Summary
Bu çalışmada, sinaptik boyut ve lokalizasyon, kas Morfoloji ve marochondrial şekil nicel ölçümler serbestçe kullanılabilir görüntü işleme araçları kullanarak C. elegans özetliyor. Bu yaklaşım, C. elegans 'da gelecekteki çalışmaların, genetik mutasyonların bir sonucu olarak doku ve organel yapısal değişikliklerin kapsamını nicel olarak karşılaştırmasına olanak sağlar.
Abstract
Hastalığın altta yatan hücresel mekanizmaların tanımlanması, yeni teraplerin geliştirilmesi için önemlidir. Bu mekanizmaları çözmek için sık kullanılan bir strateji, aday genlerde mutasyonları tanıtmak ve dokuların ve hücresel organizlerin morfolojisindeki değişiklikleri niteliksel olarak tarif etmektir. Ancak, nitel açıklamaları ince fenosimik farklar yakalamayabilir, bir nüfusun bireyler arasında fenotipi varyasyonları yanlış gösterebilir, ve sıklıkla subjektif olarak değerlendirilir. Burada, nicel yaklaşımlar nematod Caenorhabditis elegans içinde dokuların ve organelilerin morfolojisi, ticari olarak mevcut biyo-görüntü işleme yazılımı ile birlikte lazer tarama konfetit mikroskopisi kullanarak incelemek için açıklanmıştır. Sinaps bütünlüğünü (boyut ve entegre floresan seviyeleri) etkileyen fenotiplerin nicel analizi, kas gelişimi (kas hücresi boyutu ve miyosin filament uzunluğu), ve mitokondriyal morfoloji (devre ve boyutu) anlamak için yapıldı Bu hücresel yapılarda genetik mutasyonların etkileri. Bu niceliksel yaklaşımlar, burada açıklanan uygulamalarla sınırlı değildir, çünkü Nematot 'taki diğer dokuların ve organelların morfolojisini ve diğer model organizmalardaki gibi kolayca nicel olarak değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
Nematod Caenorhabditis elegans (C. elegans) , insan hastalığında yer alan biyolojik ve moleküler süreçleri ortaya çıkarmak için giderek bir model sistemi olarak kullanılmaktadır. Bir yetişkin nematod sadece 1 mm üzerinde bir vücut uzunluğu vardır ve 300 yumurta1kadar büyük bir damızlık üretebilir. Hatching sonra, C. elegans sadece yetişkin ulaşmak için 3-4 gün gerektirir ve yaklaşık 2 ila 3 hafta2için yaşamak. Kültür kolaylığı nedeniyle, C. elegans Şu anda insan hastalıkları için terapötik tanımlamak için maliyet-etkili, hızlı ilaç taraması yapmak için en çok aranan in vivo hayvan modellerinin biridir. Ayrıca, genetik koruma, iyi tanımlanmış davranışsal paradigmalar, floresan veya ışık mikroskobu için şeffaf vücut, ve genetik manipülasyon kolaylığı genetik mutasyonların hücresel ve moleküler sonuçlarının çalışma kolayca ulaşılabilir hale 3. C. elegans genom hisselerin yaklaşık% 60-80 insan genleri ile ortoloji ve bu genlerin yaklaşık% 40 ' i hastalık ile ilgili olduğu bilinmektedir. C. elegans modellenmiş ve okudu bazı insan hastalıkları nörodejeneratif bozukluklar (Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, amilotrofik lateral skleroz, Charcot-Marie-Tooth hastalığı), kas ilişkili hastalıklar ( Duchenne kas Distrofi) ve metabolik hastalıklar (hiperglisemi)2,4. Çoğu insan bozukluklarında, hastalığın kaynaklı hücresel ve organel lokalizasyonu ve morfolojik değişiklikler ortaya çıkar ve bu da Nematot modelinde kolayca değerlendirilebilecek.
Floresan işaretçileri mikroskopla dinamik görselleştirme için dokulara ve organelleri etiketlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, C. elegans, genetik mutasyonlar nedeniyle morfolojik düzensizlikleri değerlendirmek konvansiyonel yöntemler büyük ölçüde görsel açıklamaları üzerinde dayanmış. Nitel değerlendirmeler fenokolojik açıklamaların daha geniş aralıklarını (sinaptik morfoloji, Gfp kümelenme, spesifik akal şekli, kas lif kalınlığı, vb.) kapsayacak ve morfolojik değişikliklerin bir kuş bakışı görünümü sağlamak, onlar için daha az uygundur farklı gruplar arasında küçük varyasyonları karşılaştırarak. Ayrıca, niteliksel değerlendirmeler, morfolojik anomalilerin üzerinde veya daha fazla tahminine yol açabilecek görsel, subjektif değerlendirmeye dayanır. Son olarak, nitel gözlemler de bireyler arasında büyük farklılık gösterebilir, veri çoğaltma ile zorluklar yaratmak.
Son yıllarda, görüntüleri nicel olarak analiz edebilir Kullanıcı dostu, kolayca kullanılabilir Hesaplamalı algoritmalar bir dizi geliştirilmiştir. Ancak, bazı morfolojik çalışmalar için bu tür görüntü analiz yazılımının kullanımı, özellikle vücut duvar kasları ve mitokondri ile ilgili olarak, C. elegans araştırma arkasında gecikmiştir. C. eleganstemel yapısal analiz geliştirmek için, bazı hazır, açık kaynak görüntü analiz yazılımı niceliksel kas mitokondri üzerinde genetik mutasyonların etkilerini karşılaştırmak için trialed edildi, vücut duvar kas ve sinaptik Morfolojisi. Bu deneysel prosedürler ayrıntılı olarak nasıl bu programların (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) sinaptik boyutu ve sinaptik protein lokalizasyonu, vücut duvar kas alanı ve lif uzunluğu ve mitokondriyal boyutu değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir anahat ve Nematot genetik mutasyonlar sonucu olarak döngü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. büyüme ve bakım C. elegans suşları
- Tohum Nematode büyüme orta (NGM, bkz. malzeme tablosu) bir laminar akış kabininde yavaş büyüyen E. COLI gerinim OP50 μL 300 ile agar plakaları.
- NGM agar plakalarını laminar akış kabininde kurumaya bırakın.
Not: laminar akış kabininin yokluğunda, plakalar bankta kurumaya bırakılabilirler, ancak kontaminasyona daha eğilimli olurlar. - İki OP50-seeded NGM agar plakaları her biri için en az 20 hayvan transfer çalışma stokları var. Hayvanları aktarmanın iki ana yolu vardır.
- Çekme: sıcaktan sterilize edilmiş bir pick kullanarak hayvanları yavaşça kaldırın. Bu yöntem bir agar plaka bireysel veya birden fazla hayvan seçmek için etkilidir. Küçük bir bakteri kazımına sahip olduğunda, çekme transferi yardımcı olur.
Not: bir seçim bir cam pipet gömülür yaklaşık 4 cm uzunluğunda platin tel küçük bir parça yapılır, tel ucu ' mızrak benzeri ' olarak düzleştirilmiş ile. Çapraz kontaminasyonu önlemek için çekme arasındaki Pick ısı sterilize. - Chunking: sterilize spatula kullanarak, bir plaka hayvanları içeren agar küçük bir kare kesti ve yeni bir plaka için ters transfer.
Notlar: Bu yöntem genellikle solucanlar çok sayıda aktarmak için yararlıdır ve olmayan kontamine agar parçalama birden fazla tur ile plakalardan kontaminasyonu kaldırmak için. Birkaç saniye spatula yanan ve transferler arasında 100% etanol içinde spatula daldırarak çapraz kontaminasyonu kaçının. Açlık ve aşırı kalabalık, hücresel ve hücre içi yapıların sağlığını ve morfolojisini etkileyebilir.
- Çekme: sıcaktan sterilize edilmiş bir pick kullanarak hayvanları yavaşça kaldırın. Bu yöntem bir agar plaka bireysel veya birden fazla hayvan seçmek için etkilidir. Küçük bir bakteri kazımına sahip olduğunda, çekme transferi yardımcı olur.
- Solucanları standart büyüme sıcaklığında koruyun (20 °C). İyi beslenen solucanlar sürekli tedarik sağlamak için, yeni OP50-seeded plakaları her 2 ila 3 gün solucanlar aktarın.
2. yaş-senkronizasyon C. elegans
- Nüfus kalabalık ama açlıktan değil kadar 3-4 NGM plakaları üzerinde solucanlar koruyun.
- M9 çözeltisi ile NGM plakasının solucanlarını nazikçe yıkayın. Onlar E. COLI OP50sopa beri yumurta plaka üzerinde kalacaktır. Tüm yumurtadan hayvanları kaldırmak için dört ek yıkama adımlarını tekrarlayın.
- Solucanlar 40 dk için yumurtadan izin verin.
- 1-2 mL M9 çözeltisi plakaya ekleyin ve son zamanlarda yumurtadan solucanları gevşetmek için hafifçe kıvrın.
- Son zamanlarda doğmuş solucanlarla M9 çözümünü toplayın ve çözümü solucanlar ile taze bir NGM plakasına aktarın.
- NGM plakasını havaya çıkararak M9 çözeltinin Buharlık yapmasına izin verin. NGM plakasının kontaminasyonunu önlemek için bunu açık bir alev ile bitişik yapın.
- Üçüncü larva (L3) aşamasında gelişimine izin vermek için 20 °c ' de 27 saat boyunca solucanları büyütün. Senkronize 3 günlük Yetişkin hayvanlar için, solucanlar larva Aşama 4 ' de seçilmiş ve 3 gün eski yetişkin aşamasına ulaşmak için daha 3 gün yetişir.
3. görüntüleme için slaytların hazırlanması
- Bir mikrodalga-güvenli şişe içinde% 3-4 w/v agaroz stok hazırlayın (3-4 g 100 ml Ultra saf su).
Not: agar, agaroz yerine aynı konsantrasyonda kullanılabilir. - Tüm agaroz çözülür (NET çözüm) kadar, üzerinde kaynatma değil bakım alarak, bir mikrodalga fırında dikkatle agaroz eritin. Katılaşma önlemek için 70 °C ' de çözüm tutun.
Not: Agarose stok birkaç kez kullanılabilir. Agaroz katılaştırılmış ise kullanmadan önce yeniden ısıtın. - Bir Pasteur pipet kullanarak, bir damla erimiş agaroz bir mikroskop slayt üzerine yerleştirin.
Not: Bu yastık bütünlüğünü bozar gibi agar damlası içinde hava kabarcıkları sahip kaçının. - Agaroz damlacılığı hemen başka bir mikroskop kaydırağı ile aşağı bastırın ve agaroz 'i iki slayt arasındaki bir yastık içine hafifçe düzleştirin.
Not: herhangi bir kalan kabarcıklar bu aşamada kaldırılmalıdır. Değilse, hayvanlar kolayca kabarcıklar sıkışmış alabilirsiniz yeni slaytlar yapılmalıdır. Slayda basıldığında yan agar taşması kaçının. - Agaroz 'i 1 dakika boyunca kurumaya bırakın.
- Agarose hasar görmesini önlemek için iki slayt dikkatle ayırın, slaytlardan birinde katılaştırılmış Pad bırakarak.
Not: agaroz pedleri olan slaytlar, her zaman deneyden hemen önce kuru olarak hazırlanmalıdır. Agaroz yastığı tutarlı bir kalınlığa sahip olduğundan emin olun. Bu görüntüleme etkileyebilir gibi yastık hiçbir hava kabarcıkları veya çatlaklar olmalıdır. - Agaroz yastık merkezine% 0,05 tetramisol hidroklorür (anestezik) küçük bir damla (5-10 μL) ekleyin.
- Isı Sterilized almak kullanarak, hızlı bir şekilde 10 – 15 hayvan stok plakadan anestezik damlacık için çözüm kurmadan önce transfer. Bu görüntü ile müdahale edebilir çözüm bulutlu yapar gibi çok fazla OP50 bakteri aktarımı kaçının.
Not: Eğer anestezik çözelti toplama sırasında kurur, sadece hayvan üzerine% 0,05 tetramisole hidroklorür ikinci bir damla pipet. Hayvanlar anestezik çözelti içinde lateral tarafında yatıyordu eğilimindedir. - Agaroz yastığı hemen üstünde konumlandırarak ve yavaşça aşağı bırakarak bir lamel magazini uygulayın. Bu kabarcıkların oluşumunu önleyecek. Bu hayvanları ezebilir gibi lamel magazini için basınç uygulamaz.
- Slaytları gerinim adıyla etiketleyin.
4. sinaptik morfoloji değerlendirilmesi
Not: arka lateral microtubül (PLM) dokunmatik reseptör nöronlar içinde sinaps bütünlüğü üzerinde MEC-17 ekspresyonu etkileri, sinaptik boyutu ve lokalizasyonu hat tarama konfoksal mikroskobik kullanılarak ölçülmesi ile incelendi. PLM nöronlar (sinaptik bölgeler dahil) UIs115 kullanılarak görselleştirildi ( pmec-17:: tagRFP) transgene (GERINIM: TU40655) ve sinaptik bölge özellikle JsIs37 Ile etiketlenmiş (pmec-7:: SNB-1:: Gfp) (gerinim: NM664 6) . Bu çalışma extrakromozomal MEC-17 ekspresyonu strain BXN507 [cjnEx036 (pmec-4:: MEC-17, pmyo-2:: MCherry); jsIs37; uIs115]7' nin senkronize L3 olmayan transjenik ve transjenik hayvanlarında yapılmıştır. Bu çalışmada kullanılan suşların tam listesi Tablo 1' de yer almaktadır.
- Dokunmatik reseptör nöron sinaps Konfokal görüntüleme
- Sinaptik bölgeler görüntü için, bir hat kullanarak bir 488 nm ve 552 nm optik pompalanmış yarı iletken Diode lazer ve görüntü yakalama yazılımı ile donatılmış bir konfoksal mikroskop tarama kullanın.
- En düşük büyütme kullanarak solucanlar bulun.
- Hayvanların başarılı bir şekilde bulunduğu zaman, 40X büyütmeye geçin ve daldırma ortamını uygulayın (Bu çalışmada: 40X/1.10 HC PL APO CS2 çok sürükleyici bir amaç ile su daldırma kullanılmıştır).
- TagRFP fluorophore için GFP fluorophore ve 552 Nm (% 1 güç) için 488 nm lazer (% 2 güç) ile heyecan verici fluorophores tarafından sinaptik bölgeyi görselleştirin.
- Tüm sinaptik bölgeyi yakalamak için optimum x ve y çerçevesini belirleyin. Çerçeveyi seçerken en uygun piksel boyutunu göz önünde bulundurtığınızdan emin olun. Bu çalışmada 56 nm 'lik tutarlı bir piksel boyutu elde edilmiştir.
- Hibrid fotoğraf dedektörü kullanarak görüntüleri yakalamak ve fluorophores aşırı maruz kalmasını önlemek için kazançlar ayarlamak (488 nm uyarma için% 100 ve 552 nm uyarılma için% 15).
- Kullanılan belirli bir hedefe bağlı olarak optimum z-Step boyutunu kullanarak tüm SYNAPSE kapsayacak şekilde z-yığını görüntüleri toplayın. Bu çalışmada 0,211 nm 'lik optimum z-Step boyutu kullanılmıştır.
Not: tüm görüntülerin entegre floresan ölçümlerine ve karşılaştırmasına izin vermek için sıkı durumda alındığından emin olun. Bu, microskopi parametrelerini tüm yakalanan görüntüler (örn. lazer ve dedektör ayarları, piksel boyutu, tarama hızı ve optimum z-Step boyutu) boyunca özdeş tutarak yapılabilir. Optimum ayarlar amaca bağlıdır ve Nyquist hesap makinesi (https://svi.nl/NyquistCalculator) gibi erişilebilir Biyoinformatik programlar kullanılarak hesaplanabilir. Etiket görüntüleri sistematik olarak, bu yararlı olacaktır düzenlemek ve dosya adını temel alarak işlemek Biyoinformatik yazılım kullanırken.
-
Sinaptik bölgenin ölçülmesini
- Sinaptik bölgeyi analiz etmek için görüntüleri TIFF dosyaları olarak dışa aktarın. Imagej gibi Java tabanlı görüntüleme işleme yazılımı kullanılabilir (Bu çalışmada, ımagej 'deki MRG görüntü dönüştürme makrosunu kullanıldı).
- Sinslerin boyutu ve entegre floresan yoğunluğu düzeyleri, CellProfiler-3.1.5 ile elde edilen z-yığınlarının toplam yoğunluğundan ölçülmüştür. Görüntüleri CellProfiler 3.1.5 yazılımına yükleyin. Gerekirse, resimler görüntü dosyası adlarına göre filtrelenebilir.
- Ad ve tür modülünü ayarlayın. İsteğe bağlı olarak, hesaplanan verileri uygun şekilde düzenlemek için meta verileri görüntü etiketinden ayıklayın.
- UIs115 (pmec-17:: tagrfp) transgene 'den ifade edilen diffik tagrfp kullanarak bu bölgenin elle tanımı ile sinaptik bölgesini belirleyin. Bu ilgili modül CellProfiler-3.1.5 ardışık düzen ekleyerek yapılabilir.
- Elle tanımlanan SYNAPSE boyutunu ve fluoresans ölçmek için, Ölçü nesnesi boyutu ve Şekil ve Ölçü nesne yoğunluğu modülü ardışık düzen ekleyin.
- Matematiksel Hesaplama modülünü ekleyerek göreli entegre floresan yoğunluğunu hesaplayın. JsIs37 'den elde edilen entegre yoğunluklu üniteleri (Pmec-7:: SNB-1:: GFP) uIs115 için elde edilen entegre üniteler ile bölün (pmec-17:: tagrfp).
- Ölçümleri ve hesaplamaları dışa aktarın.
5. vücut duvar kas yapısını ölçmek
- Vücut duvar kas yapısının floresans görüntüleme
- Miyozin liflerini Gfp ile etiketlemek için transgene stEx30 (pmyo-3:: Gfp:: MYO-3 + rol-6 (su1006))8' i taşıyan bir gerinim (örneğin, RW1596) alın.
Not: transgeni hayvanların içine giriş, zaten transgeni ifade eden hayvanlarla veya gonad 'ın distal koluna mikroenjeksiyon DNA 'sına geçerek elde edilebilir. Bu transgeni rol-6 mutasyonu tarafından indüklenen ' Rolling ' fenotipi kasların görselleştirilmesini kolaylaştırır. Vücut duvar kasları genellikle onların lateral kenarlarından birinde yalan çünkü normalde vahşi tip hayvanların görünümünden önleyen dorsal ve ventral taraf boyunca çalıştırın. Rol-6 (su1006) allel hayvanların büküm indükler, böylece görüntüleme için bazı kaslar hücreleri açığa. - Görüntü hayvanların yüksek çözünürlüklü bir bağlantılı cihaz kamera (CCD), 40X objektif veya daha yüksek, GFP filtre ve edinme yazılımı ile birlikte bir floresan mikroskop kullanarak.
- Aşırı doymuş görüntüleri önlemek için pozlama süresini ve aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın.
- Yakalamak ve en az bir tam görünür oblik kas hücresi içeren hayvanın bir bölümünden kas (400X büyütme) görüntüleri kaydedin. Eksik veya odağı olmayan bölümler tek bir kas hücresi ile bölgelerden kaçının. Ayrıca aşırı anterior ve posterior bölgelerin görüntüleri hariç, ve vulva bitişik bölgeler.
Not: hayvan tek bir görünür tam kas hücresi yoksa, yavaşça tam bir hücreyi açığa çıkarmak gibi hayvan açmak için lamel magazini kaydırın.
- Miyozin liflerini Gfp ile etiketlemek için transgene stEx30 (pmyo-3:: Gfp:: MYO-3 + rol-6 (su1006))8' i taşıyan bir gerinim (örneğin, RW1596) alın.
- Kas hücre alanının ölçümü
- Fiji yazılım9 (sürüm 2.0.0 Bu çalışmada kullanılan) görüntü açın.
- Dikkatle tek bir oblik kas hücresi etrafında izlemek için Çokgen seçimi kullanın. İzleme geliştirmek için çapa nokta sürükleyerek sonunda Çokgen satırını ayarlayın.
- Yazılımın üst kısmındaki analiz sekmesine gidin ve seçimin alanını hesaplamak için Ölçü 'i tıklayın. Alanı ve diğer ölçümleri içeren ayrı bir sonuç tablosu gösterilecektir. Sonuçlar tablosundan alan ölçümü eksikse, analiz sekmesinin altında ölçümler Ayarla 'ya gidin ve alan kutusunun işaretlenip işaretli olmadığını kontrol edin. Benzer şekilde, gerekli olmayan diğer ölçümleri işaretini kaldırın.
- Dejenere/eksik bölgeye sahip kas hücreleri için, eksik bölgeyi çokgen seçim aracıyla izleyin ve Ölçü yeniden tıklayın. Hücre içinde birden çok boşluk varsa, her boşluğu ayrı olarak izleyin.
- Gap alanının tüm tek kas hücresine oranını hesaplayın. Yüksek oran hücre içinde büyük boşluklar nedeniyle kas dejenerasyonu daha yüksek bir ölçüde gösterir. Eğer eksik bölgeler yoksa, yaygın olarak vahşi tip hayvanlarda görüldüğü gibi, oran sıfır olarak hesaplanır.
Not: bir kontrol olarak, kas yapısı kusurları için de görsel olarak puan ve nicel ölçümü ile sonuçları karşılaştırın. Bu özellikle, gerinim laboratuvarda ilk kez çalışılırsa yararlıdır. Fenotipik Puanlama için, filamat bütünlüğünü dayalı kusurlu ya da değil-kusurlu olarak hayvanları değerlendirmek. Örneğin, farklı filament çizgi kaybı olan hayvanlar, GFP küme, ya da yapısal arıza nedeniyle kas hücreleri içinde boşluklar, arızalı olarak puan olacaktır.
- Miyozin fiber uzunluğunun segmentasyon ve ölçülemesi
- Gerekirse, önce dosyaları dönüştürün. TIF Fiji veya başka bir yazılım paketi kullanarak. TIFF dosyalarını istediğiniz konuma kaydedin.
- Açık ilastik10 (ücretsiz yazılım, sürüm 1.3.2 https://www.ilastik.org/indirilebilir).
- Bir kez ilastik, seçin piksel sınıflandırması altında Yeni Proje Oluştur . Yazılım, projenin kaydedilmesini isteyecektir. Projeyi yeniden adlandırın ve istediğiniz konuma kaydedin.
Not: yeni bir proje yalnızca bir kez oluşturulması gerekir. Sonraki segmentasyon aynı projeyi kullanarak yapılabilir. Aynı proje ayarlarını kullanmak için en üstteki Proje sekmesine gidin ve proje dosyasına erişmek için Açık Proje 'yi tıklatın. - Sol panelde 5 sekme olmalıdır (giriş verisi, özellik seçimi, eğitim, tahmin verme ve toplu Işleme). Giriş verisi sekmesinde, Yeni Ekle 'yi tıklatın ve sonra ayrı resim (ler) ekleyin . Açılır pencereyi TIFF dosyalarını içeren klasöre yönlendirin ve açılacak görüntüyü seçin.
- Aşağıdaki sekmede (özellik seçimi), yeşil işaretlenmiş kutularla gösterilen tüm piksel özelliklerini seçmek için Özellikler 'i tıklatın. Bu adımda piksel seçimi, sonraki adımda farklı piksel sınıflarını ayırt etmek için kullanılır.
Not: piksel Özellik seçimi görüntü çözünürlüğüne bağlıdır. Bu nedenle, geliştiriciler tüm veya mümkün olduğunca çok sayıda özellik seçmek için öneririz, Eğer işlem gücü ve zaman izni. - Aşağıdaki eğitim paneli piksellere göre farklı nesne sınıfların sınıflandırılmasına izin verir. Bu durumda, iki sınıf bireysel GFP-ifade miyosin filamin ve istenmeyen arka plan veya bulanık kenarlar vardır. İlk etikete sahip olmak için etiket Ekle 'ye tıklayın. Sınıflandırıcısı eğitim başlamak için filamat bir dizi üzerinde scrawl.
Not: etiketi çift tıklatarak ad değişikliği (örneğin, ' Etiket 1 ' ' filament ') yeniden adlandırılmasına izin verir. Renkli kutuyu çift tıklatarak çizim ve olasılık ekranların değiştirilmesi için renkler sağlar. Boyut 61 için yükseltilebilir, ancak boya fırçası varsayılan boyutu 1 ' dir. Yanlış piksel çizilmiş, sadece çizim kaldırmak için Silgi aracını kullanın. Klavye kontrolleri (-) ve (Shift +) görüntüyü yakınlaştırmak ve uzaklaştırmak için sırasıyla kullanılabilir. Ok tuşları görüntünün etrafında gezinmek için kullanılır. - İkinci bir etiket ekleyin ve arka planayeniden adlandırın. İstenmeyen arka planlar ve filamat arasındaki boşluklar üzerinde scrawl.
- Canlı güncellemeye tıklayın ve sınıflandırmanın yazılım tarafından doğru şekilde yapıldığını emin olun. Gerekirse daha fazla scrawls ve ince ayar eğitim ekleyin.
Not: Bu adımda birleştirilmiş lifler ve bulanık kenarlar (gövde çizgisi gibi) için bir göz tutmak önemlidir. Ölçümlerin doğruluğunu artırmak için mümkün olduğunca burada tahmin geliştirin. Düşük kalitede görüntülerin pikselleri ayrı kızdırmak daha zordur olarak tahmin doğruluğu da görüntü çözünürlüğüne bağlıdır. Aynı zamanda isteğe bağlıdır, ancak canlı güncelleme denetiminin yanında önerilen Özellikler işlevinde filtre yöntemini çalıştırması önerilir. - Eğitim Sınıflandırıcısı yeterli gerçekleştirildikten sonra tahmin verme paneline gidin. Kaynak olarak olasılıklar ile görüntü ayarlarını Dışa Aktar 'ı seçin .
- Aşağıdaki ayarları kullanın. Cut-out alt bölgesi x ve y işaretli ve c işaretlenmemeli. Başlangıç ve durdurma değerleri c 0 ve 1, sırasıyla olmalıdır. Tick ve dönüştürme veri türü imzasız 8-bit, Tick renormalize [min, Max] ve varsayılan değerleri kullanın. Çıkış dosyası video formatını PNG olarak değiştirin ve dosyayı ve dizini istediğiniz gibi yeniden adlandırın.
- Dışa aktarma ayarları penceresini kapatın ve yalnızca bölümlenmiş olan belirli bir görüntüyü dışa aktarın.
- Kaydedilmiş PNG görüntüsünü Fiji yazılımında açın. Görüntü siyah ve beyaz olarak görünmelidir.
- Varsayılan ayarları kullanarak görüntünün eşiğini ayarlayın.
- Çerçeve yapısı çıkarma eklentisi uygulayın (skeletonize 2D/3D, ve sonra iskelet analiz). Dal uzunluğunu içeren ayrı bir sonuç tablosu görüntülenecektir. Dal uzunluğu fiber uzunluğunu temsil eder. Sonuçlarındaki diğer veriler de Euclidean mesafesi gibi yararlı olabilir.
Not: Bu boyutlarda fizyolojik olarak mümkün olmadığı için 0 μm veya 250 μm ' den fazla uzunlukları olan lifleri atlayın.
6. mitokondriyal morfolojisi ölçmek
Not: mitokondriyal morfolojinin ölçülmesine yönelik olarak, bu çalışmada uIs115 (pmec-17:: tagRFP)5 transgeni içeren BXN0387 gerinim PLM nöronları ve JsIs609 görselleştirmek için kullanılmıştır (PMEC-4:: MLS:: Gfp)11 Özellikle PLM nöronlar içinde mitokondri görselleştirmek için. Bu çalışma senkronize 3 gün eski yetişkin solucanlar yapılmıştır, ancak başarıyla diğer yaşlarda, yanı sıra diğer dokularda gerçekleştirildi7.
- PLM nöronlar içinde mitokondri floresans görüntüleme
- PLM nöronlar içinde mitokondri boyutunu ve şekil değişikliklerini ölçmek için, floresan transgenes kullanarak arka plan nöron ve mitokondri hem görselleştirin.
- PLM nöron görüntü için, 488 nm ve 552 nm optik pompalanmış yarı iletken Diode lazer ve görüntü yakalama yazılımı ile donatılmış bir Konfokal mikroskop kullanın.
- Görüntü Worm adımları başına 4.1.1-4.1.4 yukarıda, olmayan doygunlaştırıcı pozlama koşulları sağlanması.
- Tüm nöron görselleştirmek için, karo bir görüntü gerekebilir. Bunu elde etmek için, bir kutucuk tarama seçeneği ile yazılım kullanarak nöronun bir köşesinde bir marker bulun ve bırakın ve ardından ters ucunu bulun ve diğer işaretleyiciyi bırakın. Yazılım gerekli alanı yakalamak için gerekli fayans optimum sayısını hesaplayacak.
Not: tarama süresini azaltmak Için, genellikle tek bir düzlem takip nöronların bulmak daha kolay, daha az fayans sonuçlanan. - Bir Z yığınıyla döşeme taramasını çift için, döşeme taramasını başlatmadan önce alt ve üst sınırları ayarlayın ve en iyi dilim boyutunun ayarlandığından emin olun.
- Segmentasyon daha yüksek çözünürlüklerde (burada, 3224 x 3224 piksel çözünürlük kullanıldı) daha rafine olacak şekilde çözünürlüğü, optimize edilir emin olun.
Not: uIs115 (pmec-17:: tagRFP) transgene, PLM 'i işaretlemek ve kamerayı başarıyla konumlandırmak için kullanıldığında, JsIs609 (pmec-4:: MLS:: Gfp) tarafından gözlenen hafif arka plan floresans nedeniyle görüntülenmesine gerek yoktur. PLM Axon içinde transgeni. Bu nedenle, tarama ve görüntüleme süresi 552 nm filtresini deneyden kaldırarak azaltılabilir.
- SQUASSH kullanarak nesne segmentasyon
- Görüntü dosyalarını . tiff görüntülerine dönüştürün ve Fiji görüntüleme yazılımını kullanarak Z yığınlarından maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturun. Hala Hesaplamalı yükü azaltmak ve arka plan gürültüsünü azaltmak için tam nöron içeren iken minimum boyuta kırpma görüntüleri.
Not: temsili sonuçlar Için, uzun akal süreçler içinde sadece mitokondri kabul edildi, bu nedenle hücre gövdesi ve içinde herhangi bir mitokondri her görüntü dışlandı. - Imagej için Mosaic Suite squassh makrosunu kullanarak, maksimum projeksiyonlara bölünmüş Bregman segmentasyon12 gerçekleştirin. Bu makroda kurulum ve uygulama için ayrıntılı bir kılavuz Mozaik web sitesinde (http://mosaic.mpi-cbg.de/) ve Rizk ve ark. 201413tarafından tarif edilebilir. Görüntü segmentasyon süreci kısa aşağıda açıklanmıştır.
Not: Bu segmentasyon nesneleri tanımlar (Bu durumda bireysel mitokondrion) Floresan yoğunluğu bir eşik üzerinden, her bir nesne boyutu ve şekli doğru ölçmek için izin. - Kullanıcı tanımlı pencerenin görüntü üzerinde hareket ettiği Rolling Ball yöntemini kullanarak bir görüntüden arka plan gürültüsünü kaldırın, her penceredeki en sık görülen yoğunluğun yerel arka plan yoğunluğu tahminini Tanrı. Bu, düzensiz arka plan yoğunlukları düzeltir.
- Floresan şiddetine ve piksel sayısına bağlı olarak, ilgi, nesnelerin (mitokondri) içeren bölgeleri kabaca bulmak için nesne algılaması kullanın. Bu adımı yöneten parametreler regularization ve minimum nesne yoğunluğuyla aynıdır.
Not: düzensizliği küçük yoğunluğu, gürültü kaynaklı zirveleri segmentleme önlemek için kullanılır ve minimum nesne yoğunluğu eşik arka plan doku floresans gelen hücre altı organelleri tanımlamak için yardımcı olur. Bu mitokondri optimum segmentasyon bulmak için manipüle edilen ana iki parametre, ve optimizasyon süreci test görüntü için farklı parametrelerin deneme ve hata olma eğilimindedir, manuel muayene izledi. - En iyi segmentasyon hesaplaması yardımcı olmak için her nesne çevresindeki yerel arka plan yoğunlukları tahmin etmek için yazılımı kullanın.
- Boyut, çevre, piksel numarası ile uzunluk, hem de görüntü üzerinde sinyal yoğunluğu ve x/y konumu için bireysel nesneleri ölçün. Boyuttaki ölçümleri (Nm) hesaplamak için, orijinal görüntünün piksel boyutunda faktör.
Not: her deneme Için, en iyi parametrelerin ilk hesaplanması gerekir. Segmentasyon doğruluğunu sağlamak için, bir test görüntüsünde bir SQUASSH analizi gerçekleştirmek ve segmentasyon doğruluğunu el ile incelemek için tavsiye edilir. Makro, özgün görüntüde tanımlanan bireysel nesneleri gösteren çıktı dosyaları sağlar ve bu yakından incelemek ve uygun parametreleri ayarlamak doğru bir segmentasyon sağlayacaktır. Tanımlı parametreler daha sonra tüm deneme için karşılaştırılabilir kullanılmalıdır. Temsili sonuçlar için kullanılan parametreler Tablo 2' de yer alır. - Fiji veya ımagej analiz yazılımını açın, Mosaic makro kapsayıcısına gidin ve SQUASSH menüsünü açın.
- Arka plan çıkarma alt menüsünü açın ve arka plan kaldırma emin olun? işaretli. Pencere boyutu için varsayılan değer 10 ' dır.
- Nesneleri en iyi tanımlamak ve segmentlere ayırmak için istenen regularization ve Minimum nesne yoğunluğunu, Kanal 1 değerlerini ayarlayın (bkz. Adım 6.2.4). Kanal 2 değerleri tek bir transgene ile işaretlenmiş nesneler için gerekli değildir.
- Mikroskop özelliklerine göre nokta yayılma fonksiyonunu tahmin etmek için objektif özelliklerinden tahmin PSF 'yi tıklayın. Bu, komşu pikseldeki her pikselin etkisi için muhasebe tarafından yakından bulunan nesnelerin segmentasyonunu sağlar.
Not: alt piksel segmentasyon , bu denemede bilgisayar işleme gücünün artan yükü nedeniyle kullanılmadı. Akon kolayca tanımlandığından hücre maskeleri de kullanılmaz. Bu ayarlar daha karmaşık dokular için yararlıdır ve hücreler hücre temelinde nesneleri tanımlamak için. - Görselleştirme seçenekleri için nesne anahatlarını emin olun ve nesne ve görüntü özelliklerini kaydet denetlenir. Grafik ve istatistiksel yazılım daha sonra kullanmak için, koşulların doğru sayıda giriş olduğundan emin olun.
- . Tiff görüntüleri ile klasörü bulun ve makroyu çalıştırın. Bu işlem, tek bir görüntüde veya bir klasör içinde bulunan genotip başına bir resim toplu işlemi üzerinde gerçekleştirilebilir. Çıktı dosyaları orijinal görüntülerle birlikte klasörde yer alacak.
- Görüntü dosyalarını . tiff görüntülerine dönüştürün ve Fiji görüntüleme yazılımını kullanarak Z yığınlarından maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturun. Hala Hesaplamalı yükü azaltmak ve arka plan gürültüsünü azaltmak için tam nöron içeren iken minimum boyuta kırpma görüntüleri.
- Şekil Analizi ve ölçümleri
- Yukarıda açıklandığı gibi ölçümleri de dahil olmak üzere satır başına her bir nesne sağlayan bir dökümü nesne Data . csv dosyası sağlamak için squassh çıktısını kullanın.
Not: Bu makro işlemi nesne ölçümleri otomatikleştirir, ancak makro doğru mitokondri tanımlandığından emin olmak için SQUASSH segmentasyon sonra çıktı görüntüleri el ile denetlemek için her zaman önemlidir. - Her mitokondri şeklini analiz etmek için, objenin mükemmel bir çemberden sapmasını tahmin etmek için iki boyutlu bir ölçü kullanın.
Not: döngü alanı ve çevre (circularity = (4 x π) x (alan/çevre2) bir işlevdir nerede 1 = mükemmel bir daire ve 0 = düz bir çizgi. Bu grafik ve istatistiksel yazılım bir formül kullanılarak elde edilebilir. - Mitokondri havuzu boyunca boyut ve şeklin farkını belirlemek için, grafik ve istatistiksel yazılımları kullanarak histogramları ve donatılmış bir Gauss dağıtımını hesaplayın, mitokondriyal boyut için 0,2 μm ve mitokondriyal döngü için 0,05.
- Yukarıda açıklandığı gibi ölçümleri de dahil olmak üzere satır başına her bir nesne sağlayan bir dökümü nesne Data . csv dosyası sağlamak için squassh çıktısını kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. elegans basitliği, bilinen hücre sırtı, şeffaflık ve mevcut araçlar nedeniyle farklı dokuların ve organellerin morfolojisi okumak için ideal bir model organizmadır. Burada, canlı floresan görüntüleme ve ücretsiz biyo-görüntü işleme yazılımı kullanarak sinaps ve kaslar dahil olmak üzere organeliler (örneğin mitokondri) ve dokularda eğitim için nicel yaklaşımlar sağlıyoruz.
Normal sinaps gelişimi için MEC-17 ifadesinin sıkı düzenlenmesi gereklidir
Daha fazla Alfa-tubulin Asetil-Transferaz MEC fonksiyonunu anlamak için-1714, 15, 16 sinir sisteminde, biz C. elegans dokunmatik reseptör nöronlar içinde sinaptik morfoloji okudu protein aşırı ifade17. Bu hücresel yapılar, sinyallerin komşu nöronlara geçmesine izin verdikleri için nöron function için esastır. PLM sinaps görüntüleri lazer tarama Konfokal mikroskop kullanılarak toplandı ve nicel morfoloji Analizi erişilebilir biyo-görüntü işleme yazılımı kullanılarak yapılmıştır (Şekil 1a, B). MEC-17 ' nin aşırı ifadesi, PLM 'de ön sinaptik birikimler alanında önemli oranda azalma ve SNB-1:: GFP Marker (Şekil 1C, D)göreceli entegre floresan yoğunlukları azalır. Bu sonuçlar birlikte, MEC-17 ' nin aşırı ifadesinin PLM dokunmatik reseptör nöronlarındaki normal sinaps gelişimini bozmasını önerir.
Presynaptik site ve bağıl entegre floresan büyüklüğü ücretsiz biyo-görüntü işleme yazılımı CellProfiler 3.1.5 kullanılarak incelenmiştir. Karmaşık yapısı nedeniyle, sinaps uIs115 (Pmec-17:: tagrfp) transgene 'den ifade edilen Diffün tagrfp proteini kullanarak el ile tanımlandı. Tanımlanan sinaps alanı, tanımlanan bölge içindeki piksel sayısına göre hesaplanmıştır. Vahşi tip kontrol ile karşılaştırıldığında, MEC-17 ' d e k i hayvanlar ön sinaptik bölgeleri önemli ölçüde azaltmıştır (P = 0,0025; n ≥ 10) (Şekil 1C). Buna ek olarak, sinaptik bütünlüğü incelemek için, göreli entegre floresan yoğunluğu seviyeleri karşılaştırıldı. Bu, hem SNB-1:: Gfp hem de diffusible tagrfp için tanımlanan sinaps içerisindeki entegre floresan yoğunluğu düzeylerini ölçerek hesaplanır. Daha sonra, tagrfp değerlerine göre SNB-1:: Gfp floresans değerleri, MEC-17 ' n i n ekspresyonu (Şekil 1D) ile önemli bir düşüşün (P = 0,0479; n≥ 10) gözlemlenmesiyle karşılaştırıldı. Bu sonuçlar birlikte, MEC-17 ' i doğru düzenlemenin sinaps gelişimi için önemli olduğunu düşündürmektedir.
Vücut duvarı kas hücresi alanı ve lif uzunluğunun nicel ölçümü, CMT2 ile ilgili genlerde mutasyonlar sonucunda önemli kusurları ortaya çıkarır
Genlerde mutasyon MFN2, DNM2 ve KIF5A Charcot neden gösterilmiştir-Marie-Tooth tip 2 (CMT2), en yaygın kalıtsal periferik nöropati aksonal formu18, 19. CMT2 genellikle yavaş Progressive distal kas zayıflık ve atrofi ile ilişkilidir, distal duyusal bozukluk, ayak deformiteleri ve ikincil stepaj yürüyüş. Sonuç olarak, hastalar genellikle ömür boyu hareketlilik bozuklukları zayıflatıcı muzdarip. Şu anda hastalık için hiçbir çare yoktur, kısmen CMT2 ile ilişkili genetik ve klinik heterojenlik nedeniyle19, hastalık Patofizyoloji çalışmak için hayvan modelleri eksikliği yanı sıra. Bu nedenle, temel hücresel kusurları anlamak için hayvan modelleri kullanarak bilinmeyen CMT2 hastalık mekanizmaları yanıtlar sağlayabilir.
Şimdiye kadar, C. elegans vücut duvar kas kusurları değerlendirmek yayınlanan çalışmalar nicel ölçümler yerine görsel Puanlama güvendi20. Niteliksel değerlendirme sırasında oluşabilecek subjektif önyargı önlemek için, vücut duvar kas alanı ve miyosin lif uzunluğu nicel ölçümleri mevcut görüntü işleme programları kullanılarak trialed edildi. Bu yöntemleri, 3 günlük yaşlı yetişkin C. elegans'da FZO-1/MFN2, dyn-1/DNM2 ve UNC-116/KIF5A genlerinde mutasyonlar taşıyan hayvanların kas morfolojisini değerlendirmek için kullandık. Her iki ölçüm için de, bir dizi koşul uygulandı, böylece en az tek bir tam oblik kas hücresi görünümdedir, bulanık veya odak dışında olan kas hücreleri dışlandı ve aşırı anterior ve posterior bölgeler, yanı sıra bölgeler bitişik Vulva ihmal edildi. CMT2 ilişkili genlerdeki mutasyonlar yanı sıra, hayvanlar da stEx30 (pmyo-3:: Gfp:: MYO-3 + rol-6 (su1006)) transgene bir C. elegans miyozin ağır zincir altbirim GFP (Şekil 2a-E) ile Etiketler. Fiji yazılım basit Çokgen aracı9 (sürüm 2.0.0) tek bir kas hücresi alanını ölçmek için kullanıldı. Eğer bir hayvan vücut duvar kas yapısı arıza deneyimli, kas hücreleri içinde boş alanlar geride bırakarak, Toplam tek kas hücresi alanına boşluk oranı hesaplanmıştı ve Wild-tip kontrolü ile karşılaştırıldığında (Şekil 3A). Miyozin fiber uzunluğunun ölçümlerini elde etmek için, her görüntü ilk olarak ilastik yazılım10 (sürüm 1.3.0) (Şekil 3B) kullanılarak bölümlere ayrılır. Segmentasyon bireysel kas liflerinin sınıflandırılması ve arka plan gibi istenmeyen bölümlerden ayrılmış olmasını sağlayan bir süreçtir. Segmentasyon aşağıdaki görüntü atanmamış bir 8-bit ikili görüntü olarak verildi. Fiji (sürüm 2.0.0) sonraki Iskeletonize ikili görüntü kenarlık pikselleri filtre, orijinal lifleri temsil eden parçaları geride bırakarak kullanılır. Daha sonra Fiji 'de Iskeletlerinveya bireysel miyosin filemlerin şube uzunlukları incelenmiştir. Uzunluk ölçümleri 0 veya 250 μm ' den fazla, kas germe ile bile bir filament için maksimum makul uzunlukta olan, dışlandı. Tamamen, 2000 arasında 3000 miyozin fiber uzunlukları ölçülmüştür. Segmentasyon iş akışının bir özeti Şekil 3B'de gösterilir. Nicel analiz sonuçları daha fazla vücut duvar kas kusurları görsel skorlama ile karşılaştırıldığında, burada 3 günlük eski hayvanların kusurlu veya değil-arızalı olarak kategorize edildi kas yapısı bütünlüğü dayalı.
Vücut duvarı kas morfolojisinde hatalar 2,5 ila 3,5 kat daha yüksek FZO-1 (cjn020), dyn-1 (KY51) ve UNC-116 (e2310) hayvanların görsel değerlendirme sırasında yaban tipi hayvanlardan daha fazla gözlenen (Şekil 4A). FZO-1 ve UNC-116 mutasyonlar ile çoğu hayvan kas çizmeleri göze çarpan kaybı, büyük Gfp hücresel enkaz birikimi nedeniyle kümülatif ve kas hücreleri içinde şaşkın boşluk sol kas fiber dejenerasyon ( Şekil 2C, E). Bunun aksine, dyn-1 mutantların% 60 ' den fazlası görsel olarak kusurlu bir şekilde puan alırken, diğer iki genetik mutantlara kıyasla kusurların kapsamı minimumdu. Diğer iki mutantlara kıyasla sadece hafif çizgi kaybı, GFP toplamaları ve sadece küçük kas dejenerasyonu vardı (Şekil 2D ve Şekil 4A). Diğer fenotipi skorlama ile olduğu gibi, kusurların kapsamı dikkate alınamadı, ve önyargı eğilimi, arızalar daha yüksek bir oranda kaydedilmesine neden olabilir. Bu nedenle, kas hücre alanı ve fiber uzunluğu nicel ölçümler tek başına görsel değerlendirme daha kas kusurları ölçüde daha doğru bir temsili sağlayacaktır. Görsel skorlama ile gözlenen büyük boşluklar doğrultusunda, Toplam tek hücre alanına Aralık alanı oranı 5 ila 6 kat daha yüksek olarak gösterildi FZO-1 ve UNC-116 mutant hayvanların vahşi tip gruba kıyasla, hangi sadece önemsiz yaşadı kas yapısı arıza (Şekil 4b). Dyn-1 mutantlarda yapısal çöküşün eksikliği kas hücre alanı oranındaki boşluğun önemli olmayan, 3 kat artmasıyla sonuçlandı (Şekil 4b). Bu da deney giriş önyargı nitel değerlendirme tarafından atanan kusurların yüksek oranda katkıda bir faktör olabileceğini gösterir. Bununla birlikte, küçük boşluklar ortalama lif uzunluğunu 24 μm ' den Wild-türünde 22 μm ' den dyn-1 mutantlarda düşürmüştür (Şekil 4c). FZO-1 ve UNC-116 mutantlarda ortalama fiber uzunluğu çok daha kısaydı, bu hayvanların dejenere kas hücrelerinde büyük boşlukların varlığı Ile Ilişkilendirilmiştir (Şekil 2C,E ve Şekil 4c ). Bu sonuçlar, C. elegans20' de CMT2-asscoiated genlerin mutasyona etkilerini inceleyerek son bulgularımız ile tutarlı. Dahası, onlar tek başına görsel Puanlama ile karşılaştırıldığında bu nicel yöntemleri kullanarak kas morfolojisi daha hassas değerlendirme vurgulamak ve FZO-1 ve UNC-116 normal kas morfoloji için gerekli olduğunu kanıtlar sağlar.
SQUASSH nesne segmentasyonu kullanılarak mitokondriyal morfolojinin nicel ölçümleri
Mitokondriyal fisyon yokluğunun C. elegans neurons mitokondriyal morfolojisi nasıl etkilediğini anlamak için, BIZ PLM mekanik duyusal nöronlar nicel analizler yapıldı. DRP-1, memeli Dynamin ile ilgili protein 1 (DRP1) C. elegans ortolog, kontrol mitokondriyal fisyon, hangi aktivasyon üzerinde mitokondri etrafında bir sarmal oluşturmak için sitosol uygulanır, daralma ve sonunda her ikisini de keserek iç ve dış mitokondriyal membranların21, 22. Biz floresan PLM nöronlar bir doku spesifik transgeni ile mitokondri etiketli, kolayca epifluorescence mikroskopisi kullanılarak görselleştirilebilir uzun Akbik bir süreç var. Bir fisyon kaybı genel mitokondriyal dinamikleri bozmak için hipotez ve bu nedenle23tomurcuklanan olarak bilinen bir süreç ile yeni, küçük mitokondri oluşturulmasını azaltmak.
Biz vahşi tip ve DRP-1 Mutant Hayvanlarda mitokondriyal morfoloji karşılaştırmak için SQUASSH segmentasyon gerçekleştirdik. Biz Genotype başına 6 PLM nöronların mitokondri analiz, daha büyük bir n değeri sonuçlanan 200 her biri için mitokondri. Şematik ve temsili görüntüler Şekil 5A, B'de gösterilir. DRP-1 ' i n eksikliği olan mutantların daha büyük ve daha uzun mitokondri (Şekil 5B-F) olduğunu bulduk. DRP-1 mutant arka planında mitokondri% 32 vahşi tip (p = 0,0006, Şekil 5c) daha büyüktür ve% 14 daha uzun (mükemmel bir daire daha) (p < 0,0001, Şekil 5D). Boyut ve şekildeki varyansın daha ayrıntılı bir değerlendirmesi için, verileri Gauss dağılımlarına sığdırmak için her tedbir için histograları çizdik (Şekil 5E, F). Biz her iki boyut ve döngü için, fisyon protein eksik mutantlar daha büyük bir varyans vardı (p < 0,0001 her ikisi için), daha büyük ve daha uzun mitokondri/mitokondrial ağlar varlığı ile vurgulanan bulundu (örnekler için Şekil 5BII bakın ). Genel olarak, biz DRP-1 mutasyonu PLM nöronlar içinde fisyon eksikliği neden olduğunu önermek için kanıt bulundu, daha büyük ve daha uzun mitokondri sonuçlanan. Ayrıca mitokondriyal fisyon bozulması mitokondriyal morfoloji varyans bir artış neden olduğunu göstermiştir.
Şekil 1: PLM nöronlarının sinaps bütünlüğünü ölçmek. (A) görüntüler, PLM sinaptik bölgenin transjenik olmayan bir hayvana maksimum z-projeksiyonlardır. Sol panel tagRFP ile etiketlenmiş PLM nöron gösterir, ikinci panel SNB-1 ile etiketli pre-sinaptik bölge görüntüler:: GFP, üçüncü görüntü sarı temsil Co-yerelleştirme ile bir kaplama, ve dördüncü Panel Kaplama görüntünün bir şematik. (B) MEC-17 ' d a n aşırı ifade edilen hayvanların sinaptik bölgenin maksimum z-projeksiyon konfoksal görüntüleri. Görüntüler panel başına olarak görüntülenir A. (C) ön sinaptik bölgenin ölçü ölçümü, tranjenik olmayan bir bölgede, MEC-17 ' d e k i transgenik hayvanlara kıyasla. (D) SNB-1:: Gfp ' nin göreli entegre floresans düzeylerinin transgenik olmayan bir şekılde, MEC-17 ' d a k i transjenik hayvanlara karşı ölçülmesini. (C) ve (D) için, bireysel sinaps analiz daireler tarafından temsil edilir; n ≥ 10; Ortalama ± Güneydoğu siyah gösterilir. P değerleri * < 0,05, * * < 0,01 eşleştirilmemiş t-testlerinden; ölçek çubukları 2 μm temsil eder. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 2: C. elegans vücut duvar kaslarının görselleştirilmesi. (A) stEx30 ifade eden bir hayvan (pmyo-3:: Gfp:: MYO-3 + rol-6 (su1006)) transgene, hangi etiket miyozin ağır zincir Gfp ile vücut duvar kasları. Dizi Ayrıca vücudun dorsal ve ventral kenarları boyunca düzenlenmiş kas hücrelerinin görselleştirilmesini kolaylaştırır hayvan bir haddeleme fenotipi indükler. (B) vahşi tip, (C) FZO-1 (cjn020), (D) dyn-1 (KY51) ve (E) UNC-116 (e2310) hayvanlarda miyosin liflerinin temsili büyütülmüş görünümler. Tüm hayvanlar 3 günlük yetişkin aşamasında görüntülenmiş. Ölçek çubuğu 60 μm (A) ve 30 μm in (B-E) temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: kullanılabilir Hesaplamalı algoritmalar kullanarak vücut duvar kas alanı ve fiber uzunluğu ölçme. (A) tek bir kas hücresinde (kırmızı-kapalı) iç boşluk boşluğu ve tüm hücrenin (sarı-kapalı) alanı çizilmiş ve kas alanı oranı elde etmek için Fiji hesaplanan nasıl gösteren örnek görüntü. (B) Fiji ve ilastik kombinasyonu kullanarak tek bir örnek görüntü segmentasyon protokolünün anahat. Ölçek çubuğu 30 μm ' yi temsil eder. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 4: vücut duvar kas kusurlarının kalifikasyon ve ölçümü. (A) vücut duvar kas kusurları görsel değerlendirme. (B) WT ve belirtilen mutantlar arasında toplam kas hücresi alanı oranına boş alan alanının karşılaştırılması. (C) miyosin lif uzunluğunun ölçülmesi. (B) ve (C) için, sadece en az bir tam görünür oblik kas hücresi olan görüntüler analiz için dahil edildi. 0 μm veya 250 μm ' den uzun olan lifler de dışlandı. Çubuklar (A) ve ortalama ± S.E.M. (B) ve (C) cinsinden yüzde kusurlu hayvanları temsil eder; n her çubukta listelenen değerler. (A) ' da görsel kusurları karşılaştırmak için yanlış keşif oranı olan Chi-Kare testi, (B) ve (C) içinde nicel ölçümleri analiz etmek için Dunnett 'in birden fazla karşılaştırma için geçici testler ile tek yönlü ANOVA kullanılmasıyla yapıldı. *P < 0,05, * * * *p < 0,0001, NS = önemli değil. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: PLM nöronların akonlarının Içinde mitokondriyal morfoloji. (A) C. eleganskuyruğunda bir posterior lateral MICROTUBÜL (PLM) mechanosensory nöron şematik. Kırmızı kutu, PLM Axon içinde GFP etiketli mitokondri (Pmec-4:: MLS:: Gfp) temsili görüntülerini gösteren (B)vurgulanan bölümlerin yaklaşık konumunu gösterir. Parlak yeşil puan mitokondri gösterir. WT (ı), DRP-1 (tm1108) mutantlar (II) ile karşılaştırıldığında daha büyük, daha uzun mitokondri gösterir. Görseller, genotip başına 6 solucandan n = 6 PLM aksonlar temsilcisidir; ölçek çubukları = 15 μm. (C) 3 günlük eski yetişkin (3DOA) solucanlarının SQUASSH nesne segmentasyonu tarafından nicelleşmiş olarak bireysel mitokondrion ortalama boyutu (μm2). (D) 3doas 'ta SQUASSH nesne ölçümlerinden Niceliklik olarak, PLM Axon içinde bireysel mitokondrion döngülerinin anlamına gelir. (E) mitokondrial boyutunun varyansını gösteren histogram ve Gauss dağılımı. F testi (P < 0,0001) farklılığın DRP-1 ve WT arasında önemli ölçüde farklı olduğunu gösterir. (f) mitokondrial döngüsünün farklılığını gösteren histogram ve Gauss dağılımı. Veri ortalama olarak temsil +/-SEM. * * * p < 0,001, * * * * p < 0.0001 Welch 's t-test; n ≥ 204 n = 6 solucanlar Nicel analiz için Mitochondri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Gerinim adı | Genotip | Kaynak | Başvuru # | ||
| BXN038 | uIs115 (Pmec-17:: tagRFP); jsIs609 (Pmec-4:: MLS:: GFP) | Neumann Laboratuvarı | 7 | ||
| BXN366 | FZO-1 (cjn020); MYO-3 (st386); zdIs5 (Pmec-4:: GFP); stEx30 (pmyo-3:: Gfp:: MYO-3 + rol-6 (su1006)) | Neumann Laboratuvarı | 20 | ||
| BXN419 | DRP-1 (tm1108); jsIs609 (Pmec-4:: MLS:: GFP); uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) | Neumann Laboratuvarı | 7 | ||
| BXN507 | cjnEx036 (Pmec-4:: MEC-17, pmyo-2:: mCherry); jsIs37 (Pmec-7:: SNB-1:: GFP); Lin-15B & Lin-15A (n765); uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) | Neumann Laboratuvarı | 17 | ||
| BXN675 | UNC-116 (e2310); MYO-3 (st386); stEx30 (pmyo-3:: Gfp:: MYO-3 + rol-6 (su1006)) | Neumann Laboratuvarı | 20 | ||
| BXN685 | DYN-1 (KY51); MYO-3 (st386); stEx30 (pmyo-3:: Gfp:: MYO-3 + rol-6 (su1006)) | Neumann Laboratuvarı | 20 | ||
| NM664 | jsIs37 (Pmec-7:: SNB-1:: GFP); Lin-15B & Lin-15A (n765) | Abenorhabditis Genetik Merkezi | 6 | ||
| RW1596 | MYO-3 (st386); stEx30 (pmyo-3:: Gfp:: MYO-3 + rol-6 (su1006)) | Abenorhabditis Genetik Merkezi | 8 | ||
| TU4065 | uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) | Mehmet cancan | 5 | ||
Tablo 1. Bu çalışmada kullanılan C. elegans suşları listesi.
| PLM Axon görüntüleri | |
| Amaç | 40X |
| Görüntü çözünürlüğü (tilescan için panel başına) | 3224 x 3224 |
| Arka plan kaldırma penceresi boyutu | 20 |
| Serkan FUK | 0,78 |
| YUSUF z | 0,68 |
| Düzensizlik | 0,15 |
| GFP minimum floresan yoğunluğu | 0,4 |
Tablo 2 ' ye. Mitokondri segmentasyon için SQUASSH parametreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Morfolojik varyasyonlar sıklıkla fark edilen farklılıklar el ile sayma veya vahşi tip fenotüre kıyasla kusurları belirlemek için rasgele eşikleri kullanarak değerlendirilir. Daha yakın zamanda, ancak, niceliksel Yöntemler, tarafsız bir şekilde hücresel ve subhücresel düzeyde değişiklikleri doğru ölçmek ve açıklamak için morfolojinin karşılaştırmalı çalışmaları için kullanılmıştır. Fenotürleri arasında ince henüz biyolojik olarak alakalı farklar tanımlamak için yeteneği çevresel faktörler veya genetik hastalıkların neden morfoloji değişiklikleri kontrol altta yatan moleküler mekanizmaları anlamak için güçlü bir araç olduğunu. Hesaplama gücü ve mikroskobik görüntüleme çözünürlüğünde sürekli artış, büyüme kolaylığı ve C. elegans genetik çok yönlülük ile birlikte sofistike henüz ücretsiz görüntüleme yazılımı kombinasyonu için mükemmel bir platform sağladı ince detaylı Konfokal görüntüler ile. Burada, biz değerlendirmek ve sinaptik boyutu ve protein yerelleştirme, vücut duvar kas alanı ve lif uzunluğu ve genetik kökenden bir dizi mitokondriyal morfoloji ölçmek için yöntemler göstermiştir.
Bu analizler ince morfolojik farklılıkları ölçmek için bir yetenek göstermiştir iken, sınırlamalar vardır. Bu analizlerin her biri açık kaynak ve kullanıma hazır yazılımları kullansa da, hücresel yapıları ve hücre içi organelleri doğru şekilde çözmek için yüksek kalitede, keskin görüntülere güveniyor. Bu genellikle kısıtlayıcı bir adım olabilir, örneğin gelişmiş dedektörlere sahip Konfokal mikroskoplar gibi hassas High-End ekipman, tatmin edici çözünürlüğe sahip görüntüleri yakalamak için gereklidir. Bunlar her zaman laboratuvarlar için erişilebilir değildir ve alt-par teknolojisi ile analiz yanlış ve tekrarlanabilir sonuçlara yol açabilir. Ayrıca, her teknik bilgisayar algoritmaları kullanarak deneme önyargı azaltmaya hedeflerken, hala insan hatası bir öğe içerebilir adımlar vardır. El ile sinaps manuel tanımı, kas hücresi alanının özetleme, göz ile mitokondriyal segmentasyon parametre optimizasyonları bu konuda geliştirilmiş olabilir tüm alanları vardır. İnsan hatası şansını azaltmak için, çalışmalar kör bir moda yapılabilir veya alternatif görüntü analiz yazılımı ilgi bölgeyi tanımlamak için kullanılabilir. Analiz için istenilen alanın farklı bir dalga boyunda floresans tarafından tanımlanacağı hücre maskeleri kullanmak buna yardımcı olabilir. Bu, bir hücrenin çekirdeği ya da transfekte hücre13,24gibi bir set eşik üzerinde floresan görüntüleyen bir görüntünün bir bölümü için analiz sınırlamak için kullanılır. Ayrıca, tek zaman noktası görüntülerinin kullanımı bu tekniklerin ele alabilir soruları sınırlar. Organel morfolojisi, sinaps oluşumu ve kas yapısını yöneten süreçler büyük olasılıkla dinamiktir ve gelişimsel veya biyolojik durumuna bağlı olarak aynı hücrede farklılıklar görülebilir. Bu yapıların belirli bir son noktada analizi, bu nedenle sınırlama olabilir ve zaman aşımı görüntüleme zaman içinde yapısal değişiklikleri izlemek için yararlı olacaktır. Son olarak, morfolojik değişiklikler hücresel süreçlerde bozulma iyi bir gösterge olabilir, korelasyon her zaman örtülü değildir. Örneğin, farklı türlerin son bulguları mitokondriyal fonksiyon ve form gerçekten7,25Disosiye olabilir göstermiştir. Bu nedenle, morfolojik farklılıkların sonucu olarak işlevsel değişiklikler ortaya çıktığında ek sonuçlar dikkate alınmalıdır.
Bu nicel tekniklerin belirli bir doku ve genetik arka plandaki kullanımını gösterebildik; Ancak, kullanımı daha geniş bir şekilde uygulanabilir. Görüntüleme yazılımı ile floresan ölçümü, farklı Mutant veya hastalık bağlamında, nükleeler ve endozomlar gibi farklı hücrelerde bir dizi veya nöronlar ve epitelyal hücreler gibi farklı yapıları analiz etmek için kullanılabilir. Arka plan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Biz değerli tartışmalar ve giriş için Neumann Laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Bazı suşlar, NıH araştırma altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlandı. Yazarlar C. eleganshakkında bilgi zenginliği Için wormbase teşekkür, ve Monash Micro Imaging kabul, Monash Üniversitesi, enstrümantasyon sağlanması için, eğitim ve teknik destek. Bu çalışma CMTAA araştırma hibe (2015 ve 2018) ve NHMRC proje hibe tarafından desteklenmektedir 1101974 ve 1099690 B.N. verildi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. , (1974).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
- Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
- Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
- Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
- Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
- Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
- Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
- Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
- Teoh, J. -S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
- Bird, T. D. Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , GeneReviews [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2019. [Updated 2016 Apr 14] Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1285/ (1998).
- Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
- Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
- Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
- Zhu, P. -P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
- Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
- Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
- Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).
