Summary
Deze studie schetst kwantitatieve metingen van synaptische grootte en lokalisatie, spier morfologie, en mitochondriale vorm in C. elegans met behulp van vrij beschikbare beeldverwerkings hulpmiddelen. Deze aanpak maakt het mogelijk toekomstige studies in C. elegans te kwantificatief vergelijken de omvang van weefsel en organel structurele veranderingen als gevolg van genetische mutaties.
Abstract
Het definiëren van de cellulaire mechanismen onderliggende ziekte is essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe Therapeutics. Een strategie die vaak wordt gebruikt om deze mechanismen te ontrafelen, is het introduceren van mutaties in kandidaatgenen en het kwalitatief beschrijven van veranderingen in de morfologie van weefsels en cellulaire organellen. Kwalitatieve beschrijvingen kunnen echter geen subtiele fenotypische verschillen vertonen, kunnen de fenotypische variaties tussen individuen in een populatie verkeerd voorstellen en worden vaak subjectief beoordeeld. Hier worden kwantitatieve benaderingen beschreven om de morfologie van weefsels en organellen in de nematode Caenorhabditis elegans te bestuderen met behulp van laser scanning confocale microscopie in combinatie met commercieel verkrijgbare bio-beeld Verwerkingssoftware. Een kwantitatieve analyse van fenotypes die de synaps integriteit beïnvloeden (grootte en geïntegreerde fluorescentie niveaus), spierontwikkeling (spier Celgrootte en myosine filament lengte), en mitochondriale morfologie (circulariteit en grootte) werd uitgevoerd om te begrijpen de effecten van genetische mutaties op deze cellulaire structuren. Deze kwantitatieve benaderingen zijn niet beperkt tot de hier beschreven toepassingen, omdat ze gemakkelijk kunnen worden gebruikt om de morfologie van andere weefsels en organellen in de nematode, evenals in andere model organismen, te kwantificeerbare beoordeling.
Introduction
De nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) wordt steeds meer gebruikt als een modelsysteem om de biologische en moleculaire processen die betrokken zijn bij menselijke ziekten te ontdekken. Een volwassen nematode heeft een lichaamslengte van iets meer dan 1 mm en kan een grote broed van maximaal 300 eieren produceren1. Na het uitkomen, C. elegans vereisen slechts 3-4 dagen om volwassenheid te bereiken, en leven voor ongeveer 2 tot 3 weken2. Vanwege het gemak van het kweken, is C. elegans momenteel een van de meest gewilde in vivo diermodellen voor het uitvoeren van kosteneffectieve, snelle geneesmiddelen screening om therapieën voor menselijke ziekten te identificeren. Bovendien, de genetische instandhouding, goed gedefinieerde gedrags paradigma's, transparante lichaam voor fluorescentie of lichte microscopie, en het gemak van genetische manipulatie maken de studie van cellulaire en moleculaire gevolgen van genetische mutaties gemakkelijk te Behaal bare 3. de C. elegans genoom deelt ongeveer 60-80% orthologie met menselijke genen, en ongeveer 40% van die genen staat bekend als ziekte-gerelateerd. Sommige van de menselijke ziekten die zijn gemodelleerd en bestudeerd in C. elegans omvatten neurodegeneratieve aandoeningen (de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, Amyotrofische laterale sclerose, Charcot-Marie-Tooth ziekte), spier-geassocieerde ziekten ( Spierdystrofie van Duchenne), en metabole ziekten (hyperglycemie)2,4. Bij de meeste menselijke aandoeningen, ziekte-geïnduceerde cellulaire en organel lokalisatie en morfologische veranderingen optreden, die gemakkelijk kunnen worden geëvalueerd in de nematode model.
Fluorescerende markers zijn op grote schaal gebruikt om weefsels en organellen te labelen voor dynamische visualisatie onder de Microscoop. In C. eleganshebben conventionele methoden die morfologische onregelmatigheden als gevolg van genetische mutaties beoordelen, zich echter grotendeels gebaseerd op visuele beschrijvingen. Hoewel kwalitatieve evaluaties een breder bereik van fenotypische beschrijvingen kunnen omvatten (synaptische morfologie, GFP-clumping, specifieke axonale vorm, dikte van de spiervezels, enz.) en een vogel beeld van de morfologische veranderingen bieden, zijn ze minder goed geschikt voor kleine variaties in verschillende groepen vergelijken. Bovendien zijn kwalitatieve evaluaties gebaseerd op een visuele, subjectieve evaluatie, die kan leiden tot overmatige of onderschattingen van morfologische afwijkingen. Ten slotte kunnen kwalitatieve waarnemingen ook sterk variëren tussen individuen, waardoor problemen ontstaan met gegevensreplicatie.
In de afgelopen jaren zijn een aantal gebruiksvriendelijke, gemakkelijk beschikbare computeralgoritmen ontwikkeld die afbeeldingen kwantitatief kunnen analyseren. Echter, het gebruik van dergelijke beeldanalyse software voor sommige morfologische studies, vooral met betrekking tot de spieren van het lichaam van de muur en de mitochondriën, in C. elegans onderzoek is achtergebleven achter. Ter verbetering van de onderliggende structurele analyse in C. elegans, sommige van de gemakkelijk beschikbare, open-source beeldanalyse software werden getrialed om kwantitatief te vergelijken de effecten van genetische mutaties op de spier mitochondriën, Body Wall spier en synaptische Morfologie. Deze experimentele procedures schetsen in detail hoe deze programma's (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) kan worden gebruikt voor het evalueren van veranderingen in de synaptische grootte en synaptische eiwit lokalisatie, lichaam muur spier gebied en vezellengte, en mitochondriale grootte en circulariteit als gevolg van genetische mutaties in de nematode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. groei en onderhoud van C. elegans stammen
- Zaad nematode groei medium (NGM, Zie tabel van de materialen) agar-platen met 300 μL van de langzaam groeiende E. coli stam OP50 in een laminaire flowkast.
- Laat de NGM agar-platen in de laminaire flowkast drogen.
Opmerking: bij afwezigheid van een laminaire flowkast kunnen platen op de Bank worden achtergelaten, maar ze zijn gevoeliger voor verontreiniging. - Breng ten minste 20 dieren over naar elk van de twee OP50-geseede NGM-agar-platen om te werken. Er zijn twee belangrijke manieren om dieren over te brengen.
- Plukken: Til de dieren voorzichtig op met een warmtegesteriliseerde pick. Deze methode is effectief voor het selecteren van individuele of meervoudige dieren van een agar-plaat. Het hebben van een kleine Schraap van bacteriën bij de tip bij het plukken helpt de overdracht.
Let op: een pick is gemaakt van een klein stukje platina draad van ongeveer 4 cm lang dat is ingebed in een glazen pipet, waarbij de draad uiteinde afgevlakt is om ' speer achtig ' te zijn. Verwarm de pick tussen het plukken om kruisbesmetting te voorkomen. - Chunking: met behulp van een gesteriliseerde spatel, snijd een klein vierkant van agar met de dieren van een plaat en ondersteboven overgebracht naar een nieuwe plaat.
OPMERKINGEN: deze methode is over het algemeen nuttig voor het overbrengen van grote aantallen wormen en om verontreiniging van platen te verwijderen door middel van meerdere rondes van niet-verontreinigde agar te verdelen. Vermijd kruisbesmetting door het Flaming van de spatel voor een paar seconden en onderdompelen van de spatel in 100% ethanol tussen transfers. Overbrengen van uitgehongerd platen wordt niet aanbevolen als verhongering en overbevolking kan invloed hebben op de gezondheid en morfologie van cellulaire en subcellulaire structuren.
- Plukken: Til de dieren voorzichtig op met een warmtegesteriliseerde pick. Deze methode is effectief voor het selecteren van individuele of meervoudige dieren van een agar-plaat. Het hebben van een kleine Schraap van bacteriën bij de tip bij het plukken helpt de overdracht.
- Houd de wormen bij standaard groei temperatuur (20 °C). Om een continue toevoer van goed gevoede wormen te garanderen, breng je de wormen om de 2 tot 3 dagen over naar nieuwe OP50-geseede platen.
2. leeftijd-synchroniseren C. elegans
- Onderhoud de wormen op 3-4 NGM-platen totdat de populatie druk is, maar niet uitgehongerd.
- Was de wormen voorzichtig van de NGM plaat met M9 oplossing. De eieren blijven op de plaat omdat ze vasthouden aan de E. coli OP50. Herhaal dit met vier extra wasstappen om alle gearceerde dieren te verwijderen.
- Laat de wormen uitkomen voor 40 min.
- Voeg 1-2 mL M9-oplossing aan de plaat toe en zwenk voorzichtig om recent uitgekomen wormen los te maken.
- Verzamel de M9-oplossing met recent geboren wormen en breng de oplossing met wormen over naar een nieuwe NGM-plaat.
- Laat de M9-oplossing verdampen door de NGM-plaat aan de lucht bloot te stellen. Doe dit naast een open vlam om besmetting van de NGM-plaat te voorkomen.
- Groei de wormen voor 27 uur bij 20 °C om ontwikkeling in de derde fase van de larvale (L3) mogelijk te maken. Voor gesynchroniseerde 3-daagse oude volwassen dieren worden de wormen geplukt in larvale Stage 4 en worden ze nog eens 3 dagen lang gekweekt om een 3-daags oud volwassen podium te bereiken.
3. voorbereiding van dia's voorbeeld vorming
- Bereid 3-4% g/v agarose voorraad in een magnetron veilige fles (3-4 g in 100 mL ultrapuur water).
Opmerking: agar kan worden gebruikt in plaats van agarose bij dezelfde concentratie. - Smelt de agarose voorzichtig in een microgolfoven, zorg dat u niet overkookt, totdat alle agarose oplost (heldere oplossing). Houd de oplossing bij 70 °C om stollen te voorkomen.
Opmerking: agarose voorraad kan meerdere malen worden gebruikt. Opwarmen voor gebruik als de agarose is gestomgd. - Gebruik een Pasteur-pipet en plaats een druppel gesmolten agarose op een Microscoop-dia.
Opmerking: Vermijd luchtbellen in de druppel agar omdat deze de integriteit van de pad verstoren. - Druk de agarose-druppel onmiddellijk met een andere Microscoop-dia omlaag, waarbij de agarose zachtjes wordt afgeplat tot een pad tussen de twee dia's.
Opmerking: eventuele overgebleven bubbels moeten in dit stadium worden verwijderd. Zo niet, dan moeten er nieuwe dia's worden gemaakt, want dieren kunnen gemakkelijk vast komen te zitten in de bubbels. Vermijd overloop van agar aan de zijkant wanneer u op de glijbaan drukt. - Laat de agarose 1 minuut drogen.
- Scheid de twee glaasjes voorzichtig om beschadiging van de agarose te voorkomen, terwijl het gestijde pad op een van de dia's wordt verlaten.
Opmerking: Dia's met agarose pads moeten altijd vers worden bereid vlak voor het experiment, omdat ze kunnen uitdrogen. Zorg ervoor dat het agarose-pad een consistente dikte heeft. Er mogen geen luchtbellen of scheuren in de pad zijn, omdat dit de beeldvorming kan verstoren. - Voeg een kleine druppel (5-10 μL) van 0,05% tetramisole hydrochloride (anestheticum) toe aan het midden van het agarose pad.
- Gebruik warmtegesteriliseerde pick en breng snel ongeveer 10 – 15 dieren over van de voorraad plaat naar de verdovings druppel voordat de oplossing uitdroogt. Vermijd het overdragen van teveel OP50 bacteriën omdat dit de oplossing troebel maakt, wat kan interfereren met beeldvorming.
Opmerking: als de verdovings oplossing uitdroogt tijdens het plukken, pipetteer dan gewoon een tweede druppel van 0,05% tetramisole hydrochloride op de dieren. De dieren hebben de neiging om op hun laterale zijde in de anesthetische oplossing te leggen. - Breng een dekslip aan door deze net boven de agarose pad te plaatsen en zachtjes neer te zetten. Dit voorkomt de vorming van bubbels. Druk niet op de Afdeklijst omdat dit de dieren kan verpletteren.
- Label de dia's met de naam van de stam.
4. beoordeling van de synaptische morfologie
Opmerking: de effecten van MEC-17 overexpressie op de synaps integriteit in de posterieure laterale microtubulus (PLM) Touch receptor neuronen werden bestudeerd door het kwantificeren van de synaptische grootte en lokalisatie met behulp van lijn Scanning confocale microscopie. De PLM-neuronen (inclusief de synaptische regio's) werden gevisualiseerd met behulp van de uIs115 (pmec-17:: tagrfp) transgen (stam: TU40655) en de synaptische regio werd specifiek gelabeld met jsIs37 (pmec-7:: SNB-1:: GFP) (stam: NM664 6) . Deze studie werd uitgevoerd in gesynchroniseerde L3 niet-transgene en transgene dieren van de extrachromosomale MEC-17 overexpressie stam BXN507 [cjnEx036 (Pmec-4:: MEC-17, Pmyo-2:: mCherry); jsIs37; uIs115]7. Een volledige lijst van stammen die in deze studie worden gebruikt, is opgenomen in tabel 1.
- Confocale beeldvorming van touch receptor neuron synapsen
- Om het beeld van de synaptische regio's, gebruik maken van een lijn Scanning confocale Microscoop gekoppeld aan een 488 nm en 552 nm optisch gepompt halfgeleider diode laser en uitgerust met beeld Capture software.
- Zoek de wormen met de laagste vergroting.
- Wanneer de dieren met succes zijn gelegen, overschakelen naar een 40X vergroting en dompel medium (in deze studie: een 40X/1.10 HC PL APO CS2 multi-immersive doelstelling met water onderdompeling werd gebruikt).
- Visualiseer de synaptische regio door de fluor Foren te opwinden met een 488 nm Laser (2% vermogen) voor de GFP de en 552 nm (1% vermogen) voor de tagrfp de.
- Bepaal het optimale x-en y-frame om de hele synaptische-regio vast te leggen. Zorg ervoor dat u rekening houden met de optimale pixelgrootte bij het selecteren van het frame. In deze studie werd een consistente pixelgrootte van 56 nm verkregen.
- Leg beelden vast met behulp van een hybride foto-detector en stel de winsten in om overmatige blootstelling van de fluor Foren te voorkomen (100% voor 488 nm excitatie en 15% voor 552 nm excitatie).
- Verzamel z-stack-afbeeldingen om de hele SYNAPS te bedekken, met behulp van de optimale z-stapgrootte, afhankelijk van de specifieke doelstelling die wordt gebruikt. In deze studie werd een optimale z-Step grootte van 0,211 nm gebruikt.
Let op: Zorg ervoor dat alle beelden onder strenge voorwaarden worden genomen om een geïntegreerde fluorescentie kwantificering en vergelijking mogelijk te maken. Dit kan worden gedaan door microscopie-parameters identiek te houden voor alle vastgelegde afbeeldingen (d.w.z. laser-en detector-instellingen, pixelgrootte, scansnelheid en optimale z-stapgrootte). Optimale instellingen zijn afhankelijk van het doel en kunnen worden berekend met behulp van toegankelijke bioinformatica Programma's, zoals de Nyquist Calculator (https://svi.nl/NyquistCalculator). Label afbeeldingen systematisch, dit zal nuttig zijn bij het gebruik van bioinformatica software die zal organiseren en verwerken van bestanden op basis van bestandsnaam.
-
Kwantificering van de synaptische regio
- Als u de synaptische-regio wilt analyseren, exporteert u afbeeldingen als TIFF-bestanden. Op Java gebaseerde beeldverwerkingssoftware zoals ImageJ kan worden gebruikt (in deze studie werd de macro voor MRI-afbeeldings conversie in ImageJ gebruikt).
- De grootte en de geïntegreerde fluorescentie intensiteitsniveaus van synapsen werden gemeten vanaf de som-intensiteit van de verkregen z-stacks met CellProfiler-3.1.5. Laad de afbeeldingen in de CellProfiler 3.1.5-software. Indien nodig kunnen afbeeldingen worden gefilterd op basis van afbeeldings bestandsnamen.
- Stel de modulenaam en type in. U desgewenst de metagegevens uit het label van de afbeelding extraheren om deze dienovereenkomstig te ordenen.
- Bepaal de synaptische regio met de hand definitie van deze regio met behulp van de diffuse tagRFP uitgedrukt uit de uIs115 (Pmec-17:: tagrfp) transgene. Dit kan worden gedaan door het toevoegen van de betreffende module aan de CellProfiler-3.1.5 pijplijn.
- Als u de grootte en fluorescentie van de met de hand gedefinieerde SYNAPS wilt meten, voegt u de intensiteits module Measure - object grootte en vorm en meet object toe aan de pijplijn.
- Bereken de relatieve geïntegreerde fluorescentie intensiteit door de reken module berekenen toe te voegen. Verdeel de geïntegreerde intensiteits eenheden van jsIs37 (pmec-7:: SNB-1:: GFP) door de geïntegreerde eenheden die zijn verkregen voor UIs115 (pmec-17:: tagrfp).
- Metingen en berekeningen exporteren.
5. kwantificerende Body wand spierstructuur
- Fluorescentie beeldvorming van lichaam wand spierstructuur
- Verkrijgen van een stam (bijvoorbeeld RW1596) het dragen van de transgen stEx30 (pmyo-3:: GFP:: Myo-3 + rol-6 (su1006))8, die etiketten myosin vezels met GFP.
Opmerking: de introductie van het transgen in dieren kan worden bereikt door een stam van belang te kruisen met dieren die het transgen al uitdrukken, of het DNA van micro injecteren in de distale arm van de Gonade. Het ' rollende ' fenotype geïnduceerd door rol-6 mutatie in dit transgen vergemakkelijkt de visualisatie van de spieren. De spieren van het lichaam van de muur lopen langs de rugzijde en de ventrale zijden die normaalgesproken niet van zicht zijn in wild-type dieren, omdat ze meestal op een van hun laterale zijden liggen. De rol-6 (su1006) allel induceert het draaien van de dieren, waardoor sommige spieren cellen voorbeeld vorming worden blootgesteld. - Afbeelding van de dieren met behulp van een fluorescentiemicroscoop in combinatie met een hoge resolutie opgeladen gekoppelde apparaat camera (CCD), 40X objectief of hoger, GFP filter en acquisitie software.
- Pas de belichtingstijd en verlichtings intensiteit aan om oververzadigde beelden te voorkomen.
- Vastleggen en opslaan van beelden van spieren (400x vergroting) van een deel van het dier met ten minste één volledig zichtbaar schuine spier cel. Vermijd regio's met een enkele spiercel die onvolledig is of secties die niet scherp zijn. Ook afbeeldingen uitsluiten van extreme anterieure en posterieure gebieden, en regio's grenzend aan de vulva.
Opmerking: als het dier geen enkele zichtbare volledige spiercel heeft, schuift u de dekglaasje zachtjes om het dier te draaien om een volledige cel bloot te leggen.
- Verkrijgen van een stam (bijvoorbeeld RW1596) het dragen van de transgen stEx30 (pmyo-3:: GFP:: Myo-3 + rol-6 (su1006))8, die etiketten myosin vezels met GFP.
- Meting van het spiercel gebied
- Open de afbeelding in Fiji software9 (versie 2.0.0 werd gebruikt in deze studie).
- Gebruik de veelhoek selectie om zorgvuldig rond een enkele schuine spiercel te traceren. Pas de lijn van de veelhoek aan het einde aan door de anker stip te verslepen om de tracering te verbeteren.
- Ga naar het tabblad analyseren boven aan de software en klik op meten om het gebied van de selectie te berekenen. Er wordt een afzonderlijke resultatentabel met het gebied en andere metingen weergegeven. Als de oppervlakte-meting ontbreekt in de resultatentabel, gaat u naar metingen instellen onder het tabblad analyseren en controleert u of het vak gebied is aangevinkt. Schakel ook andere metingen uit die niet nodig zijn.
- Voor spiercellen met een ontaarde/ontbrekende regio, Traceer de ontbrekende regio met de veelhoek selectiegereedschap en klik opnieuw meten . Als er meerdere hiaten in de cel zijn, traceert u elke tussenruimte afzonderlijk.
- Bereken de verhouding tussen het gap-gebied en de hele enkelvoudige spiercel. Een hoge ratio duidt op een hogere mate van spier degeneratie als gevolg van grote gaten in de cel. Als er geen ontbrekende gebieden, zoals vaak gezien in wild-type dieren, de verhouding zou worden berekend als nul.
Opmerking: als een controle, Score ook voor spierstructuur gebreken visueel en vergelijk resultaten met de kwantitatieve meting. Dit is vooral handig als de stam voor de eerste keer in het lab wordt bestudeerd. Voor fenotypische scores, de dieren als defect beoordelen of niet-defect op basis van de integriteit van de filamenten. Bijvoorbeeld, dieren met verlies van verschillende filament striations, GFP clumping, of gaten in spiercellen als gevolg van structurele afbraak, zou worden gescoord als defect.
- Segmentatie en kwantificering van myosin Fiber lengte
- Indien nodig, eerst bestanden converteren naar. TIF met behulp van Fiji of een ander softwarepakket. Sla de TIFF-bestanden op de gewenste locatie op.
- Open ilastik10 (gratis software, versie 1.3.2 kan worden gedownload van https://www.ilastik.org/).
- Kies eenmaal in ilastik pixel classificatie onder Nieuw project maken . De software zal vragen om het project te redden. Wijzig de naam van het project en sla het op een gewenste locatie op.
Opmerking: een nieuw project hoeft slechts eenmaal te worden gemaakt. Volgende segmentatie kan worden gedaan met behulp van hetzelfde project. Om dezelfde projectinstellingen te gebruiken, ga naar project tab bovenaan en klik op Open project om het projectbestand te openen. - Er moeten 5 tabbladen in het linkerdeelvenster zijn (invoergegevens, selectie van functies, training, voorspelling export en batch verwerking). Klik op het tabblad invoer gegevens op nieuwe toevoegen en voeg vervolgens afzonderlijke afbeeldingen toe. Direct het pop-upvenster naar de map met de TIFF-bestanden en selecteer de afbeelding te openen.
- Klik in het volgende tabblad (functie selectie) op functies selecteren om alle pixel functies te selecteren, aangegeven door groene aangevinkte vakjes. De pixel selectie in deze stap wordt gebruikt om de verschillende klassen van pixels in de volgende stap te onderscheiden.
Opmerking: de selectie van pixels functies is afhankelijk van de afbeeldingsresolutie. Vandaar dat de ontwikkel ontwikkelaars suggereren om alle of zoveel mogelijk functies te selecteren, als de verwerkingskracht en tijd vergunning. - Het volgende deelvenster training staat de classificatie van verschillende objectklassen toe op basis van pixels. In dit geval zijn de twee klassen de individuele GFP-uitdrukken myosin filamenten en ongewenste achtergrond of vervaagde randen. Klik op Label toevoegen om het eerste label te hebben. Een aantal filamenten om de klassificatiertraining te beginnen.
Opmerking: als u dubbelklikt op het label, u naamswijzigingen (bijvoorbeeld de naam van ' label 1 ' naar ' filament ') wijzigen. Als u dubbelklikt op het gekleurde vak, kunnen kleuren voor tekenen en waarschijnlijkheids displays worden gewijzigd. De standaardgrootte van het penseel is 1, hoewel de grootte kan worden verhoogd tot 61. Als de verkeerde pixel is getekend, gebruikt u gewoon het gereedschap Gummetje om de tekening te verwijderen. Toetsenbord besturingselementen (-) en (Shift +) kunnen worden gebruikt om respectievelijk in-en uitzoomen op afbeelding in te zoomen. Pijltjestoetsen worden gebruikt om door de afbeelding te navigeren. - Voeg een tweede label toe en wijzig de naam in achtergrond. Scrawl over ongewenste achtergronden en spaties tussen de filamenten.
- Klik op Live Update en zorg ervoor dat de classificatie is uitgevoerd door de software correct. Voeg meer bels toe en Verfijn de training indien nodig.
Opmerking: het is belangrijk om in deze stap een oogje te houden op samengevoegde vezels en wazige randen (zoals lichaams lijn). Verbeter de voorspelling hier zoveel mogelijk om de nauwkeurigheid van de metingen te verhogen. De nauwkeurigheid van de voorspelling is ook afhankelijk van de afbeeldingsresolutie, omdat pixels in afbeeldingen van lage kwaliteit moeilijker uit elkaar kunnen worden geplagen. Het is ook optioneel, maar aanbevolen om de filter methode uit te voeren in de functie functies voorstellen naast Live Update Control. - Zodra training classificatie is voldoende uitgevoerd, gaat u naar voor Spelling exporteren deelvenster. Klik op Kies afbeeldings instellingen exporteren met waarschijnlijkheden als de bron.
- Gebruik de volgende instellingen. Cut-out subregio x en y aangevinkt, en c unticked. De begin-en stop waarden voor c moeten respectievelijk 0 en 1 zijn. Tik en converteer gegevenstype in transformaties naar niet-ondertekende 8-bits, vink aan renormalize [min, Max] en gebruik de standaardwaarden. Wijzig de indeling van de video van het uitvoerbestand naar PNG en wijzig de naam van het bestand en de map naar wens.
- Sluit het venster Exportinstellingen en exporteer de specifieke afbeelding die zojuist is gesegmenteerd.
- Open de opgeslagen PNG-afbeelding in Fiji-software. De afbeelding moet in zwart-wit worden weergegeven.
- Pas de drempelwaarde van de afbeelding aan met de standaardinstellingen.
- Pas de skeletonisatie plugin toe (Skeletonize 2D/3D, en analyseer vervolgens het skelet). Er wordt een afzonderlijke tabel met resultaten weergegeven, inclusief de lengte van de vertakking. De lengte van de vertakking staat voor de vezellengte. Andere gegevens in de resultaten kunnen ook nuttig zijn, zoals de Euclidische afstand.
Opmerking: laat vezels met lengtes van 0 μm of meer dan 250 μm weg, omdat deze maten niet fysiologisch mogelijk zijn.
6. kwantificerende mitochondriale morfologie
Opmerking: voor de kwantificering van de mitochondriale morfologie gebruikte deze studie de BXN038 -stam met de uIs115 (pmec-17:: tagrfp)5 transgen om de PLM-neuronen en jsIs609 te visualiseren (pmec-4:: MLS:: GFP)11 om mitochondriën specifiek binnen de PLM-neuronen te visualiseren. Deze studie werd uitgevoerd in gesynchroniseerde 3-daagse oude volwassen wormen, maar is met succes uitgevoerd op andere leeftijden, evenals in andere weefsels7.
- Fluorescentie beeldvorming van mitochondriën binnen de PLM-neuronen
- Voor het meten van de grootte en vormveranderingen van de mitochondriën binnen de PLM-neuronen, visualiseer zowel de achtergrond neuron en mitochondriën met behulp van fluorescerende transgenes.
- Om de PLM-neuron te beeld, gebruik een confocale Microscoop gekoppeld aan een 488 nm en 552 nm optisch gepompt halfgeleider diode laser en uitgerust met beeld Capture software.
- Afbeelding van de worm volgens de stappen 4.1.1-4.1.4 hierboven, waardoor niet-verzagende blootstellings condities.
- Om het hele neuron te visualiseren, kan een tegelafbeelding nodig zijn. Om dit te bereiken, gebruikt u software met een tegel scan optie om een marker in een hoek van het neuron te lokaliseren en neer te zetten en vervolgens het tegenovergestelde uiteinde te vinden en de andere marker te laten vallen. De software berekent het optimale aantal tegels dat nodig is om het vereiste gebied vast te leggen.
Opmerking: om de scantijd te verminderen, is het vaak gemakkelijker om neuronen te lokaliseren die één enkel vlak volgen, wat resulteert in minder tegels. - Als u de tegel wilt koppelen met een Z-stack, stelt u de onderste en bovenste limieten in voordat u de tegel scan start en zorgt u ervoor dat de optimale segmentgrootte is ingesteld.
- Zorg ervoor dat de resolutie is geoptimaliseerd, als segmentatie zal worden verfijnder met hogere resoluties (hier, een resolutie van 3224 x 3224 pixels werd gebruikt).
Opmerking: terwijl het uIs115 (pmec-17:: tagrfp) transgen wordt gebruikt om de PLM te markeren en de camera met succes te positioneren, hoeft het niet noodzakelijkerwijs te worden afgebeeld als gevolg van een lichte achtergrond fluorescentie waargenomen bij de jsIs609 (pmec-4:: MLS:: GFP) transgen binnen de PLM axon zelf. Zo kan de scan-en beeldvormings tijd worden verminderd door het 552 nm-filter uit het experiment te verwijderen.
- Object segmentatie met SQUASSH
- Converteer afbeeldingsbestanden naar . TIFF -afbeeldingen en Genereer maximale intensiteits projecties van Z-stacks met behulp van Fiji imaging software. Afbeeldingen bijsnijden tot de minimale grootte, terwijl het nog steeds het volledige neuron bevat om de computationele belasting te verminderen en achtergrondruis te verminderen.
Opmerking: voor de representatieve resultaten, alleen mitochondriën binnen de lange axonale processen werden overwogen, zodat de cel lichaam en de mitochondriën binnen werden uitgesloten van elke afbeelding. - Gebruik de mozaïek Suite SQUASSH macro voor ImageJ, voer Split Bregman segmentatie12 uit op de maximale projecties. Een gedetailleerde handleiding voor de installatie en toepassing van deze macro is beschikbaar op de mozaïek website (http://mosaic.mpi-cbg.de/) en beschreven door Rizk et al. 201413. Het proces van beeldsegmentatie wordt hieronder kort beschreven.
Let op: deze segmentatie identificeert objecten (in dit geval individuele mitochondrion) over een drempel van fluorescentie intensiteit, waardoor nauwkeurige meting van elke afzonderlijke objecten grootte en vorm mogelijk is. - Achtergrondruis uit een afbeelding verwijderen met de methode Rolling Ball, waarin een door de gebruiker gedefinieerd venster over de afbeelding beweegt, waarbij de lokale achtergrond intensiteit wordt bepaald door de meest voorkomende intensiteit in elk venster. Dit corrigeert ongelijke achtergrond intensiteiten.
- Gebruik objectdetectie om ruwweg gebieden van de afbeelding te vinden die objecten (mitochondriën) bevatten die van belang zijn, gebaseerd op de intensiteit van de fluorescentie en het aantal pixels. De parameters die deze stap regelen zijn regularisatie en minimale object intensiteit.
Opmerking: regularisatie wordt gebruikt om te voorkomen dat kleine intensiteit, ruis veroorzaakte pieken worden gesegmenteerd en de minimale drempel voor object intensiteit helpt bij het definiëren van de subcellulaire organellen van achtergrond weefsel fluorescentie. Dit zijn de belangrijkste twee parameters die worden gemanipuleerd om een optimale segmentatie van mitochondriën vinden, en het optimalisatieproces neigt te zijn trial and error van verschillende parameters voor een testbeeld, gevolgd door handmatige inspectie. - Gebruik de software om de lokale achtergrond intensiteiten rond elk object te schatten om optimale segmentatie te helpen berekenen.
- Meet individuele objecten voor grootte, omtrek, lengte via pixel nummer, evenals signaalintensiteit en x/y locatie op de afbeelding. Voor het berekenen van metingen in grootte (nm), factor in de pixelgrootte van de oorspronkelijke afbeelding.
Opmerking: voor elk experiment moeten eerst optimale parameters worden berekend. Om de nauwkeurigheid van segmentatie te garanderen, is het raadzaam om een SQUASSH-analyse uit te voeren op een testafbeelding en handmatig de nauwkeurigheid van segmentatie te inspecteren. De macro biedt uitvoerbestanden met de afzonderlijke objecten die zijn geïdentificeerd op de oorspronkelijke afbeelding, en het inspecteren van deze nauwkeurig en het aanpassen van parameters aan te passen zal zorgen voor een nauwkeurige segmentatie. De gedefinieerde parameters moeten vervolgens worden gebruikt voor het gehele experiment voor vergelijkbaarheid. De parameters die worden gebruikt voor de representatieve resultaten zijn opgenomen in tabel 2. - Open Fiji-of ImageJ-analyse software, navigeer naar de mozaïek-macro container en open het SQUASSH-menu.
- Open het submenu achtergrond aftrekken en zorg ervoor dat achtergrond verwijderen ? is aangevinkt. De standaardinstelling voor venstergrootte is 10.
- Stel de gewenste regularisatie en minimale intensiteit van het object in, kanaal 1 waarden om objecten het beste te identificeren en te segmenteren (zie stap 6.2.4). Kanaal 2 -waarden zijn niet nodig voor objecten die zijn gemarkeerd met een enkel transgene.
- Klik op de schatting PSF van objectieve eigenschappen om de puntspreidingsfunctie te schatten op basis van de kenmerken van de Microscoop. Dit helpt de segmentatie van nauw gelegen objecten door de administratieve verwerking van de invloed van elke pixel op de naburige pixel.
Opmerking: subpixel segmentatie is niet gebruikt in dit experiment vanwege de toegenomen belasting van de computer verwerkingskracht. Celmaskers werden ook niet gebruikt omdat de axon gemakkelijk gedefinieerd is. Deze instellingen zijn nuttig voor complexere weefsels en voor het definiëren van objecten in een cel op basis van cel. - Voor Visualisatieopties zorgt u ervoor dat object contouren worden gecontroleerd en object-en afbeeldingskenmerken worden opgeslagen . Voor gebruik later in grafische en statistische software, zorg ervoor dat het juiste aantal voorwaarden zijn input.
- Zoek de map met . TIFF -afbeeldingen en voer de macro uit. Dit proces kan worden uitgevoerd op een afzonderlijke installatiekopie of op een batch afbeeldingen per genotype in een map. Uitvoerbestanden bevinden zich in de map samen met de originele afbeeldingen.
- Converteer afbeeldingsbestanden naar . TIFF -afbeeldingen en Genereer maximale intensiteits projecties van Z-stacks met behulp van Fiji imaging software. Afbeeldingen bijsnijden tot de minimale grootte, terwijl het nog steeds het volledige neuron bevat om de computationele belasting te verminderen en achtergrondruis te verminderen.
- Analyse en afmetingen van de vorm
- Gebruik de uitvoer van SQUASSH om een gespecificeerd object data . CSV -bestand te bieden, dat elk afzonderlijk object per rij bevat, inclusief de metingen zoals hierboven beschreven.
Opmerking: Hoewel dit macro procesobject metingen automatiseert, is het altijd belangrijk om de uitvoer afbeeldingen handmatig te controleren na SQUASSH segmentatie om ervoor te zorgen dat de macro de mitochondriën correct heeft geïdentificeerd. - Om de vorm van elke mitochondriën te analyseren, gebruikt u een tweedimensionale maat voor sphericity, Circulariteit, om de afwijking van het object van een perfecte cirkel te schatten.
Opmerking: Circulariteit is een functie van gebied en omtrek (Circulariteit = (4 x π) x (gebied/omtrek2) waarbij 1 = een perfecte cirkel en 0 = een rechte lijn. Dit kan worden bereikt met behulp van een formule in grafische en statistische software. - Om te bepalen van de variantie in grootte en vorm over de pool van de mitochondriën, bereken histogrammen en een ingerichte Gaussiaanse distributie met behulp van grafische en statistische software, met bakken van 0,2 μm voor mitochondriale grootte en 0,05 voor mitochondriale circulariteit.
- Gebruik de uitvoer van SQUASSH om een gespecificeerd object data . CSV -bestand te bieden, dat elk afzonderlijk object per rij bevat, inclusief de metingen zoals hierboven beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. elegans is een ideaal modelorganisme voor het bestuderen van morfologie van verschillende weefsels en organellen vanwege zijn eenvoud, bekende celafstamming, transparantie en beschikbare gereedschappen. Hier bieden we kwantitatieve benaderingen voor het bestuderen van organellen (bijv. mitochondriën) en weefsels, waaronder synapsen en spieren met behulp van Live fluorescentie Imaging en gratis bio-beeld Verwerkingssoftware.
Strikte regulering van MEC-17 expressie is vereist voor normale Synapse ontwikkeling
Om verder te begrijpen van de functie van de alpha-tubuline acetyl-transferase MEC-1714, 15, 16 in het zenuwstelsel, we bestudeerden synaptische morfologie in de Touch receptor neuronen in C. elegans overexpressie van het eiwit17. Deze cellulaire structuren zijn essentieel voor neuron functie als ze toestaan dat signalen worden doorgegeven aan naburige neuronen. Beelden van de PLM Synapse werden verzameld met behulp van een laser scanning confocale Microscoop en kwantitatieve morfologie analyse werd uitgevoerd met behulp van toegankelijke bio-image processing software (Figuur 1a, B). De overexpressie van MEC-17 resulteert in significante reducties op het gebied van vooraf synaptische ophopingen in de PLM en verminderde relatieve geïntegreerde fluorescentie intensiteiten van de SNB-1:: GFP marker (figuur 1C, D). Samen, deze resultaten suggereren dat overexpressie van MEC-17 verstoort normale Synapse ontwikkeling in de PLM Touch receptor neuronen.
De grootte van de presynaptische site en de relatieve geïntegreerde fluorescentie werden bestudeerd met behulp van de gratis biobeeldverwerkings software CellProfiler 3.1.5. Vanwege hun complexe structuur werden synapsen met de hand gedefinieerd met behulp van het diffuse tagRFP-eiwit, uitgedrukt in het uIs115 (Pmec-17:: tagrfp) transgene. Het gebied van de gedefinieerde SYNAPS is berekend op basis van het aantal pixels binnen het gedefinieerde gebied. Vergeleken met de wild-type controle hebben dieren die MEC-17 overdrukken, de vooraf synaptische gebieden significant verlaagd (P = 0,0025; n ≥ 10) (Figuur 1C). Bovendien werden de relatieve geïntegreerde fluorescentie intensiteitsniveaus vergeleken om de synaptische integriteit te bestuderen. Dit werd berekend door de geïntegreerde fluorescentie intensiteitsniveaus binnen de gedefinieerde Synapse te meten voor zowel SNB-1:: GFP als de diffundeerbaar tagrfp. Vervolgens werden de SNB-1:: GFP-fluorescentie waarden ten opzichte van tagRFP-waarden vergeleken waarvoor een significante afname (P = 0,0479; n ≥ 10) werd waargenomen met de overexpressie van MEC-17 (figuur 1d). Samen, deze resultaten suggereren dat de juiste regulering van MEC-17 is belangrijk voor de ontwikkeling van Synapse.
Kwantitatieve meting van de Body Wall muscle Cell Area en Fiber length onthult significante gebreken als gevolg van mutaties in CMT2-gerelateerde genen
Er is aangetoond dat mutatie in de genen MFN2, DNM2 en KIF5A Charcot-Marie-Tooth type 2 (CMT2) veroorzaakt, een axonale vorm van de meest voorkomende erfelijke perifere neuropathie18, 19. CMT2 wordt vaak geassocieerd met langzaam progressieve distale spierzwakte en atrofie, distale zintuiglijke stoornis, voet misvormingen en secundaire steppage Gait. Als gevolg hiervan lijden patiënten vaak aan invaliderende mobiliteitsbeperkingen voor levenslang. Er is momenteel geen remedie voor de ziekte, deels als gevolg van genetische en klinische heterogeniteit geassocieerd met CMT219, evenals een gebrek aan diermodellen om pathofysiologie van de ziekte te bestuderen. Vandaar, met behulp van dierlijke modellen om te begrijpen van de onderliggende cellulaire gebreken kunnen antwoorden geven op de onbekende CMT2 ziekte mechanismen.
Tot nu toe, gepubliceerde studies evalueren Body Wall spier defecten in C. elegans hebben vertrouwd op visuele scoren in plaats van kwantitatieve metingen20. Om subjectieve bias te vermijden die tijdens de kwalitatieve beoordeling kunnen voorkomen, werden kwantitatieve metingen van de spier massa van het lichaam en myosine vezellengte getrialed met behulp van de beschikbare beeldverwerkings Programma's. We gebruikten deze methoden om de spier morfologie te beoordelen bij dieren die mutaties in de FZO-1/MFN2, dyn-1/DNM2 en UNC-116/KIF5A -genen in 3-daagse oude volwassen C. elegansdragen. Voor beide metingen werden een aantal voorwaarden toegepast, zodanig dat ten minste één volledige schuine spiercel binnen het zicht lag, spiercellen die vaag waren of buiten de focus waren uitgesloten, en extreme anterieure en posterieure regio's, evenals gebieden grenzend aan de vulva werden weggelaten. Naast de mutaties in de CMT2-geassocieerde genen droegen de dieren ook de stEx30 (pmyo-3:: GFP:: Myo-3 + rol-6 (su1006)) transgen dat een C. elegans myosin Heavy Chain subeenheid met GFP (Fig. 2a-E) etisiekent. De eenvoudige veelhoek tool in Fiji software9 (versie 2.0.0) werd gebruikt om het gebied van een enkele spier cel meten. Als een dier ervaren Body Wall spierstructuur afbraak, achter lege ruimten binnen spiercellen, de verhouding van Gap gebied tot totale één spier cel gebied werd berekend en vergeleken met wild-type controle (Figuur 3a). Om metingen van myosin vezellengte te verkrijgen, werd elk beeld eerst gesegmenteerd met behulp van ilastik software10 (versie 1.3.0) (Figuur 3b). Segmentatie is een proces dat het mogelijk maakt de individuele spiervezels worden geclassificeerd en gescheiden van ongewenste secties zoals de achtergrond. Na de segmentatie werd de afbeelding geëxporteerd als een niet-toegewezen 8-bits binaire afbeelding. Fiji (versie 2.0.0) werd vervolgens gebruikt om de binaire afbeelding te skelteren om randpixels te filteren, achter fragmenten die de oorspronkelijke vezels vertegenwoordigen. De tak lengtes van de skeletten, of individuele myosin filamenten, werden vervolgens geanalyseerd in Fiji. Lengtemetingen van 0 of meer dan 250 μm, wat de maximale redelijke lengte is voor een filament, zelfs bij het strekken van spieren, werden uitgesloten. Totaal, tussen 2000 aan 3000 myosin vezellengtes werden gemeten. Een samenvatting van de segmenterings werkstroom wordt weergegeven in Figuur 3b. De resultaten van de kwantitatieve analyse werden verder vergeleken met het visueel scoren van spier defecten in het lichaam, waarbij 3-daagse oude dieren werden gecategoriseerd als defect of niet-defect op basis van de integriteit van de spierstructuur.
Defecten in de lichaams wand spier morfologie werden waargenomen tussen 2,5 tot 3,5 maal hoger in FZO-1 (cjn020), dyn-1 (ky51) en UNC-116 (e2310) dieren dan bij wild-type dieren tijdens visuele beoordeling (figuur 4a). De meeste dieren met mutaties in FZO-1 en UNC-116 ervaren opvallend verlies van spier STRIATIONS, grote GFP klontering als gevolg van accumulatie van cellulair puin, en spiervezels degeneratie die verlaten gapende ruimte binnen spiercellen ( Figuur 2C, E). Terwijl meer dan 60% van de dyn-1 mutanten visueel defect werd gescoord, was de omvang van de gebreken minimaal ten opzichte van de andere twee genetische mutanten. Er was slechts licht verlies van striations, geen GFP-aggregaties en slechts geringe spier degeneratie in vergelijking met de andere twee mutanten (figuur 2D en figuur 4a). Net als bij andere fenotypische scores, kon de omvang van de gebreken niet in aanmerking worden genomen, en een neiging tot bias kan leiden tot een groter deel van de gebreken die kunnen worden geregistreerd. Daarom zouden kwantitatieve metingen van het spier celgebied en de vezellengte een nauwkeurigere representatie van de omvang van spier defecten bieden dan alleen visuele beoordeling. In lijn met de grote gaten waargenomen met visuele scores, bleek de verhouding tussen het gap-gebied en het totale eencellige gebied 5 tot 6 maal hoger in FZO-1 en UNC-116 Mutant dieren in vergelijking met de wild type groep, die alleen verwaarloosbaar verdeling van de spierstructuur (figuur 4b). Het ontbreken van structurele instorting in dyn-1 mutanten resulteerde in een niet-significante, 3-voudige toename van de verhouding tussen de cellen en het spier gebied (figuur 4b). Dit geeft ook aan dat de vooroordelen van onderzoekers een factor kunnen zijn die bijdraagt aan het hoge percentage van de door de kwalitatieve beoordeling toegewezen gebreken. Niettemin daalden de kleine openingen de gemiddelde vezellengte van 24 μm in wild-type tot 22 μm in dyn-1 mutanten (figuur 4c). De gemiddelde vezellengte was dramatisch korter in de FZO-1 en UNC-116 mutanten, correleren met de aanwezigheid van grotere gaten binnen degenererende spiercellen bij deze dieren (figuur 2C,E en figuur 4c ). Deze resultaten zijn consistent met onze recente bevindingen over het bestuderen van de effecten van mutating CMT2-asscoiated genen in C. elegans20. Bovendien benadrukken ze de nauwkeuriger beoordeling van de spier morfologie met behulp van deze kwantitatieve methoden in vergelijking met visuele scoring alleen, en leveren ze bewijs dat FZO-1 en UNC-116 nodig zijn voor normale spier morfologie.
Kwantitatieve metingen van de mitochondriale morfologie met behulp van SQUASSH object segmentatie
Om te begrijpen hoe de afwezigheid van mitochondriale splijting beïnvloedt mitochondriale morfologie in C. elegans neuronen, we uitgevoerd kwantitatieve analyses in de PLM mechanosensorische neuronen. DRP-1, de C. elegans ortholoog van het zoogdier dynamine-gerelateerde proteïne 1 (DRP1), regelt de mitochondriale splijting, waar bij activering wordt gerekruteerd uit de cytosol om een spiraal rond mitochondriën te vormen, vernauwing en uiteindelijk verbreken beide de binnenste en buitenste mitochondriale membranen21, 22. We fluorescently gelabeld mitochondriën met een weefsel specifieke transgen in de PLM-neuronen, die hebben een lange axonale proces dat gemakkelijk kan worden gevisualiseerd met behulp van epifluorescentie microscopie. Een verlies van splijting is veronderstelde om de algehele mitochondriale dynamiek verstoren, en daarom het verminderen van de creatie van nieuwere, kleinere mitochondriën door een proces dat bekend staat als ontluikende23.
We voerden SQUASSH segmentatie om mitochondriale morfologie in wild-type en DRP-1 Mutant dieren te vergelijken. We analyseerden de mitochondriën van 6 PLM-neuronen per genotype, resulterend in een n -waarde van groter die 200 mitochondriën voor elk. Schematische en representatieve afbeeldingen worden weergegeven in figuur 5a, B. We vonden dat mutanten ontbreekt DRP-1 had grotere en meer langwerpige mitochondriën (Figuur 5b-F). Mitochondriën in de DRP-1 Mutant achtergrond waren 32% groter dan wild-type (p = 0,0006, figuur 5c), en 14% meer langwerpig (verder van een perfecte cirkel) (p < 0,0001, figuur 5d). Voor een gedetailleerdere beoordeling van de variantie in grootte en vorm, hebben we histogrammen voor elke maateenheid getekend, waarbij de gegevens aan Gaussiaanse distributies worden gepast (figuur 5e, F). We ontdekten dat mutanten die geen splijtings eiwit hadden, voor zowel grootte als circulariteit een grotere variantie hadden (p < 0,0001 voor beide), gemarkeerd door de aanwezigheid van grotere en meer langwerpige mitochondriën/mitochondriale netwerken (Zie figuur 5Bii voor voorbeelden ). Over het algemeen, we vonden bewijs om te suggereren dat mutatie van DRP-1 veroorzaakt een gebrek aan splijting binnen de PLM-neuronen, resulterend in grotere en meer langwerpige mitochondriën. We hebben ook aangetoond dat verstoring van mitochondriale splijting een toename van de variantie van mitochondriale morfologie veroorzaakt.
Figuur 1: kwantificering van de synaps-integriteit in de PLM-neuronen. A) beelden zijn maximale z-projecties van de PLM synaptische regio in een niet-transgene dier. Het linker paneel toont de PLM-neuron gelabeld met tagRFP, het tweede paneel toont de vooraf synaptic regio gelabeld met SNB-1:: GFP, de derde afbeelding is een overlay met co-lokalisatie vertegenwoordigd in geel, en het vierde paneel is een schematische weergave van de overlay-afbeelding. B) maximale confocale beelden van z-projectie van de synaptische regio bij dieren die MEC-17 overdrukken. Afbeeldingen worden weergegeven als per paneel A. (C) kwantificering van de grootte van het vooraf synaptische gebied in niet-transgene vergelijking met transgene dieren die MEC-17 overdrukken. D) kwantificering van de relatieve geïntegreerde fluorescentie niveaus van SNB-1:: GFP in niet-transgenics versus transgene dieren die MEC-17 overdrukken. Voor (C) en (D) worden afzonderlijke synapsen die worden geanalyseerd, vertegenwoordigd door cirkels; n ≥ 10; gemiddelde ± i/a weergegeven in zwart. P -waarden * < 0,05, * * < 0,01 uit ongepaarde t-tests; schaal staven vertegenwoordigen 2 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: visualisatie van de C. elegans lichaam muur spieren. A) een dier dat de stEx30 uitdrukt (pmyo-3:: GFP:: Myo-3 + rol-6 (su1006)) transgene, dat de myosin Heavy Chain Etiquette met GFP in de spieren van het lichaam muur. De array induceert ook een rollend fenotype in het dier dat de visualisatie van de spiercellen die langs de rugzijde en de ventrale zijden van het lichaam zijn gerangschikt vergemakkelijkt. Representatieve vergrote standpunten van myosine vezels in (B) wild-type, (C) FZO-1 (cjn020), (D) dyn-1 (ky51) en (E) UNC-116 (e2310) dieren. Alle dieren werden gefotografeerd in de 3-daagse oude volwassen fase. Schaalbalk vertegenwoordigt 60 μm in (A) en 30 μm in (B-E). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: meten van de Body Wall spier gebied en vezellengte met behulp van beschikbare computationele algoritmen. (A) voorbeeldafbeelding die aantoont hoe de interne kloof ruimte binnen een enkele spiercel (rood ingesloten) en het gebied van de hele cel (geel ingesloten) worden getekend en berekend in Fiji om de spier gebied ratio te verkrijgen. (B) overzicht van het segmentatie protocol op een enkel voorbeeld beeld met behulp van een combinatie van Fiji en ilastik. Schaalbalk vertegenwoordigt 30 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: kwalificatie en kwantificering van spier defecten in de lichaams wand. A) visuele beoordeling van spier defecten in de lichaams wand. B) vergelijking van het blanco ruimtegebied tot de totale spier-celoppervlak verhouding tussen WT en aangegeven mutanten. C) meting van de lengte van de myosine vezels. Voor (B) en (C) werden alleen beelden met ten minste één complete zichtbare schuine spiercel opgenomen voor analyse. Vezels met een lengte van 0 μm of langer dan 250 μm werden ook uitgesloten. Staven vertegenwoordigen het percentage van de defecte dieren in punt A en de gemiddelde ± S.E.M. in punt B en C; n waarden die in elke staaf worden weergegeven. Chi-Square test met vals detectiepercentage werd uitgevoerd om visuele defecten in (A) te vergelijken, terwijl in one-way ANOVA met de post hoc tests van Dunnett voor meervoudige vergelijking werd gebruikt om kwantitatieve metingen in (B) en (C) te analyseren. *P < 0,05, * * * *p < 0,0001, NS = niet significant. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: mitochondriale morfologie binnen de axonen van de PLM-neuronen. A) schematische weergave van het mechanosensorische neuron van een posterieure laterale microtubulus (PLM) in de staart van C. elegans. Het rode vak geeft de geschatte locatie van de gemarkeerde secties in (B), die representatieve beelden van GFP gelabelde mitochondriën (pmec-4:: MLS:: GFP) in de PLM axon tonen. Helder groen puncta geven mitochondriën. In vergelijking met de WT (i), DRP-1 (tm1108) mutanten (II) vertonen grotere, meer langwerpige mitochondriën. Afbeeldingen zijn representatief voor n = 6 PLM axonen van 6 wormen per genotype; schaal staven = 15 μm. C) gemiddelde grootte (μm2) van individuele mitochondrion zoals GEKWANTIFICEERD door squassh object segmentatie in 3-daagse oude volwassen (3doa) wormen. D) gemiddelde circulariteit van individuele mitochondrion binnen de PLM axon, zoals gekwantificeerd uit SQUASSH object metingen in 3DOAs. (E) histogram en Gaussiaanse verdeling waaruit de variantie van de mitochondriale grootte blijkt. F-test (P < 0,0001) toont aan dat varianties significant verschillen tussen DRP-1 en WT. (f) histogram en Gaussiaanse verdeling waaruit de variantie van mitochondriale circulariteit blijkt. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde +/-SEM. * * * p < 0,001, * * * * p < 0,0001 van de t-toets van Welch; n ≥ 204 mitochondriën voor kwantitatieve analyse van n = 6 wormen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Stamnaam | Genotype | Bron | Verwijzing # | ||
| BXN038 | uIs115 (Pmec-17:: tagRFP); jsIs609 (Pmec-4:: MLS:: GFP) | Neumann Lab | 7 | ||
| BXN366 | FZO-1 (cjn020); Myo-3 (st386); zdIs5 (Pmec-4:: GFP); stEx30 (Pmyo-3:: GFP:: Myo-3 + rol-6 (su1006)) | Neumann Lab | 20 | ||
| BXN419 | DRP-1 (tm1108); jsIs609 (Pmec-4:: MLS:: GFP); uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) | Neumann Lab | 7 | ||
| BXN507 | cjnEx036 (Pmec-4:: MEC-17, Pmyo-2:: mCherry); jsIs37 (Pmec-7:: SNB-1:: GFP); Lin-15B & Lin-15A (n765); uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) | Neumann Lab | 17 | ||
| BXN675 | UNC-116 (e2310); Myo-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: GFP:: Myo-3 + rol-6 (su1006)) | Neumann Lab | 20 | ||
| BXN685 | dyn-1 (ky51); Myo-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: GFP:: Myo-3 + rol-6 (su1006)) | Neumann Lab | 20 | ||
| NM664 | jsIs37 (Pmec-7:: SNB-1:: GFP); Lin-15B & Lin-15A (n765) | Caenorhabditis Genetica Center | 6 | ||
| RW1596 | Myo-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: GFP:: Myo-3 + rol-6 (su1006)) | Caenorhabditis Genetica Center | 8 | ||
| TU4065 | uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) | Martin Chalfie | 5 | ||
Tabel 1. Lijst van stammen van C. elegans die in deze studie worden gebruikt.
| PLM axon afbeeldingen | |
| Doelstelling | 40x |
| Afbeeldingsresolutie (per paneel voor tilescan) | 3224 x 3224 |
| Achtergrond verwijderen venstergrootte | 20 |
| PSF XY | 0,78 |
| PSF z | 0,68 |
| Regularisatie | 0,15 |
| Minimale fluorescentie intensiteit van GFP | 0,4 |
Tabel 2. SQUASSH parameters voor segmentatie van mitochondriën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Morfologische variaties zijn vaak beoordeeld via manuele telling van merkbare verschillen of met behulp van arbitraire drempels om defecten te bepalen in vergelijking met een wild type fenotype. Meer recentelijk zijn echter kwantitatieve methoden gebruikt voor vergelijkende studies van morfologie om op onpartijdige wijze veranderingen op cellulair en subcellulair niveau nauwkeurig te meten en te beschrijven. De mogelijkheid om subtiele maar biologisch relevante verschillen tussen fenotypes te identificeren is een krachtig middel om de onderliggende moleculaire mechanismen te begrijpen die veranderingen in de morfologie van omgevingsfactoren of genetische ziekten beheersen. De aanhoudende toename in rekenkracht en microscopie beeldresolutie, in combinatie met het gemak van groei en de veelzijdigheid van C. elegans genetica heeft het perfecte platform voor de combinatie van geavanceerde en toch gratis imaging software met fijne gedetailleerde confocale beelden. Hier, we hebben aangetoond methoden om te evalueren en kwantificeren synaptische grootte en eiwit lokalisatie, lichaam muur spier gebied en vezellengte, en mitochondriale morfologie in een reeks van genetische achtergronden.
Hoewel deze analyses blijk hebben gegeven van een vermogen om subtiele morfologische verschillen te kwantificeren, zijn er beperkingen. Hoewel elk van deze analyses gebruik maakt van open-source en gemakkelijk beschikbare software, vertrouwen ze op hoge kwaliteit, scherpe beelden om nauwkeurig de cellulaire structuren en subcellulaire organellen op te lossen. Dit kan vaak een beperkende stap zijn, omdat gevoelige high-end apparatuur, zoals confocale microscopen met geavanceerde detectoren, nodig zijn om beelden met bevredigende resolutie vast te leggen. Deze zijn niet altijd toegankelijk voor laboratoria, en analyse met sub-par technologie kan leiden tot onnauwkeurige en onherhaalbare resultaten. Bovendien, terwijl elke techniek is gericht op het verminderen van de vooroordelen van de experimenteerder met behulp van computeralgoritmen, er zijn nog steeds stappen die een element van menselijke fouten kan inhouden. De handmatige definitie van de Synaps met de hand, de omtrek van de spier cel gebied, de parameter optimalisaties van mitochondriale segmentatie door oog zijn alle gebieden die in dit opzicht kunnen worden verbeterd. Om de kans op menselijke fouten te verkleinen, kunnen studies worden uitgevoerd in een geblindeerde mode of alternatief beeldanalyse software kan worden gebruikt om de regio van belang zelf te definiëren. Het gebruik van celmaskers, waarbij het gewenste analysegebied wordt gedefinieerd door de fluorescentie op een andere golflengte, kan dit helpen. Dit wordt gebruikt om de analyse te beperken tot een gedeelte van een afbeelding die fluorescentie boven een ingestelde drempel weergeeft, zoals de Nucleus van een cel of een getransfunteerde cel13,24. Bovendien beperkt het gebruik van enkelvoudige tijdpunt afbeeldingen de vragen die deze technieken kunnen aanpakken. De processen die de organel morfologie beheersen, Synapse vorming en spierstructuur zijn hoogstwaarschijnlijk dynamisch, en verschillen kunnen worden gezien binnen dezelfde cel afhankelijk van de ontwikkelings-of biologische status. Analyse van deze structuren op een specifiek eindpunt kan daarom worden beperkt en time-lapse beeldvorming zou gunstig zijn voor het bewaken van structurele veranderingen in de tijd. Tot slot, hoewel morfologische veranderingen een goede indicator kunnen zijn van verstoring in cellulaire processen, is correlatie niet altijd impliciet. Bijvoorbeeld, recente bevindingen in verschillende soorten hebben aangetoond dat de mitochondriale functie en vorm inderdaad kunnen worden losgekoppeld van7,25. Daarom moet er rekening worden gehouden met aanvullende assays bij het afleiden van functionele veranderingen als gevolg van morfologische verschillen.
Wij hebben het gebruik van deze kwantitatieve technieken kunnen aantonen in een bepaalde reeks weefsels en genetische achtergronden; het gebruik ervan kan echter breder worden toegepast. Fluorescentie kwantificering via imaging software kan worden gebruikt om een reeks verschillende subcellulaire organellen zoals kernen en endosomes, of verschillende structuren zoals neuronen en epitheelcellen te analyseren, allemaal binnen de context van verschillende mutanten of ziekten Achtergronden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.
Acknowledgments
Wij danken leden van het Neumann Lab voor waardevolle discussies en inbreng. Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure programma's (P40 OD010440). De auteurs danken worm Base voor zijn rijkdom aan informatie over C. elegans, en erkennen Monash micro imaging, Monash University, voor de levering van instrumentatie, opleiding en technische ondersteuning. Dit werk werd gesteund door de CMTAA Research Grants (2015 en 2018), en NHMRC project Grants 1101974 en 1099690 toegekend aan B.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
References
- Brenner, S.
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
- Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
- Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
- Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
- Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
- Akella, J. S., et al.
- Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
- Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
- Teoh, J. -S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
- Bird, T. D. Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , GeneReviews [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2019. [Updated 2016 Apr 14] Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1285/ (1998).
- Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
- Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
- Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
- Zhu, P. -P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
- Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
- Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
- Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).
