo de pouco mais de 1 mm, e pode produzir uma grande ninhada de até 300 ovos1. Após a eclosão, C. elegans só exigem 3-4 dias para atingir a idade adulta, e viver por cerca de 2 a 3 semanas2. Devido à sua facilidade de cultivo, C. elegans é atualmente um dos modelos animais mais procurados in vivo para a realização de triagem de drogas rentável e rápida para identificar terapêutica para doenças humanas. Adicionalmente, sua conservação genética, paradigmas comportáveis bem definidos, corpo transparente para a fluorescência ou a microscopia de luz, e a facilidade da manipulação genética fazem o estudo de conseqüências celulares e moleculars de mutações genéticas prontamente achieveable 3. o genoma C. elegans compartilha aproximadamente 60-80% de ortologia com genes humanos, e cerca de 40% desses genes são conhecidos como relacionados à doença. Algumas das doenças humanas que foram modeladas e estudadas em C. elegans incluem distúrbios neurodegenerativos (doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth), doenças associadas ao músculo ( Distrofia muscular de Duchenne) e doenças metabólicas (hiperglicemia)2,4. Na maioria dos distúrbios humanos, ocorre a localização celular e organela induzida por doenças e alterações morfológicas, que podem ser prontamente avaliadas no modelo de nematódeos.
Os marcadores fluorescentes têm sido amplamente utilizados para rotular tecidos e organelas para visualização dinâmica o microscópio. No entanto, em C. elegans, os métodos convencionais que avaliam as irregularidades morfológicas devido a mutações genéticas têm se invocado em grande parte nas descrições visuais. Embora as avaliações qualitativas possam abranger faixas mais amplas de descrições fenotípicas (morfologia sináptica, aglutinamento de GFP, forma axonal específica, espessura da fibra muscular, etc.) e proporcionam uma visão ocular das alterações morfológicas, elas são menos adequadas para comparando pequenas variações entre diferentes grupos. Além disso, as avaliações qualitativas são baseadas na avaliação visual, subjetiva, que pode conduzir a excesso ou subestimativas de anomalias morfológicas. Finalmente, as observações qualitativas também podem variar muito entre os indivíduos, criando dificuldades com a replicação de dados.
Nos últimos anos, um número de algoritmos computacionais de fácil utilização e prontamente disponíveis que podem analisar quantitativamente as imagens foram desenvolvidas. No entanto, a utilização de tal software de análise de imagem para alguns estudos morfológicos, especialmente em relação aos músculos da parede corporal e mitocôndria, em C. elegans Research tem se atrasado. Para melhorar a análise estrutural subjacente em C. elegans, algumas das prontamente disponíveis, software de análise de imagem de código aberto foram trialed para comparar quantitativamente os efeitos das mutações genéticas na mitocôndria muscular, músculo da parede do corpo e sináptica Morfologia. Estes procedimentos experimentais esboçam em detalhe como estes programas (Fiji, ilastik, cellprofiler, squassh) podem ser usados para avaliar mudanças no tamanho sináptica e na localização da proteína sináptica, na área do músculo da parede do corpo e no comprimento da fibra, e no tamanho mitochondrial e circularidade como resultado de mutações genéticas no nematoide.
As variações morfológicas foram avaliadas freqüentemente através da contagem manual de diferenças visíveis ou de usar limiares arbitrários para determinar defeitos em comparação a um phenotype do selvagem-tipo. Mais recentemente, entretanto, os métodos quantitativos foram usados para estudos comparativos da morfologia para medir exatamente e descrever mudanças em um nível celular e subcellular em uma forma imparcial. A capacidade de identificar diferenças sutis e biologicamente relevantes entre os fenótipo…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos aos membros do laboratório de Neumann por discussões e entradas valiosas. Algumas cepas foram fornecidas pela CGC, que é financiada pelo NIH Office de programas de infra-estrutura de pesquisa (P40 OD010440). Os autores agradecem à WormBase por sua riqueza de informações sobre C. elegans, e reconhecem a Monash micro Imaging, a Monash University, para o fornecimento de instrumentação, treinamento e suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por subsídios de pesquisa da CMTAA (2015 e 2018), e o projeto NHMRC concede 1101974 e 1099690 concedidos à B.N.
Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
Light LED | Schott | KL 300 LED | |
Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
Spatula | Met-app | 2616 | |
Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |