Summary
本研究概述了使用免费提供的图像处理工具对C. elegans的突触大小和定位、肌肉形态和线粒体形状的定量测量。这种方法允许将来在C.elegans的研究定量比较由于基因突变而导致的组织和细胞器结构变化的程度。
Abstract
定义疾病背后的细胞机制对于开发新的治疗方法至关重要。经常用来解开这些机制的策略是引入候选基因的突变,并定性地描述组织和细胞细胞器的形态变化。然而,定性描述可能无法捕捉细微的型值差异,可能歪曲人群中个体的型型变化,并且经常被主观地评估。本文介绍了定量方法,利用激光扫描共聚焦显微镜与市售的生物图像处理软件相结合,研究线虫卡埃纳哈布迪炎的组织和细胞器的形态。对影响突触完整性(大小和综合荧光水平)、肌肉发育(肌肉细胞大小和肌苷丝长度)和线粒体形态(循环和大小)的表型进行了定量分析,以了解基因突变对这些细胞结构的影响。这些定量方法并不限于此处描述的应用,因为它们可以很容易地用于定量评估线虫中其他组织和细胞器的形态,以及其他模型生物体中的形态。
Introduction
线虫卡埃内沙布迪炎(C.elegans)越来越多地被用作一个模型系统,以揭示人类疾病所涉及的生物和分子过程。成年线虫的体长略高于1毫米,可以产生多达300个鸡蛋的大卵1。孵化后,C.elegans只需3-4天才能成年,并存活2至3周。由于其易于培养,C. elegans是目前最抢手的体内动物模型之一,用于进行经济高效、快速的药物筛选,以确定人类疾病的治疗药物。此外,其遗传保护,明确界定的行为范式,透明的身体荧光或光显微镜,以及易于基因操作,使研究细胞和分子后果的基因突变很容易实现3. C. elegans基因组与人类基因共享大约 60-80% 的正畸,其中约 40% 与疾病相关。在C.elegans中建模和研究的一些人类疾病包括神经退行性疾病(阿尔茨海默氏病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、Charcot-Marie-Tooth 病)、肌肉相关疾病(杜琴肌肉萎缩症),和代谢性疾病(高血糖)2,4。在大多数人类疾病中,疾病引起的细胞和细胞器定位和形态变化发生,这很容易在线虫模型中评估。
荧光标记已广泛用于标记组织和细胞器,用于显微镜下的动态可视化。然而,在C.elegans中,评估由于基因突变引起的形态不规则性的传统方法主要依靠视觉描述。虽然定性评估可以涵盖更广泛的表型描述范围(突触形态学、GFP结块、特定斧头形状、肌肉纤维厚度等),并提供形态变化的鸟瞰图,但它们不太适合比较不同组之间的小差异。此外,定性评估以视觉、主观评估为基础,这可能导致对形态异常的高估或低估。最后,定性观测结果也可能因个人而异,给数据复制造成困难。
近年来,已经开发出一些用户友好、现成的计算算法,可以定量分析图像。然而,这种图像分析软件的利用,在一些形态学研究,特别是有关身体壁肌和线粒体的研究,在C.elegans的研究已经滞后。为了改进C.elegans的基本结构分析,试验了一些现成的开源图像分析软件,以定量比较基因突变对肌肉线粒体、身体壁肌和突触的影响形态。这些实验程序详细概述了这些程序(Fiji、ilastik、CellProfiler、SQUASSH)如何用于评估突触大小和突触蛋白定位、体壁肌肉面积和纤维长度以及线粒体尺寸和线粒体尺寸的变化。由于线虫的基因突变而循环。
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Protocol
1. C. 埃莱甘菌株的生长与维持
- 种子线虫生长介质 (NGM, 参见材料表) 琼脂板与300 μL的缓慢生长的大肠杆菌菌株OP50在层流柜。
- 将 NGM 琼脂板留在层流柜中晾干。
注:在没有层流柜的情况下,板可以留在长凳上干燥,但更容易受到污染。 - 将至少20只动物转移到两个OP50种子NGM琼脂板中,以有工作种群。有两种主要的方式来转移动物。
- 采摘:使用热消毒的采摘轻轻抬起动物。此方法对于从琼脂板中选择单个或多种动物是有效的。采摘时,在尖端有少量细菌的刮擦有助于转移。
注:挑子由一块长约4厘米的铂金线制成,嵌入玻璃移液器中,线尖扁平化为"类似长矛"。热消毒采摘之间的拣选,以防止交叉污染。 - 块状:使用消毒的铲子,从一个盘子中切出一小块含有动物的琼脂,然后倒置到一个新的盘子上。
注:此方法通常可用于转移大量蠕虫,并通过多轮块状未受污染的琼脂去除板中的污染。避免交叉污染,在传输之间燃烧铲子几秒钟,将铲子浸入100%乙醇中。不建议从饥饿的板块转移,因为饥饿和过度拥挤会影响细胞和亚细胞结构的健康和形态。
- 采摘:使用热消毒的采摘轻轻抬起动物。此方法对于从琼脂板中选择单个或多种动物是有效的。采摘时,在尖端有少量细菌的刮擦有助于转移。
- 在标准生长温度(20°C)保持蠕虫。为确保持续供应喂养良好的蠕虫,每 2 到 3 天将蠕虫转移到新的 OP50 种子板。
2. 年龄同步C. elegans
- 在3-4个NGM板上保持蠕虫,直到人群拥挤但不饿死。
- 用 M9 溶液轻轻清洗 NGM 板上的蠕虫。鸡蛋将留在盘子上,因为它们坚持大肠杆菌OP50。重复四个额外的洗涤步骤,以删除所有孵化的动物。
- 让蠕虫孵化40分钟。
- 将 1-2 mL 的 M9 溶液添加到板中,轻轻旋转以松开最近孵化的蠕虫。
- 收集最近诞生的蠕虫的 M9 解决方案,并将带蠕虫的溶液转移到新鲜的 NGM 板。
- 通过将 NGM 板暴露在空气中,使 M9 溶液蒸发。在明火附近执行此操作,以避免 NGM 板受到污染。
- 在20°C下生长蠕虫27小时,允许发育到第三个幼虫(L3)阶段。对于同步的3天成年动物,蠕虫在幼虫阶段4采摘,再生长3天,达到3天成人阶段。
3. 为成像准备幻灯片
- 在微波安全瓶中制备 3-4% 的带 agarose 的甘蔗(100 mL 中 3-4 g 的超纯水)。
注:Agar可用于以相同浓度代替琼脂原。 - 在微波炉中小心地融化甘蔗,注意不要过度沸腾,直到所有甘蔗溶解(透明溶液)。将溶液保持在70°C,以防止凝固。
注:阿加罗斯股票可多次使用。如果甘蔗已经凝固,在使用前再加热。 - 使用巴斯德移液器,将一滴融化的甘蔗放在显微镜幻灯片上。
注意:避免在琼脂滴中产生气泡,因为这些气泡会破坏垫的完整性。 - 立即用另一张显微镜幻灯片向下压下甘蔗滴,轻轻地将甘蔗压平到两个幻灯片之间的垫子中。
注: 在此阶段应删除任何剩余气泡。如果不是,新的幻灯片应该做,因为动物很容易卡在气泡中。按下幻灯片时,避免琼脂溢出到侧面。 - 将甘蔗保持干燥1分钟。
- 小心地将两张幻灯片分开,以避免对甘蔗的损害,同时将凝固垫留在其中一张幻灯片上。
注意:带甘蔗垫的幻灯片应始终在实验前新鲜准备,因为它们可以干涸。确保角玫瑰花垫的厚度一致。垫上不应有气泡或裂纹,因为这可能会干扰成像。 - 在阿加罗斯垫的中心加入0.05%盐酸四甲(麻醉剂)的少量滴(5-10 μL)。
- 使用热消毒采摘,在溶液干燥之前,快速将大约10-15只动物从库存板转移到麻醉液滴。避免转移过多的OP50细菌,因为这将使溶液浑浊,从而干扰成像。
注:如果麻醉溶液在采摘时变干,只需将第二滴0.05%的盐酸四氯丁二苯移至动物身上即可。动物往往躺在麻醉溶液的侧侧。 - 将盖玻片放置在甘蔗垫的正上方,然后轻轻放下。这将防止气泡的形成。不要对盖玻片施加压力,因为这可能会压碎动物。
- 使用应变名称为幻灯片添加标签。
4. 评估突触形态
注:通过使用线扫描共聚焦显微镜量化突触大小和定位,研究了MEC-17过度表达对后侧微管(PLM)触摸受体神经元突触完整性的影响。PLM神经元(包括突触区域)使用uIs15(Pmec-17::tagRFP)转基因(应变:TU4065 5)进行可视化,突触区域被专门标记为jsIs37(Pmec-7::snb-1:GFP)(应变:NM664)6).本研究在同步L3非转基因和转基因动物的超染色体MEC-17过度表达菌株BXN507 [cjnEx036 (Pmec-4::mec-17, Pmyo-2::mCherry); jsIs37; uIs115=7.本研究中使用的菌株的完整列表载于表1。
- 触摸受体神经元突触的共聚焦成像
- 要成像突触区域,请使用线扫描共聚焦显微镜耦合 488 nm 和 552 nm 光学泵送半导体二极管激光器,并配备图像捕获软件。
- 使用最低放大倍率定位蠕虫。
- 当动物成功定位时,切换到40倍放大倍率并应用浸入介质(在本研究中:使用40X/1.10 HC PL APO CS2多沉浸式目标,带水浸渍)。
- 通过 GFP 荧光荧光荧光器的 488 nm 激光(2% 功率)和 tagRFP 荧光荧光荧光荧光光酸的 452 nm(1% 功率)激发荧光团,使突触区域可视化。
- 确定最佳 x 和 y 帧以捕获整个突触区域。选择帧时,请确保考虑最佳像素大小。在这项研究中,获得了56nm的一致像素大小。
- 使用混合光探测器捕获图像,并设置增益以防止荧光量过度曝光(488 nm 激发为 100%,552 nm 激发为 15%)。
- 收集 z 堆栈图像以覆盖整个突触,根据所使用的特定目标,使用最佳 z 步长大小。在这项研究中,使用了0.211nm的最佳z步长。
注:确保所有图像在严格的条件下拍摄,以便进行集成的荧光定量和比较。这可以通过在所有捕获的图像(即激光和探测器设置、像素大小、扫描速度和最佳 z 步长大小)中保持显微镜参数相同来实现。最佳设置取决于目标,可以使用可访问的生物信息学程序(如奈奎斯特计算器 (https://svi.nl/NyquistCalculator))进行计算。系统地标记图像,这将在使用生物信息学软件时非常有用,该软件将组织和处理基于文件名的文件。
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突触区域的定量
- 要分析突触区域,请导出图像作为 TIFF 文件。可以使用基于Java的成像处理软件,如ImageJ(本研究中,使用ImageJ中的MRI图像转换宏)。
- 突触的大小和综合荧光强度水平是从使用CellProfiler-3.1.5获得的z堆栈的总和强度测量的。将图像加载到 CellProfiler3.1.5 软件中。如果需要,可以根据图像文件名筛选图像。
- 设置名称和类型模块。或者,从图像标签中提取元数据以相应地组织计算数据。
- 使用从 uIs115(Pmec-17::tagRFP)转基因表示的漫反射标记RFP,通过手动定义确定突触区域。这可以通过将有关模块添加到 CellProfiler-3.1.5 管道来实现。
- 要测量手定义的突触的大小和荧光,将测量对象大小和形状以及测量对象强度模块添加到管道中。
- 通过添加计算数学模块计算相对集成荧光强度。将从jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP)获得的集成强度单位除以为uIs115(Pmec-17:tagRFP)获取的集成单位。
- 导出测量和计算。
5. 量化身体壁肌结构
- 身体壁肌结构的荧光成像
- 获得携带转基因stEx30(Pmyo-3::gfp:::myo-3 + rol-6 (su1006))的菌株(例如 RW1596),用 GFP 标记肌苷纤维。
注:将转基因引入动物,既可以通过与已经表达转基因的动物交叉兴趣,或者将DNA显微注入果纳德的远端手臂即可实现。这种转基因中rol-6突变引起的"滚动"表型有助于肌肉的可视化。身体壁肌肉沿着背和腹侧运行,这些肌肉在野生型动物中通常无法观看,因为它们通常位于它们的侧侧之一。rol-6(su1006)等位基因诱导动物扭曲,从而暴露一些肌肉细胞进行成像。 - 使用荧光显微镜与高分辨率带电耦合器件摄像机(CCD)、40X物镜或更高、GFP滤波器和采集软件相结合,对动物进行成像。
- 调整曝光时间和照明强度,以防止图像过度饱和。
- 从动物中至少包含一个完全可见的倾斜肌细胞的部分捕获并保存肌肉图像(400 倍放大率)。避免单个肌肉细胞不完整或部分失去焦点的区域。还要排除来自极端前场和后区域以及与外阴相邻的区域的图像。
注:如果动物没有一个可见的完整肌肉细胞,轻轻滑动盖玻片,使动物转动,从而暴露一个完整的细胞。
- 获得携带转基因stEx30(Pmyo-3::gfp:::myo-3 + rol-6 (su1006))的菌株(例如 RW1596),用 GFP 标记肌苷纤维。
- 肌肉细胞面积的测量
- 在斐济软件9中打开图像(本研究使用了 2.0.0 版本)。
- 使用多边形选择仔细跟踪单个倾斜的肌肉细胞。通过拖动锚点来调整末端多边形的线,以改善跟踪。
- 转到软件顶部的"分析"选项卡,然后单击"测量"以计算所选内容的面积。将显示一个单独的结果表,其中包含面积和其他测量值。如果结果表中缺少面积测量值,请转到"分析"选项卡下的"设置测量值",并检查是否勾选了"区域"框。同样,取消勾选不需要的其他测量值。
- 对于具有退化/缺失区域的肌肉细胞,使用多边形选择工具跟踪缺失区域,然后再次单击"测量"。如果单元格内有多个间隙,则分别跟踪每个间隙。
- 计算间隙面积与整个单肌肉细胞的比例。高比率表示由于细胞内的巨大间隙,肌肉退化的程度较高。如果没有缺少的区域(如在野生类动物中常见),则比率将计算为零。
注:作为对照,对肌肉结构缺陷进行视觉评分,并将结果与定量测量进行比较。如果首次在实验室中研究该菌株,则此功能特别有用。对于型板评分,根据灯丝的完整性评估动物有缺陷或无缺陷。例如,由于结构故障而失去明显长丝条纹、GFP结块或肌肉细胞内间隙的动物将被评分为缺陷。
- 肌苷纤维长度的分割与定量
- 如有必要,首先将文件转换为 。使用斐济或其他软件包。将 TIFF 文件保存在所需位置。
- Open ilastik10(免费软件,1.3.2 版可从https://www.ilastik.org/下载)。
- 进入ilastik后,在"创建新项目"下选择像素分类。软件将提示保存项目。重命名项目并保存到所需位置。
注: 新项目只需创建一次。后续分段可以使用同一项目完成。要使用相同的项目设置,请转到顶部的"项目"选项卡,然后单击"打开项目"以访问项目文件。 - 左侧面板上应有 5 个选项卡(输入数据、特征选择、培训、预测导出和批处理)。在"输入数据"选项卡中,单击"添加新",然后添加单独的图像。将弹出窗口定向到包含 TIFF 文件的文件夹,然后选择要打开的图像。
- 在下面的下一个选项卡(功能选择)中,单击"选择要素"以选择所有像素要素,由绿色勾选框指示。此步骤中的像素选择用于在下一步中区分不同类别的像素。
注:像素特征选择取决于图像分辨率。因此,如果处理能力和时间允许,开发人员建议选择所有或尽可能多的功能。 - 以下"训练"面板允许根据像素对不同的对象类进行分类。在这种情况下,这两个类是单独的 GFP 表达肌苷灯丝和不需要的背景或模糊的边缘。单击"添加标签"以具有第一个标签。在一些细丝上爬行,开始分类训练。
注: 双击标签允许更改名称(例如,将"标签 1"重命名为"灯丝")。双击彩色框可更改绘图的颜色和概率显示。画笔的默认大小为 1,但大小可以增加到 61。如果绘制了错误的像素,只需使用橡皮擦工具删除图形即可。键盘控件 (-) 和 (Shift +) 分别可用于放大和缩小图像。箭头键用于在图像周围导航。 - 添加第二个标签并将其重命名为"背景"。在灯丝之间乱涂乱画不需要的背景和空间。
- 单击实时更新,并确保软件已正确完成分类。添加更多的草草,并在必要时微调训练。
注: 在此步骤中,请务必留意合并的纤维和模糊边缘(如体线)。尽可能改进这里的预测,以提高测量的准确性。预测精度还取决于图像分辨率,因为低质量图像中的像素更难区分。它还可选,但建议在实时更新控件旁边的"建议功能"功能中运行筛选器方法。 - 充分执行训练分类器后,转到预测导出面板。单击"选择以概率为源的导出图像设置"。
- 使用以下设置。切口分区域x和y勾选,c 未勾选。c的起始和停止值应分别为 0 和 1。勾选转换中的数据类型并将其转换为无符号的 8 位,勾选重新规范化 [最小值,最大值] 并使用默认值。将输出文件视频的格式更改为 PNG,并根据需要重命名文件和目录。
- 关闭导出设置窗口并导出刚刚分段的特定图像。
- 在斐济软件中打开保存的 PNG 图像。图像应显示为黑白。
- 使用默认设置调整图像的阈值。
- 应用骨架化插件(骨架化 2D/3D,然后分析骨架)。将显示单独的结果表,其中包括分支长度。分支长度表示光纤长度。结果中的其他数据也可能很有用,例如欧几里得距离。
注:省略长度为0 μm或超过250 μm的纤维,因为这些尺寸在生理上是不可能的。
6. 定量线粒体形态
注:为了线粒体形态的定量,本研究使用含有uIs115(Pmec-17:::tagRFP)5转基因的BXN0387菌株来可视化PLM神经元和jsIs609(Pmec-4:MLS:MLS::GFP)11在PLM神经元中专门可视化线粒体。这项研究是在同步3天成年蠕虫,但已成功在其他年龄,以及其他组织7。
- PLM神经元内线粒体的荧光成像
- 要测量 PLM 神经元内线粒体的大小和形状变化,请使用荧光转基因技术可视化背景神经元和线粒体。
- 要对 PLM 神经元进行成像,请使用与 488 nm 和 552 nm 光学泵送半导体二极管激光器耦合的共聚焦显微镜,并配备图像捕获软件。
- 按照上述步骤 4.1.1-4.1.4 对蠕虫进行成像,确保无饱和暴露条件。
- 为了可视化整个神经元,可能需要平铺图像。为此,请使用带有磁贴扫描选项的软件在神经元的一角定位和放置标记,然后找到另一端并放置另一个标记。该软件将计算捕获所需区域所需的最佳切片数。
注: 为了缩短扫描时间,通常更容易找到跟随单个平面的神经元,从而减少切片。 - 要将切片扫描与 Z 堆栈耦合,请确保设置最佳切片大小,在开始切片扫描之前设置下限和上限。
- 确保优化分辨率,因为分割会以更高的分辨率进行更精细的优化(此处使用了 3224 x 3224 像素的分辨率)。
注:虽然uIs115(Pmec-17::tagRFP)转基因用于标记PLM并成功定位相机,但由于从jsIs609(Pmec-4:MLS::GFP)观察到轻微的背景荧光,因此不一定需要成像。PLM 斧内本身中的转基因。因此,通过从实验中去除 552 nm 滤波器,可以缩短扫描和成像时间。
- 使用 SQUASSH 进行对象分段
- 使用斐济成像软件将图像文件转换为.tiff图像,并从 Z 堆栈生成最大强度投影。将图像裁剪到最小大小,同时仍包含完整的神经元,以减少计算负载并降低背景噪音。
注:对于代表性的结果,只考虑长斧子过程中的线粒体,因此细胞体和内任何线粒体都被排除在每个图像之外。 - 使用马赛克套件 SQUASSH 宏进行 ImageJ,对最大投影执行拆分布雷格曼分割12。此宏的安装和应用的详细指南可在马赛克网站 (http://mosaic.mpi-cbg.de/) 和 Rizk 等人描述 2014 13。图像分割过程如下所述。
注: 此分割可识别荧光强度阈值上的对象(在本例中为单个线粒体),从而能够精确测量每个对象的大小和形状。 - 使用滚动球方法从图像中删除背景噪音,其中用户定义的窗口在图像中移动,从每个窗口中发生频率最频繁的强度估算局部背景强度估计值。这纠正了不均匀的背景强度。
- 使用对象检测根据荧光强度和像素数大致查找包含感兴趣对象(线粒体)的图像区域。控制此步骤的参数是正则化和最小对象强度。
注: 正正化用于避免分割小强度、噪声引起的峰,最小物体强度阈值有助于从背景组织荧光定义亚细胞细胞器。这些是为找到线粒体的最佳分段而操作的主要两个参数,优化过程往往是测试图像不同参数的试错,然后是手动检测。 - 使用该软件估计每个对象周围的局部背景强度,以帮助计算最佳分段。
- 通过像素数测量单个对象的大小、周长、长度以及图像上的信号强度和 x/y 位置。要计算大小 (nm) 的测量值,应考虑原始图像的像素大小。
注:对于每个实验,必须首先计算最佳参数。为确保分段的准确性,建议对测试图像执行 SQUASSH 分析,并手动检查分段的准确性。宏提供输出文件,显示原始图像上标识的各个对象,并仔细检查这些对象并调整参数以适合,可确保准确的分割。然后,必须在整个实验中使用定义的参数,以便获得可比性。表2中包含用于代表性结果的参数。 - 打开斐济或 ImageJ 分析软件,导航到马赛克宏容器并打开 SQUASSH 菜单。
- 打开后台减法减法减单,并确保选中"删除背景"窗口大小的默认值为 10。
- 设置所需的正则化和最小对象强度,通道 1值可最好地标识和分割对象(请参阅步骤 6.2.4)。对于标有单个转基因的对象,通道 2 值是不必要的。
- 单击目标属性的"估计PSF",根据显微镜的特性估计点扩散函数。这有助于通过考虑每个像素对其相邻像素的影响来分割位置紧密的对象。
注:由于子像素分割增加了计算机处理能力的负载,因此本实验中未使用子像素分段。细胞掩码也没有使用,因为斧子很容易定义。这些设置对于更复杂的组织和按单元格定义对象非常有用。 - 对于可视化选项,请确保选中对象轮廓和保存对象和图像特征。以后在图形和统计软件中使用,请确保输入正确的条件数。
- 找到具有.tiff图像的文件夹并运行宏。此过程可以针对单个图像或位于文件夹中每个基因型的一批图像执行。输出文件将与原始图像一起位于文件夹中。
- 使用斐济成像软件将图像文件转换为.tiff图像,并从 Z 堆栈生成最大强度投影。将图像裁剪到最小大小,同时仍包含完整的神经元,以减少计算负载并降低背景噪音。
- 形状分析和测量
- 使用 SQUASSH 的输出提供逐项对象数据.csv文件,该文件每行提供每个单独的对象,包括如上所述的测量值。
注: 虽然此宏过程可自动执行对象测量,但始终务必在 SQUASSH 分段后手动检查输出图像,以确保宏已正确识别线粒体。 - 为了分析每个线粒体的形状,使用二维测量物的星体,循环,估计物体与完美圆的偏差。
注: 圆形是面积和周长的函数(循环 = (4 x +) x(面积/周长 2),其中 1 = 一个完美的圆,0 = 直线。这可以通过图形和统计软件中的公式来实现。 - 要确定线粒体池中大小和形状的差异,请使用图形和统计软件计算直方图和拟合高斯分布,线粒体尺寸为 0.2 μm,线粒体循环为 0.05。
- 使用 SQUASSH 的输出提供逐项对象数据.csv文件,该文件每行提供每个单独的对象,包括如上所述的测量值。
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Representative Results
C. elegans是研究不同组织和细胞器形态的理想模型有机体,由于其简单、已知的细胞系、透明度和可用的工具。在这里,我们提供定量方法,用于研究细胞器(例如线粒体)和组织,包括使用实时荧光成像和免费生物图像处理软件的突触和肌肉。
正常突触开发需要严格管理 MEC-17 表达
为了进一步了解α-tubulin乙酰转移酶MEC-17在神经系统中的功能,我们研究了C.elegans过度表达蛋白质17的触摸受体神经元的突触形态学。这些细胞结构对神经元功能至关重要,因为它们允许信号传递到相邻的神经元。使用激光扫描共聚焦显微镜采集PLM突触图像,并使用可访问的生物图像处理软件进行定量形态分析(图1A,B)。MEC-17的过度表达导致PLM的突触前积累面积显著减少,SNB-1::GFP标记的相对集成荧光强度降低(图1C,D)。总之,这些结果表明,MEC-17的过度表达会破坏PLM触摸受体神经元的正常突触发育。
使用免费的生物图像处理软件CellProfiler3.1.5研究了先发前位点的大小和相对集成的荧光。由于其复杂的结构,突触是用手定义的,使用从uIs115(Pmec-17::tagRFP)转基因表达的漫射tagRFP蛋白。定义的突触区域由定义区域内的像素数计算。与野生型控制相比,过度表达MEC-17的动物显著减少了突触前区域(P = 0.0025;n = 10)(图1C)。 此外,为了研究突触完整性,比较了相对集成的荧光强度水平。这是通过测量SNB-1:GFP和可扩散的tagRFP在定义的突触内的集成荧光强度水平来计算的。随后,将 SNB-1::GFP 荧光值相对于 tagRFP 值进行比较,其中观察到 MEC-17 的过度表达显著下降 (P = 0.0479;n = 10)。 总之,这些结果表明,MEC-17的正确调节对突触发展很重要。
身体壁肌细胞面积和纤维长度的定量测量揭示了CMT2相关基因突变导致的重大缺陷
基因MFN2、DNM2和KIF5A的突变已被证明会导致Charcot-Marie-Tooth型2型(CMT2),这是最常见的遗传性外周神经病变18,19的一种斧头形式。CMT2通常与缓慢渐进的远端肌肉无力和萎缩,远端感觉损伤,足部畸形和继步步道相关。因此,患者经常遭受使人衰弱的终身行动障碍。目前没有治愈这种疾病的方法,部分原因是与CMT219相关的遗传和临床异质性,以及缺乏研究疾病病理生理学的动物模型。因此,使用动物模型来了解潜在的细胞缺陷可以提供未知CMT2疾病机制的答案。
到目前为止,在评估C.elegans体壁肌肉缺陷的已发表的研究依赖于视觉评分,而不是定量测量20。为了避免定性评估过程中可能出现的主观偏差,利用现有的图像处理程序,对身体壁肌面积和肌苷纤维长度进行了定量测量。我们使用这些方法来评估携带fzo-1/MFN2、dyn-1/DNM2和unc-116/KIF5A基因突变的动物的肌肉形态。对于这两种测量,都应用了一些条件,例如,至少一个完整的斜肌细胞在视图中,模糊或失去焦点的肌肉细胞被排除,极端前部和后部区域,以及毗邻的区域外阴被省略。除了CMT2相关基因的突变外,动物还携带stEx30(Pmyo-3:gfp::myo-3=rol-6(su1006))的转基因,该转基因用GFP(图2A-E)标记C.elegans肌苷重链亚单位。 斐济软件 9(2.0.0 版)中的简单多边形工具用于测量单个肌肉细胞的面积。如果动物经历身体壁肌结构崩溃,在肌肉细胞内留下空白空间,则计算间隙面积与单肌肉细胞总面积的比率,并将其与野生型对照(图3A)。为了获得肌苷纤维长度的测量,首先使用 ilastik 软件10(版本 1.3.0)对每幅图像进行分割(图 3B)。分割是一个过程,允许个别肌肉纤维被分类,并从不需要的部分,如背景分离。分段后,图像导出为未分配的 8 位二进制图像。接下来,斐济(2.0.0 版)用于骨架二进制图像以筛选出边框像素,留下表示原始光纤的片段。骷髅的分支长度,或个体肌苷丝,然后在斐济进行分析。排除了长度测量 0 或超过 250 μm,这是灯丝的最大合理长度,即使肌肉拉伸, 也被排除在外。总共测量了2000至3000肌苷纤维长度。分段工作流的摘要如图3B所示。定量分析的结果与身体壁肌缺陷的视觉评分进行了进一步比较,根据肌肉结构的完整性,3天老动物被归类为缺陷或无缺陷。
在视觉评估期间,在fzo-1(cjn020)、dyn-1(ky51)和unc-116(e2310)动物中观察到身体壁肌形态的缺陷比在动物身上高2.5至3.5倍(图4A)。 大多数在fzo-1和unc-116发生突变的动物都经历了明显的肌肉条纹损失,由于细胞碎片的积累导致大的GFP聚集,以及肌肉纤维退化,在肌肉细胞内留下空白(图 2C,E。相比之下,虽然超过60%的dyn-1突变体在视觉上存在缺陷,但与其他两个基因突变体相比,缺陷程度很小。与其他两个突变体相比,只有轻微的条纹损失,没有GFP聚集,只有轻微的肌肉退化(图2D和图4A)。与其他型板得分一样,不能考虑缺陷的程度,而偏见倾向可能导致登记的较大比例的缺陷。因此,对肌肉细胞面积和纤维长度的定量测量比仅进行视觉评估能更准确地反映肌肉缺陷的程度。与视觉评分观察到的巨大差距一致,在fzo-1和unc-116突变动物中,间隙面积与单细胞总面积之比比野生型动物高出5至6倍,而野生类动物的分差值仅为1倍。肌肉结构崩溃 (图 4B).dyn-1突变体缺乏结构崩溃,导致间隙与肌肉细胞面积比增加3倍(图4B)。这也表明,实验者的偏见可能是导致定性评估所分配的缺陷比例高的一个因素。然而,小间隙将野生型的24μm平均纤维长度减少到dyn-1突变体中的22μm(图4C)。在fzo-1和unc-116突变体中,平均纤维长度显著缩短,与这些动物中退化肌肉细胞中存在较大间隙有关(图2C、E和图4C).这些结果与我们最近研究C.elegans20中突变的CMT2-酶基因的影响的发现一致。此外,他们强调使用这些定量方法比视觉评分更精确的评估肌肉形态,并提供证据,证明fzo-1和unc-116是正常肌肉形态所必需的。
使用SQUASSH对象分割对线粒体形态的定量测量
为了了解线粒体裂变的缺失如何影响C.elegans神经元的线粒体形态学,我们在PLM美形感神经元中进行了定量分析。DRP-1,哺乳动物Dynamin相关蛋白1(DRP1)的C.elegans正交,控制线粒体裂变,激活后从细胞醇中招募,形成围绕线粒体的螺旋,收缩并最终切断两者内部和外部线粒体膜21,22。我们在PLM神经元中用组织特异性转基因荧光标记线粒体,其具有长的斧道过程,可以使用荧光显微镜轻松可视化。裂变的丧失被假设破坏整体线粒体动力学,因此通过称为萌芽23的过程减少更新,更小的线粒体的产生。
我们进行了SQUASSH分段,以比较野生型和drp-1突变动物的线粒体形态。我们分析了每个基因型6个PLM神经元的线粒体,结果每个基因型的n值大于200线粒体。图5A,B显示了原理图和代表性图像。我们发现缺乏DRP-1的突变体有更大和更细长的线粒体(图5B-F)。drp-1突变背景中的线粒体比野生型(P = 0.0006,图5C)大32%,细长14%(距离完美圆圈更远)(P <0.0001,图5D)。 为了更详细地评估大小和形状的差异,我们绘制了每个度量值的直方图,将数据拟合到高斯分布(图 5E,F)。我们发现,对于大小和循环,缺乏裂变蛋白的突变体具有较大的变异(p < 0.0001,两者均为)所示,突出于存在更大和更长的线粒体/线粒体网络(参见图5Bii,参见示例).总体而言,我们发现证据表明drp-1的突变导致PLM神经元内缺乏裂变,导致更大和更细长的线粒体。我们还证明,线粒体裂变的中断会导致线粒体形态变异的增加。
图1:PLM神经元突触完整性的量化。(A)图像是非转基因动物中PLM突触区域的最大z投影。左侧面板显示标有 tagRFP 的 PLM 神经元,第二个面板显示标有 SNB-1::GFP 的预突触区域,第三个图像是以黄色表示的共同定位的叠加,第四个面板是叠加图像的示意图。(B)过度表达MEC-17的动物突触区域的最大z投影共聚焦图像。图像按面板A.(C)非转基因前突触区域的定量显示,而转基因动物则过度表达 MEC-17。(D)非转基因生物与转基因动物在MEC-17中相对综合荧光水平的定量:GFP。对于 (C) 和 (D),分析的单个突触由圆圈表示;n = 10;均值 = S.E. 以黑色显示。P值 = < 0.05, = < 0.01 来自未配对的 t- 测试;刻度条表示 2 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:C.elegans身体壁肌的可视化。(A) 表达stEx30(Pmyo-3:gfp::myo-3= rol-6(su1006))转基因的动物,在身体壁肌中标注肌苷重链与GFP。该阵列还诱导动物的滚动表型,促进沿身体的背和腹侧排列的肌肉细胞的可视化。代表放大了(B)野生型、(C)fzo-1(cjn020)、(D)dyn-1(ky51)和(E)unc-116(e2310)动物中的肌苷纤维视图。 所有动物都拍摄了3天成人期的照片。刻度表示 60 μm (A) 和 30 μm (B-E)。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:使用可用的计算算法测量身体壁肌面积和纤维长度。(A)示例图像演示如何在斐济绘制和计算单个肌肉细胞内的内部间隙空间(红色封闭)和整个细胞区域(黄色封闭)以获得肌肉面积比率。(B)使用斐济和ilastik组合对单个示例图像的分割协议概述。比例尺表示30μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:体壁肌肉缺陷的鉴定和量化。(A)身体壁肌缺陷的视觉评估。(B)WT和指示突变体之间的空白空间面积与总肌肉细胞面积比的比较。(C)肌苷纤维长度的测量。对于 (B) 和 (C),仅包含至少一个完全可见倾斜肌细胞的图像进行分析。还排除了长度为0μm或超过250μm的纤维。条形代表 (A) 中缺陷动物的百分比,在 (B) 和 (C) 中表示 S.E.M. 的平均值;每个条形中列出的 n 个值。用错误发现率的奇方测试比较(A)中的视觉缺陷,而使用单向ANOVA与Dunnett的后临时测试进行多次比较,以分析(B)和(C)中的定量测量。•P < 0.05, =P < 0.0001, ns = 不显著。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:PLM神经元的斧子内的线粒体形态。(A)后侧微管 (PLM) 在C. elegans尾部的微管 (PLM) 的显性感觉神经元的原理图。红色框表示(B)中突出显示部分的大致位置,其中显示了在 PLM 斧片中标有线粒体的 GFP (Pmec-4::MLS::GFP) 的代表性图像。明亮的绿色双子项表示线粒体。与WT(i),drp-1(tm1108)突变体(ii)显示更大,更细的线粒体。 图像代表n = 6 PLM斧子从6个蠕虫每个基因型;刻度柱 = 15 μm。(C)在3天成人(3DOA)蠕虫中通过SQUASSH对象分割对个体线粒体的平均大小(μm2)进行量化。(D) PLM 斧状内单个线粒体的平均循环性,从 3DOA 中的 SQUASSH 物体测量值中量化。(E)直方图和高斯分布,显示线粒体大小的方差。F 检验(P < 0.0001) 显示drp-1和WT(F)直方图和高斯分布之间的方差显著不同,显示线粒体圆度方差。数据表示为平均值 +/- SEM. = P < 0.001,= P <0.0001 来自 Welch 的 t 检验;n = 204 线粒体,用于从n = 6 蠕虫进行定量分析。请点击此处查看此图的较大版本。
| 应变名称 | 基因 | 源 | 参考# | ||
| BXN038 | uIs115(Pmec-17::tagRFP);jsIs609(Pmec-4::MLS::GFP) | 诺伊曼实验室 | 7 | ||
| BXN366 | fzo-1(cjn020);myo-3(st386);zdIs5(Pmec-4::GFP);stEx30 (Pmyo-3:gfp:::myo-3 = rol-6 (su1006)) | 诺伊曼实验室 | 20 | ||
| BXN419 | drp-1(tm1108);jsIs609(Pmec-4::MLS::GFP);uIs115(Pmec-17::tagRFP) | 诺伊曼实验室 | 7 | ||
| BXN507 | cjnEx036(Pmec-4::mec-17,Pmyo-2::mCherry);jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP);lin-15B&lin-15A (n765);uIs115(Pmec-17::tagRFP) | 诺伊曼实验室 | 17 | ||
| BXN675 | unc-116(e2310);myo-3(st386);stEx30 (Pmyo-3:gfp:::myo-3 = rol-6 (su1006)) | 诺伊曼实验室 | 20 | ||
| BXN685 | dyn-1(ky51);myo-3(st386);stEx30 (Pmyo-3:gfp:::myo-3 = rol-6 (su1006)) | 诺伊曼实验室 | 20 | ||
| NM664 | jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP);林-15B&lin-15A (n765) | 卡埃奥哈布迪炎遗传学中心 | 6 | ||
| RW1596 | myo-3(st386);stEx30 (Pmyo-3:gfp:::myo-3 = rol-6 (su1006)) | 卡埃奥哈布迪炎遗传学中心 | 8 | ||
| TU4065 | uIs115(Pmec-17::tagRFP) | 马丁·查菲 | 5 | ||
表 1.本研究中使用的C.elegan菌株列表。
| PLM 斧子图像 | |
| 目的 | 40 倍 |
| 图像分辨率(每个面板用于切片) | 3224 x 3224 |
| 背景删除窗口大小 | 20 |
| PSF xy | 0.78 |
| PSF z | 0.68 |
| 正规化 | 0.15 |
| GFP的最小荧光强度 | 0.4 |
表2.用于线粒体分割的SQUASSH参数。
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Discussion
形态变异经常通过手工计算明显差异或使用任意阈值来确定与野生型表型相比的缺陷来评估。然而,最近,定量方法被用于形态学的比较研究,以无偏见的方式准确测量和描述细胞和亚细胞水平上的变化。识别表型之间微妙但与生物学相关差异的能力是了解控制由环境因素或遗传疾病引起的形态变化的基本分子机制的有力手段。计算能力和显微镜成像分辨率的不断提高,加上C. elegans遗传学的易长性和多功能性,为复杂而自由成像软件的组合提供了完美的平台与精细的详细共聚焦图像。在这里,我们已经演示了在一系列遗传背景中评估和量化突触大小和蛋白质定位、体壁肌肉面积和纤维长度以及线粒体形态的方法。
虽然这些分析已经证明了量化细微形态差异的能力,但存在局限性。尽管这些分析中的每一个都使用开源和现成的软件,但它们依靠高质量、清晰的图像来准确解析细胞结构和亚细胞器。这通常是一个限制步骤,因为敏感的高端设备(如带有先进探测器的共聚焦显微镜)需要以令人满意的分辨率捕获图像。实验室并不总是能够访问这些,并且使用低于标准技术的分析可能会导致不准确和不可重复的结果。此外,虽然每种技术都旨在通过使用计算机算法来减少实验者的偏见,但仍有一些步骤可能涉及人为错误元素。手工合成的手动定义、肌肉细胞区域的概述、按眼进行线粒体分割的参数优化都是可以改进的方面。为了减少人为错误的机会,可以盲目地进行研究,或者使用图像分析软件来定义感兴趣的区域本身。使用细胞掩膜(其中所需的分析区域由不同波长的荧光定义)可能有助于这一点。这用于将分析限制在图像中显示荧光超过设定阈值的部分,如细胞核或转染细胞13、24。此外,使用单时点图像限制了这些技术可以解决的问题。控制细胞形态、突触形成和肌肉结构的过程很可能是动态的,根据发育或生物状态,在同一细胞内可以看到差异。因此,在特定终点对这些结构进行分析可以加以限制,延时成像将有助于监测结构随时间的变化。最后,虽然形态变化可以很好地反映细胞过程的中断,但相关性并不总是隐含的。例如,最近不同物种的发现表明,线粒体功能和形态确实可以分离7,25。因此,在推断由于形态差异而导致的功能变化时,必须考虑额外的检测。
我们已经能够证明这些定量技术在一组特定的组织和遗传背景中得到了应用;但是,它们的用法可以更广泛地应用。通过成像软件进行荧光定量可用于分析一系列不同的亚细胞细胞,如核和内体,或不同的结构,如神经元和上皮细胞,所有这些都在不同的突变或疾病范围内背景。
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Disclosures
提交人宣称他们没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
我们感谢 Neumann 实验室的成员进行了宝贵的讨论和投入。一些菌株由CGC提供,由NIH研究基础设施项目办公室(P40 OD010440)资助。作者感谢WormBase提供了丰富的关于C.elegans的信息,并感谢莫纳什大学的莫纳什微成像提供了仪器、培训和技术支持。这项工作得到了CMTAA研究资助(2015年和2018年)的支持,NHMRC项目赠款1101974和1099690授予了B.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
References
- Brenner, S.
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
- Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
- Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
- Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
- Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
- Akella, J. S., et al.
- Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
- Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
- Teoh, J. -S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
- Bird, T. D. Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , GeneReviews [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2019. [Updated 2016 Apr 14] Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1285/ (1998).
- Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
- Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
- Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
- Zhu, P. -P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
- Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
- Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
- Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).
